Đang tải... (xem toàn văn)
Tài liệu tham khảo chuyên ngành công nghệ sinh học Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của ba giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
1 CHƢƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Bông vải (Gossypium hirsutum.L) trồng lấy sợi quan trọng hàng đầu để thoả mãn nhu cầu thiết người mặc, đồng thời lấy dầu từ hạt quan trọng thứ hai giới sau đậu tương (Nobre ctv, 2001) Cây vải trồng khắp nơi giới Trong nước trồng bơng vải Ấn Độ nước sản xuất vải lớn nhất, đứng đầu diện tích (khoảng 9,7 triệu ha) chiếm 32%, Mỹ chiếm 24% Trung Quốc chiếm 20% diện tích trồng bơng vải tồn cầu (Satyavathi ctv, 2002) Ở Việt Nam nghề trồng bơng vải có từ ngàn xưa loại trồng quan trọng vùng Duyên Hải Trung Bộ thời kỳ kháng chiến chống Pháp Sau năm 1975, nhà nước ta nhiều lần cố gắng tổ chức trồng không thành công giá thị trường bấp bênh khơng phịng trừ sậu đục bơng cách hiệu dẫn đến người trồng thua lỗ, diện tích trồng bơng khơng thể phát triển Trong năm gần đây, áp dụng tiến khoa học công nghệ cho đời giống bơng lai kháng sâu có suất cao để đưa vào sản xuất Tuy nhiên sản lượng xơ đáp ứng phần nhỏ (10 - 15%) nhu cầu nguyên liệu cho ngành dệt may Dự kiến đến năm 2010, sản lượng xơ đáp ứng 20% nhu cầu nước, đưa diện tích trồng bơng tăng lên triệu ha, tập trung vùng Duyên Hải Miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ Đồng Bằng Sông Cửu Long ( Bộ Nông Nghiệp PTNT, 2003) Từ lâu người ta quan tâm nhiều đến việc cải thiện đặc tính di truyền lồi bơng vải Mặc dù có nhiều giống bơng vải tốt tạo theo phương pháp lai tạo chọn lọc truyền thống, dường giống khó khai thác nguồn gen có lợi cách hiệu Việc ứng dụng cơng nghệ di truyền thực vật thúc đẩy việc tạo giống bơng có nhiều đặc tính ưu việt đặc tính nơng học tính kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ tính chống chịu với kiện bất lợi môi trường (rét, khơ hạn, phèn, mặn…) tính trạng số lượng chất lượng sợi (Gasser Fraley, 1992) Trong thập kỷ qua, nổ lực nghiên cứu chuyên sâu tập trung vải gen quy định đặc tính nơng học tốt chuyển nạp phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium (Perlak ctv, 1990; Thomas ctv, 1995; Satyavathi ctv, 2000) Cây vải xem khó chuyển nạp gen sau giống nhóm bơng vải Coker phát đáp ứng tốt cho chuyển nạp gen (Nobre ctv, 2001) gen mong muốn chuyển vào nhóm giống sau hồi giao với giống bơng khác Ngồi giới hạn kiểu gen, số tái sinh từ mơ sẹo có hình thái dị thường biến dị soma cải tiến phương pháp nuôi cấy để tạo hệ thống tái sinh hiệu cần thiết Các phương pháp chọn tạo giống truyền thống kỹ thuật công nghệ sinh học tiến gần (bao gồm quy trình ni cấy mô chuyển nạp gen) ứng dụng vào việc chọn tạo giống vải (Nobre ctv, 2001) Trong chuyển nạp gen trồng, hệ thống lọc biến đổi gen thông dụng sử dụng thuốc kháng sinh thuốc diệt cỏ (Christou, 1997) Việc sử dụng hệ thống chọn lọc gây nhiều lo ngại tính an tồn trồng biến đổi gen người môi trường Nhằm khắc phục vấn đề này, phương pháp chọn lọc thộng qua lọc đường mannose áp dụng Hệ thống lọc dựa enzyme phosphomannose isomerase mã