Đang tải... (xem toàn văn)
Khảo sát hoạt tính hệ enzyme amylase từ 3 chủng trichoderma
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***OOO*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH HỆ ENZYME AMYLASE TỪ 3 CHỦNG TRICHODERMA NGÀNH HỌC: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2002-2006 SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN NHƢ HIẾN Thành phố Hồ Chí Minh tháng 8/2006 2 LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm tạ: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng. Ths. Vƣơng thị Việt Hoa đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Cô Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận và thực hiện đề tài. Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Ban chủ nhiệm, Thầy Cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm. Các Anh Chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Các bạn bè của lớp công nghệ sinh học khóa 28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Các bạn bè ngoài lớp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp. Sinh viên thực hiện Nguyễn nhƣ Hiến 3 TÓM TẮT Đề tài “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH HỆ ENZYME AMYLASE TỪ 3 CHỦNG TRICHODERMA” thực hiện bởi sinh viên Nguyễn nhƣ Hiến, lớp DH02SH-Khoa CNSH-Trƣờng Đại Học Nông Lâm dƣới sự hƣớng dẫn bởi Th.s Vƣơng Thị Việt Hoa. Thời gian và địa điểm: Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2006 đến tháng 6/2006, Tại Phòng Vi Sinh - khoa Công Nghệ Thực Phẩm - trƣờng Đại Học Nông Lâm. Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng vi nấm Trichoderm. sp gồm 3 chủng D13, D14, D16. Chúng là vi nấm phân bố rộng rãi trong đất, có nhiều hệ enzyme (cellulase, amylase…). Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát và đánh giá hoạt lực hệ enzyme amylase của các chủng này (đƣợc cung cấp bởi phòng thí nghiệm trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên), để từ đó bổ sung vào các ứng dụng: công nghệ thực phẩm, công nghệ dệt, xử lý môi trƣờng…đáng chú ý là trong lĩnh vực bổ sung vào trong thức ăn gia súc và các dạng phân bón sinh học. Những kết quả đạt đƣợc. Chọn ra đƣợc chủng Trichoderma có hoạt tính hệ enzyme amylase phân giải cao. Khảo sát đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến hệ enzyme amylase tách chiết từ môi trƣờng nuôi cấy (thời gian, nhiệt độ, pH). 4 MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ . 2 Tóm tắt . 3 Mục lục . 4 Danh sách các hình 6 . Danh sách các bảng 7 Danh sách các biểu đồ 8 I. MỞ ĐẦU. . 9 II. Tổng quan tài liệu. 10 2.1. Giới thiệu về tinh bột 10 2.2. Quá trình thuỷ phân tinh bột. 10 2.3. Giới thiệu về nấm Trichoderma 17 2.3.1. Phân loại-Đặc điểm về hình thái. 17 2.3.2. Đặc điểm về sinh lý, sinh hoá. . 18 III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP . 19 3.1. Vật liệu . 19 3.2. Phƣơng pháp. 21 3.2.1. Phƣơng pháp định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase bằng cách đo đƣờng kính vòng phân giải 21 3.2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy Trichoderma và tách chiết hệ enzyme amylase từ môi trƣờng nuôi cấy. 22 3.2.3. Phƣơng pháp khảo sát động học hệ enzyme amylase . 22 3.2.4. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của pH đối vối enzyme amylase. 23 3.2.5. Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối vối enzyme amylase . 24 3.2.6. Phƣơng phàp xác định hoạt tính hệ enzyme amylase.( Phƣơng pháp Heinkel ). 24 5 IV. KẾT QUẢ 28 4.1. Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. . 