hoá gen pmi phân lập từ vi khuẩn E coli Enzyme đóng vai trị việc chuyển hóa đường mannose làm nguồn carbon cho hoạt động biến dưỡng sinh vật tế bào thực vật biến đổi gen (Hoa Bong, 2003) Hiện Việt Nam, hệ thống tái sinh vải qua mô sẹo chưa thực thành công việc chuyển gen thực vi tiêm vào ống phấn chuyển trực tiếp đỉnh chồi (Lê Trần Bình, 2001) Phương pháp chuyển gen có hiệu biểu gen chuyển nạp khơng hồn tồn, tạo thể khảm gây khó khăn cho việc phân tích thu nhận chuyển gen sau Sự thu nhận chuyển gen tái sinh qua đường sinh phôi thể hệ từ tế bào sinh phôi phương pháp ưu chuộng (Chen ctv, 2000) Cho đến chưa có nghiên cứu thực để tìm hiểu khả chuyển nạp gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens giống vải trồng Việt Nam Vì việc thực đề tài “Nghiên cứu khả chuyển nạp gen ba giống vải Coker 312 VN36P vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ” vấn đề cần thiết 1.2 Mục tiêu khóa luận Tìm hiểu khả chuyển nạp gen hai giống vải Coker 312 VN36P phương pháp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens hệ thống chọn lọc mannose để lọc mô sẹo sau chuyển nạp 1.3 Hạn chế khóa luận Do thời gian thực ngắn nên khóa luận thực xong giai đoạn lọc (qua vịng) mơ sẹo chuyển nạp gen hai giống Coker312 VN36P Giai đoạn thử nghiệm biểu gen thị gus (β-glucuronidase) tạm thời mô sẹo qua lọc chưa có điều kiện thực CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc bơng vải 2.1.1 Vị trí phân loại Cây bơng vải thuộc Ngành hiển hoa bí tử (Angiospermatophyta), Lớp song tử diệp (Dicotyledoneae), Họ Malvaceae, Chi Gossypium (Hộ, 1997) 2.1.2 Tính đa dạng, nguồn gốc phân bố Chi Gossypium đa dạng, có 39 lồi, có lồi trồng phổ biến giới (Hộ, 1997), có lồi trồng Việt Nam: G arboreum, G hirsutum, G barbadense 2.1.2.1 Gossypium arboreum Lồi G arboretum (lồi bơng Cỏ) có nguồn gốc từ châu Á, có mặt gắn liền với nghề trồng nước ta từ lâu Các giống Cỏ có dạng hình thống, thân mảnh, nhỏ, lơng ít, rễ cộc nhỏ với rễ ăn nông, chịu mưa, cuống dài rủ xuống, đầu quay xuống đất, vỏ mỏng, chín sớm, hạn chế tượng thối gặp mưa lúc nở Về phẩm chất xơ Cỏ : thô, tỉ lệ xơ thấp, độ mịn Trong khoảng kỷ XIII – XIV, lồi bơng trồng phổ biến khắp miền đất nước Các giống bơng Cỏ có Việt Nam thuộc loài phụ: G arboreum ssp neglectum G.arboreum ssp nanking (Lê Quang Quyến, 2004) 2.1.2.2 Gossypium hirsutum Lồi Gossypium hirsutum (lồi bơng Luồi) thường hàng năm, cao, to, mặt phẳng Cành khỏe, số lượng nhiều, tròn, mặt nhẵn, trọng lượng hạt bơng trung bình đạt - 6g Loài G hirsutum xuất xứ từ Trung Mỹ, du nhập vào Việt Nam khoảng cuối kỷ XIX đầu kỷ XX Lồi có khả thích ứng rộng, phù hợp với kiện trồng nhờ nước trời nước ta, với tiềm cho suất cao có chất lương xơ tốt, giống dần thay giống Cỏ trước Bơng Luồi trồng nhiều Mỹ, Nga, Ấn Độ, Mêhico, Trung Quốc, Braxin… Bông Luồi có nhiều lồi phụ : G.hirsutum ssp Mexicanum, G.hirsutum ssp punctatum, G.hirsutum ssp panicultum… 2.1.2.3 Gossypium barbadense Loài Gossypium barbadense cịn gọi bơng Hải Đảo, tương đối to, chín muộn, to, khía sâu, màu xanh đậm Thân cành gần khơng có lơng, đài khơng có cưa rõ rệt thường