28 4.2. Kết quả định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase bằng cách đo đƣờng kính vòng phân giải. . 29 4.3. Kết quả khảo sát động học enzyme amylase. . 31 4.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với enzyme amylase trên chủng D13 39 4.5. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đối với enzyme amylase trên chủng D13. . 41 V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 45 6 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc bậc 3 của Enzyme Amylase. 14 Hình 2.2. Quá trình thủy phân Amylose 15 Hình 2.3. Quá trình thủy phân Amylopectin và Glycogen 16 Hình 2.4. Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma. 18 Hình 2.5. Trichoderma harzianum KRL – AG2 phát triển trên môi trƣờng PGA 18 7 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1. Dung dịch đệm Mc Hvaice. 23 Bảng 3.2. Các dung dịch đệm pH 3 – 6,5. . 23 Bảng 3.3. Bảng xác định hoạt tính enzyme amylase . 26 Bảng 3.4. Nồng độ dung dịch tinh bột . 26 Bảng 3.5. Các dung dịch của đồ thị tiêu chuẩn. 27 Bảng 4.1. Kết quả đếm số lƣợng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu . 28 Bảng 4.2. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 66 giờ. 29 Bảng 4.3. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 84 giờ. 30 Bảng 4.4. Kết quả đo OD của đồ thị tiêu chuẩn. . 31 Bảng 4.5. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy . 32 Bảng 4.6. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy. 34 Bảng 4.7. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy . 36 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với Enzyme Amylase của chủng D13 39 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của pH đối với Enzyme Amylase của chủng D13. . 41 8 DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 66 giờ. . 29 Đồ thị 4.2. Kết quả đo đƣờng kính vòng phân giải sau 84 giờ. . 30 Đồ thị 4.3. Đƣờng chuẩn. 31 Đồ thị 4.4. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy. 33 Đồ thị 4.5. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy. 35 Đồ thị 4.6. Hoạt độ Enzyme Amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy. 37 Đồ thị 4.7. Hoạt độ Enzyme Amylase của 3 chủng D13, D14, D16. . 38 Đồ thị 4.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với Enzyme Amylase của chủng D13. . 40 Đồ thị 4.9. Ảnh hƣởng của pH đối với Enzyme Amylase của chủng D13. 42 9 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Do áp lực kinh tế, việc tận dụng hiệu quả hơn nguồn thức ăn có hàm lƣợng dinh dƣỡng thấp cho gia cầm ngày càng gia tăng. Mặt khác, các quy định trong sản xuất thức ăn gia súc không cho phép sử dụng bất kỳ hoá chất hay thuốc khích thích nhằm tăng trƣởng gia súc, nâng cao năng suất vật nuôi. Một phƣơng pháp phổ biến đang đƣợc khuyến khích sử dụng rộng rãi để giải quyết vấn đề này là bổ sung các hệ enzyme thủy phân vào thức ăn gia súc nhằm tăng cƣờng sự tiêu hoá và hấp thu các chất dinh dƣỡng khó tiêu, hoặc loại bỏ các nhân tố kháng dinh dƣỡng . Một trong những nguồn enzyme đáng chú ý là hệ enzyme từ vi nấm Trichoderma. sp vi nấm này có nguồn enzyme phong phú, có hoạt lực mạnh và đƣợc sử dụng nhiều mục đích khác nhau, chúng đƣợc ứng dụng trong các lĩnh vực nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, xử lý môi trƣờng… đáng chú ý là trong lĩnh vực bổ sung vào thức ăn gia súc và các dạng phân bón sinh học. Enzyme amylase là một enzym thủy phân tinh bột thông qua việc xúc tác thủy giải liên kết glucosid trong tinh bột. Enzyme amylase cũng đã đƣợc nghiên cứu và khảo sát một cách có hệ thống về các đặc điểm và cũng đƣợc phân lập và tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ: từ thực vật ( từ mầm mạch, mầm đậu tƣơng …), từ vi sinh vật (vi khuẩn Bacillus subtilis, nấm Aspegillus oryzae …). Góp phần vào định hƣớng nêu trên, đƣợc sự ủng hộ của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và khoa Công Nghệ Thực Phẩm chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát hoạt tính hệ enzyme amylase từ 3 chủng nấm Trichoderma. sp” 1.2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI. 1. Chọn chủng Trichoderma sp. có hoạt tính hệ enzym amylase phân giải cao 2. Khảo sát hoạt tính hệ enzym amylase tách chiết từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma. 10 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về tinh bột Tinh bột là sản phẩm quang hợp của thực vật, là chất dự trữ quan trọng tích lũy trong cũ, quả, hạt( lúa: 60-80%; ngô: 65-75%; khoai tây: 12-20% …) Trong thực vật tinh bột tồn tại dƣới dạng hạt tinh bột, đƣờng kính 0,002-0,15 mm. Các loại thực vật khác nhau chứa các hạt tinh bột có hình dạng và kích thƣớc khác nhau. Tinh bột đƣợc tổng hợp ở thực vật gồm 2 thành phần chủ yếu: Amylose - polysaccharide tan trong nƣớc, cho phản ứng màu xanh với Iod. Amylose có cấu tạo hoá học là chuỗi dài không phân nhánh của gốc α – D - glucopyranose nối với nhau bằng lien kết α -1,4 glycoside. Phân tử Amylose có trọng lƣợng khoảng 20000 - 50000, có dạng hình xoắn mỗi vòng chứa 6 phân tử glucose. Amylopectin là polymer mạch nhánh chứa các đơn vị đƣờng đơn nối với nhau bằng lien kết α -1,4 glycoside và α -1,6 glycoside . Amylopectin cho màu tím đỏ với Iod. Trọng lƣợng phân tử thƣờng là vài triệu. Đa số các dạng tinh bột chứa từ 15 - 25% Amylose và 75 - 85% Amylopectin. 2.2. Quá trình thủy phân tinh bột 2.2.1. Giới thiệu về enzyme Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất là protein. Nó cho phép các phản ứng cần thiết cho sự sống và sự sinh sản của tế bào diễn ra với tốc độ cao và với tính chất đặc thù là không tạo ra các sản phẩm phụ nhƣ ở các phản ứng thông thƣờng. Enzyme có trong tế bào của mọi sinh vật, không chỉ xúc tác cho các phản ứng trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào( invitro). a) Tính chất hóa - lý. do enzyme có bản chất là protein nên chúng cũng có những tính chất nhƣ các protein. Khi hòa tan trong nƣớc, enzyme cho một dung dịch keo với những tính chất đặc trƣng nhƣ khuếch tán kém, áp suất thẩn thấu thấp, độ nhớt cao… Enzyme có tính lƣỡng cực. [...]... hóa trị với tâm hoạt động và làm mất hoàn toàn hoạt tính enzyme do đó chúng đƣợc gọi là chất ức chế tự sát (suicide inhibitor) 2.2.2 Giới thiệu về Enzyme amylase Enzyme amylase là nhóm enzyme phân giải tinh bột (carbohydrate) Enzyme amylase bao gồm: α -amylase, β- amylase, R -Enzyme (α-1,6-glycosidase), Amyloglycosidase… Tùy theo nguồn gốc mà mỗi loại enzyme có trọng lƣợng phân tử, hoạt tính, điều kiện... Từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến 40 giờ, hoạt tính enzyme tăng chậm Từ 48 giờ, hoạt tính enzyme tăng nhanh và đạt cực đại vào 72 giờ Sau đó hoạt tính enzyme bắt đầu giảm 36 4.3.3 Hoạt độ enzyme amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy Bảng 4.7 Hoạt độ enzyme amylase của chủng D16 theo thời gian nuôi cấy ΔOD SỐ mg TINH BỘT BỊ PHÂN GIẢI ĐỘ PHA LOÃNG HOẠT ĐỘ (UI/mg) HOẠT ĐỘ (UI/g) 100 0,022 0,43 10 43... đƣợc xác định ở mục trên Sử dụng dịch chiết enzyme thô để khảo sát ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính enzyme Cân 10g canh trƣờng, thêm vào 100ml dung dịch đệm có pH cần khảo sát Dựng đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hoạt tính enzyme đối với pH