gợn hình sóng Hạt thường nhẵn, khơng có xơ ngắn, xơ dài màu trắng cà phê sữa Loài G barbadense có nguồn gốc từ Nam Mỹ, trồng nhiều Nga, Mỹ, Ai Cập số nước khác Lồi thường gặp dạng bơng lâu năm vườn hoang bờ dậu Bông Hải Đảo thích hợp vụ khơ có tưới, khơng thích hợp với kiện mưa nhiều, độ ẩm cao Bơng Hải Đảo có nhiều lồi phụ như: G barbadense ssp darwinii, G barbadense ssp ruderale, G barbadense ssp ventiforlum Hiện loài nghiên cứu chương trình tạo giống bơng lai bơng Luồi với bơng Hải Đảo nhằm mục đích khai thác khả cho suất cao Luồi kết hợp với chất lượng xơ tốt Hải Đảo 2.1.2.4 Gossypium herbaceum Loài phân bố chủ yếu sa mạc, khí hậu khơ nóng vùng Trung Á, Tây Bắc Trung Quốc, Châu Phi, chưa thấy trồng Việt Nam 2.1.2.5 Gossypium tricuspidatum Loài giống loài G hirsutum, to, chín muộn, xơ dài mịn Lồi địi hỏi đất tốt, nhiều nước, nhiệt độ cao, chống chịu sâu bệnh trồng nhiều Nam Mỹ Lồi bơng khơng có Việt Nam 2.1.3 Tình hình sản xuất bơng vải Việt Nam Trước thời Pháp thuộc, giống vải sử dụng chủ yếu giống Cỏ địa phương (Gossypium arboreum) Giống cho suất thấp Một số diện tích Trung Bộ Nam Bộ trồng giống Luồi (Gossypium hirsutum) nhập nội với suất đạt 300 – 500 kg/ha Đầu kỷ 20, nước ta xuất sang Nhật, Hồng Kông Trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp, diện tích trồng bơng phát triển mạnh, liên khu V đạt khoảng 10000 liên khu IV đạt khoảng 13000 Sau năm 1954, giống Luồi nhập nội thay phần cho giống Cỏ địa phương Sau ngày đất nước thống nhất, xuất phát từ nhu cầu cấp thiết nguyên liệu xơ cho ngành Dệt May, Đảng nhà nước ta có chủ trương đẩy mạnh việc phát triển vùng Duyên hải Miền Trung Tây Nguyên Tuy nhiên việc phát triển theo kế hoạch không thưc do: i Tổ chức sản xuất sở kế hoạch tập trung giao cho Hợp tác xã Nông nghiệp Nông trường quốc doanh, theo chế bao cấp, động, nên không phát huy mạnh nguồn lực toàn dân ii Sâu bệnh gây hại tất vùng trồng bông, mùa khô không đủ nước tưới, dẫn đến người trồng thua lỗ, nơng trường bị giải thể, diện tích bơng khơng thể phát triển iii Chưa có giống bơng phù hợp với kiện sinh thái kháng sâu bệnh Chưa có hệ thống sở hạ tầng cho việc phát triển bông, hệ thống thuỷ lợi đồng ( Lê Kim Hỷ, 2003; Lê Quang Quyến, 2004.) Sau năm 1990, Nhà nước ta chủ trương phát triển dựa vào hộ nông dân, sản xuất chuyển hướng từ tập trung sang phân tán kiện mùa mưa nhờ nước tưới trời nhằm giảm áp lực sâu hại, diện tích bơng nhanh chóng mở rộng suất nâng lên bình quân khoảng 7- tạ/ha (Lê Kim Hỷ, 2003; Lê Quang Quyến, 2004) Từ sau năm 1990, ngành Việt Nam có bước thay đổi mạnh mẽ, tạo giống bông, đặc biệt giống bơng lai có suất cao, chất lượng xơ tốt, chống chịu sâu bệnh Hàng loạt tiến kỹ thuật áp dụng như: áp dụng biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp giúp giảm chi phí thuốc bảo vệ thực vật, biện pháp kỹ thuật canh tác khác hệ thống luân canh xen canh hợp lý, phủ màng PE cho bông, phun chất hịa tăng trưởng… mà suất chất lượng xơ tăng, nghề sản xuất cho hiệu kinh tế cao Hiện nay, diện tích đạt 35000 ha, suất đạt 11 tạ/ha, tăng gấp hai lần so với bình quân trước (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Diễn biến tình hình sản xuất bơng Việt Nam năm qua (Nguồn: Lê Quang Quyến, 2004) Niên Vụ Diện tích (ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (tấn) 1996/1997 10676 6866 1997/1998 11716 10986 1998/1999 19963 16245 1999/2000 17705 10 17578 2000/2001 13250 20340 2001/2002 29573 11 32530 2002/2003 35200 10,5 36960 2.1.4 Tình hình sản xuất giới Vụ 2001- 2002 tổng diện tích bơng giới 33,457 triệu ha, nước phát triển chiếm 70% diện tích nước phát triển chiếm có 30% diện tích Trong mười nước có diện tích trồng bơng lớn giới (Bảng 2.2), Ấn Độ dẫn đầu với diện tích 8,7 triệu ha, Mỹ 5,6 triệu ha, Trung Quốc 4,8 triệu Pakistan 3,1 triệu (ISAAA, 2002) Sản lượng giới tăng từ 9,8 triệu niên vụ 1960/1961 lên 21,2 triệu niên vụ 2001/2002 Trong mười nước có sản lượng bơng lớn giới (bảng 2.3) Trung Quốc dẫn đầu với 5,3 triệu tấn, Mỹ 4,4 triệu tấn, Ấn Độ 2,5 triệu Điều đặc biệt mười nước có sản lượng bơng cao giới có sáu nước nước phát triển Về suất Australia dẫn đầu với suất 1658 kg xơ/ha, Syria 1303 kg xơ/ha Trung Quốc 1103 kg xơ/ha (ISAAA, 2002) Trong đó, diện tích trồng bơng chuyển gen giới ngày gia tăng Diện tích trồng bơng giới năm 2004 32 triệu ha, chuyển gen chiếm 28% So với năm 2003 diện tích bơng chuyển gen tăng 11% (9 triệu năm 2004 so với 7,2 triệu năm 2003) Trong số nước trồng chuyển gen, Ấn Độ nước có diện tích trồng bơng chuyển gen tăng nhanh giới (tăng 400% so với năm 2003) Năm 2003, Ấn Độ có 100 ngàn bơng chuyển gen năm 2004 diện tích bơng chuyển gen tăng lên 500 ngàn Trung Quốc nước có gia tăng diện tích trồng bơng chuyển gen đáng ý: năm 2003 có 2,8 triệu năm 2004 tăng lên 3,7 triệu (chiếm 60% diện tích bơng) Theo dự báo chun gia diện tích trồng bơng chuyển gen giới tiếp tục gia tăng năm tới hướng chuyển gen vào tập trung vào việc tạo giống kháng sâu bệnh chủ yếu (James, 2004) Bảng 2.2 Mười nước có diện tích trồng bơng lớn giới năm 2001- 2002 (ISAAA, 2002) Quốc gia STT Triệu Ấn Độ 8,730 Mỹ 5,596 Trung Quốc 4,824 Pakistan 3,125 Uzbekistan 1,453 Brazil 0,750 Thổ Nhĩ Kỳ 0,654 Turkmenistan 0,550 Mali 0,516 10 Benin 0,415 TỔNG CỘNG 26,613 Diện tích trồng bơng giới Nguồn: ICAC, 2002 (http://www.isaaa.org/) 33,457 Bảng 2.3 Mười nước có sản lượng bơng cao giới năm 2001 – 2002 (ISAAA, 2002) Quốc gia STT Sản lượng Năng suất xơ (triệu tấn) (Kg/ha) Trung Quốc 5,320 1103 Mỹ 4,420 790 Ấn Độ 2,508 287 Pakistan 1,853 593 Uzbekistan 1,055 726 Thổ Nhĩ Kỳ 0,880 1345 Brazil 0,750 999 Úc 0,670 1658 Syria 0,335 1303 10 Ai Cập 0,314 944 18,105 980 Tổng Cộng Các quốc gia khác Sản lượng toàn giới 3,132 21,237 635 Nguồn: ICAC, 2002 2.2 Một số nghiên cứu chuyển nạp gen bơng vải Hiện có nhiều phương pháp chuyển nạp gen khác phổ biến chuyển nạp gen trực tiếp súng bắn gen với vật liệu nuôi cấy đỉnh chồi phân sinh từ tế bào huyền phù (McCabe Martinell, 1993; Rajasekaran ctv, 2000), phương pháp chuyển nạp gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens (Umbeck ctv, 1987; Rajasekaran ctv, 1996; Satyavathi ctv, 2002) Chuyển nạp gen nhờ Agrobacterium tumefaciens vải thành công công