Suy ra pH tối ƣu (pHop) của enzyme 3.2.5 Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với họat tính của enzyme Chuẩn bị canh trƣờng nuôi cấy Trichoderma,... đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút Thu lấy dịch ly tâm, định mức tới 100ml, sử dụng nhƣ dịch enzyme thô 3.2.3 Phƣơng pháp khảo sát động học hệ enzyme amylase: Sử dụng chủng Trichoderma có hoạt tính cao, tiến hành nuôi cấy trong môi trƣờng bán rắn Khảo sát sự biến đổi hoạt tính của hệ enzyme amylase thủy phân chủ yếu theo thời gian nuôi cấy : 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h Tại mỗi thời điểm... nuôi cấy đến 40 giờ, hoạt tính enzyme tăng chậm Từ 48 giờ, hoạt tính enzyme tăng nhanh và đạt cực đại vào 60 giờ Sau đó hoạt tính enzyme bắt đầu giảm Giải thích: Từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến 40 giờ, hoạt tính enzyme tăng chậm là do vi nấm sử các chất dinh dƣỡng hòa tan, dễ hấp thụ có sẵn trong môi trƣờng Sau khi các chất dinh dƣỡng dần cạn kiệt thì buộc vi nấm phải sản xuất hệ enzyme ( tƣơng ứng trên... 121 oC trong 45 phút 21 3.2 Phƣơng pháp 3.2.1 Phƣơng pháp định tính và sơ bộ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase bằng cách đo đƣờng kính vòng phân giải Chọn ra một chủng cho hoạt tính enzyme amylase cao để tiếp tục khảo sát động học và các yếu tố ảnh hƣởng Cách tiến hành : Chuẩn bị các môi trƣờng cảm ứng của các hệ enzym cần định hoạt tính và sơ bộ định lƣợng +Chuẩn bị môi trƣờng Zapeck (0,5% tinh... những chất đơn giản, tiêu hóa đƣợc do đó làm cho hoạt tính enzyme tăng lên Sau khi các chất dinh dƣỡng trong môi trƣớng bị thủy phân dần dần cạn kiệt dẫn đến hoạt tính enzyme giảm 34 4.3.2 Hoạt độ enzyme amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy Bảng 4.6 Hoạt độ enzyme amylase của chủng D14 theo thời gian nuôi cấy THỜI GIAN (giờ) THỂ TÍCH DỊCH ENZYME ΔOD SỐ mg TINH BỘT BỊ PHÂN GIẢI 24 100 0,04... enzyme thô để khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với họat tính của enzyme : cân 10g canh trƣờng, thêm vào 100ml dung dịch đệm có pH tối ƣu đã đƣợc xác định Xác định hoạt tính của enzyme ở các nhiệt độ : 30 oC, 40 oC, 50 oC, 60 oC, 70 oC, 80oC Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hoạt tính enzyme đối với nhiệt độ nuôi cấy, suy ra nhiệt độ tối ƣu ( top ) của enzyme 3.2.6 Phƣơng pháp xác định hoạt. .. quá trình nuôi cấy, thu dịch enzyme thô theo thời gian 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, và 84h tiến hành xác định hoạt tính enzyme theo phƣơng pháp ở mục III.4 kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 4.3.1 Hoạt độ enzyme amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy Bảng 4.5 Hoạt độ enzyme amylase của chủng D13 theo thời gian nuôi cấy ΔOD SỐ mg TINH BỘT BỊ PHÂN GIẢI ĐỘ PHA LOÃNG HOẠT ĐỘ (UI/mg) HOẠT ĐỘ (UI/g) 100 0,028 0,55...11 Mỗi enzyme có một điểm đẳng điện tại điểm này, chúng có độ hòa tan thấp nhất Enzyme không chịu đƣợc nhiệt độ cao, dễ bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác Enzyme cũng bị phá hủy bởi các tác nhân phá hủy protein nhƣ các enzyme tiêu hóa( pepsin, tripsin…) b) Các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme Vận tốc ban đầu của phản ứng Nếu khảo sát lƣợng cơ chất đƣợc biến . ra đƣợc chủng Trichoderma có hoạt tính hệ enzyme amylase phân giải cao. Khảo sát đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến hệ enzyme amylase tách chiết từ môi trƣờng. TÀI. 1. Chọn chủng Trichoderma sp. có hoạt tính hệ enzym amylase phân giải cao 2. Khảo sát hoạt tính hệ enzym amylase tách chiết từ môi trƣờng nuôi cấy