bố lần vào năm 1980 (Firoozabady ctv, 1987; Umbeck ctv, 1987) với mẫu cấy trụ hạ diệp tử diệp Từ nhiều gen chuyển thành công vào nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, bao gồm gen kháng côn trùng gen kháng thuốc diệt cỏ (Perlak ctv, 1990; Chen ctv, 1994) Các loại mẫu cấy trụ hạ diệp, tử diệp, mô sẹo từ trụ hạ diệp tử diệp phôi non dùng việc chuyển 10 gen nhờ Agrobacterium tumefaciens hay nhờ súng bắn gen (Firoozabady ctv, 1987; Perlak ctv, 1990) Ngoài cịn có mơ phân sinh phân lập từ trục phôi sử dụng cho việc chuyển gen súng bắn gen vải (Chlan ctv, 1995) Tuy nhiên tỉ lệ chuyển gen thường thấp, khoảng 20 - 30% trụ hạ diệp dùng làm mẫu cấy (Firoozabady ctv, 1987; Rajasekaran ctv, 1996) Một hiệu chuyển gen cao có ý nghĩa (đến 60%) công bố trụ hạ diệp dùng làm mẫu cấy gen onc (mã hóa cho enzyme tổng hợp octopin-octopin synthase) dùng làm gen thị (Firoozabady ctv, 1987) Nhưng kết thử nghiệm biểu gen tạm thời gen onc Một báo cáo gần cho hiệu chuyển nạp gen song tử diệp khoảng 20 -30% (Cousins ctv,1991), hiệu chuyển nạp gen chí cịn thấp sử dụng phương pháp bắn gen (Keller ctv, 1997 Sự khác biệt loại mẫu cấy dùng chuyển nạp gen ảnh hưởng có ý nghĩa đến hiệu chuyển nạp gen tái sinh, số nhà nghiên cứu cho để giảm thiểu thể chuyển nạp gen dương tính giả, tử diệp mẫu cấy tốt trụ hạ diệp (Firoozabady ctv, 1987) Sunilkumar Rathore (2001) nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển nạp gen vải vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho thấy yếu tố chủng vi khuẩn, acetosyringone nhiệt độ chuyển gen có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu chuyển gen Thêm vào kích thước mẫu cấy ảnh hưởng đến sống sót mẫu cấy môi trường chọn lọc (Sunilkumar Rathore, 2001) Sự chuyển nạp gen phụ thuộc vào kiểu gen Chỉ có số giống định có khả tái sinh chuyển nạp giống Luồi Coker 312 Jin 7, hầu hết giống khác thường khó tái sinh chuyển nạp Thiếu phương pháp tái sinh hiệu xem rào cản cho việc áp dụng phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens vải (Firoobady ctv, 1987) Để cải tiến phương pháp chuyển nạp, quy trình chuyển gen hiệu cao dùng cuống trụ hạ diệp mầm làm mẫu cấy phát triển, với môi trường ni cấy cải tiến thích hợp Hiện nay, Trung Quốc thành công việc chuyển nạp gen vào vải phương pháp tiêm DNA qua ống phấn, phương pháp gặp khó khăn việc xác định chuyển gen nhiều tạo thành số chuyển nạp gen (Chen ctv, 2000) ... nghiên cứu thực để tìm hiểu khả chuyển nạp gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens giống vải trồng Vi? ??t Nam Vì vi? ??c thực đề tài ? ?Nghiên cứu khả chuyển nạp gen ba giống vải Coker 312 VN36P vi khuẩn. .. PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu khả chuyển nạp gen hai giống vải Coker 312 VN36P vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, sử dụng plasmid pManCa (Hoa Bong, 2003) mang gen pmi gen. .. Agrobacterium tumefaciens để đưa gen mong muốn vào gen trồng Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen gọi phương pháp chuyển nạp gen gián tiếp 2.3.1 Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium
