Đang tải... (xem toàn văn)
Xây dựng cơ sở dữ liệu hai gene 16s và 23s ribosom rna ở vi khuẩn, ứng dụng cơ sở dữ liệu hai gene 16s và 23s ribosom rna ở vi khuẩn để phát hiện các tác nhân gây bệnh viêm màng não mủ
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** LÊ VĂN TÁM XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN – ỨNG DỤNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ (Bacterial Meningitis) Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh -2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN – ỨNG DỤNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ (Bacterial Meningitis) Luận văn Kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. TRẦN THỊ DUNG LÊ VĂN TÁM LƢU PHÚC LỢI Thành phố Hồ Chí Minh -2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ************ CONSTRUCT DATABASE OF 16S AND 23S RIBOSAMAL RNA GENE IN BACTERIA – APPLICATION THE DATABASE FOR DETECTION BACTERIAL MENINGITIS Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student Ph.D. TRAN THI DUNG LE VAN TAM LUU PHUC LOI Ho Chi Minh City -2006- iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. TS. Trần Thị Dung và Cử Nhân Lƣu Phúc Lợi đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp. Xin gởi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã động viên, giúp đỡ và luôn ở bên cạnh tôi trong những lúc vui buồn. Cha mẹ kính yêu đã nuôi nấng, dạy dỗ và động viên để con có thể đạt đƣợc thành quả nhƣ ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2006 Sinh viên LÊ VĂN TÁM iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN LÊ VĂN TÁM, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN – ỨNG DỤNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ (Bacterial Meningitidis)” Hội đồng hƣớng dẫn: – TS. Trần Thị Dung – Cử nhân Lƣu Phúc Lợi Khóa luận đƣợc thực hiện tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, từ tháng 1/2006 đến 8/2006. Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, một số lƣợng lớn các gene 16S và 23S rRNA đã đƣợc giải trình tự. Những trình tự gene này đƣợc lƣu trữ trong CSDL sinh học lớn nhƣ NCBI, EMBL, DDBj…Vì các CSDL này quá lớn và chứa rất nhiều thông tin khác nhau, không tập trung cho một đối tƣợng cụ thể nên khó có thể thực hiện việc truy xuất các thông tin phục vụ trực tiếp cho một nghiên cứu chuyên biệt. Do vậy, mục tiêu của đề tài là tiến hành xây dựng cơ sở dữ liệu hai gene 16S và 23S rRNA ở vi khuẩn và ứng dụng CSDL này để phát hiện các loài vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ. Để đạt đƣợc mục tiêu trên, khóa luận cần đảm bảo thực hiện những nội dung nhƣ sau: Dùng Perl script để thu nhận các mẫu tin của hai gene từ trang CSDL GenBank (CSDL nucleotide của NCBI). Tiếp tục sử dụng Perl script tách các mẫu tin thu nhận đƣợc thành từng phần riêng biệt nhƣ accession number (mã số truy cập), gi, definition, sequence (trình tự của gene)… Thiết kế CSDL dựa vào mô hình dữ liệu quan hệ. Dùng Perl script để chuyển tự động các thông tin tách đƣợc ở bƣớc trên vào CSDL. Sử dụng giao thức CGI kết hợp với ngôn ngữ lập trình Perl để thiết kế trang web CSDL về hai gene 16S và 23S rRNA ở các loài vi khuẩn. v Sử dụng trình tự của hai gene 16S và 23S rRNA trong CSDL để thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát hiện và phân biệt các tác nhân gây bệnh viêm màng não mủ. Đề tài đã đạt đƣợc những kết quả nhƣ sau: Đã thu thập đƣợc 2825 mẫu tin về gene 16S rRNA và 305 mẫu tin về gene 23S rRNA từ cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI). Tạo đƣợc CSDL của hai gene 16S và 23S rRNA tích hợp với web. Trang web CSDL của hai gene và gồm có 5 trang chính: HOME, SEARCH, TOOL, LINK, ABOUT. Từ các trang web này, ngƣời sử dụng có thể truy xuất thông tin, tìm kiếm trình tự, so sánh một trình tự quan tâm với các trình tự trong CSDL (alignment, BLAST)… Ngoài ra, những trang web chính này còn kết nối đến những trang phụ khác để cung cấp các tiện ích cho ngƣời dùng. Thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát hiện các tác nhân gây bệnh viêm màng não mủ bằng chƣơng trình thiết kế mồi Primrose. vi MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN . iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN iv MỤC LỤC . vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ x DANH SÁCH CÁC HÌNH . xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xiii PHẦN 1: MỞ ĐẦU .1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ . 1 1.2. MỤC ĐÍCH . 2 1.3. YÊU CẦU 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. SƠ LƢỢC VỀ CƠ SỞ DỮ LIỆU 3 2.1.1. Định nghĩa 3 2.1.2. Hệ quản trị CSDL (Database Management System – DBMS) . 3 2.1.3. Các mô hình dữ liệu . 3 2.2. NGÔN NGỮ LẬP TRÌNH PERL, MẠNG INTERNET VÀ WEB . 3 2.2.1. Perl . 3 2.2.1.1. Tóm tắt lịch sử phát triển . 3 2.2.1.2. Ứng dụng 4 2.2.1.3. Một số module của Perl thƣờng đƣợc sử dụng 4 2.2.2. Giới thiệu về mạng Internet . 5 2.2.3. Tích hợp CSDL với web dùng CGI 5 2.3. CƠ SỞ DỮ LIỆU SINH HỌC . 6 2.3.1. NCBI (National Center for Bioinformatic Information) . 6 2.3.1.1. Vài nét về NCBI 6 2.3.1.2. Một số cơ sở dữ liệu trong NCBI 7 2.3.1.3. Một số công cụ trong NCBI . 7 2.3.2. EBI (European Bioinformatics Institute) . 8 vii 2.3.2.1. Vài nét về EBI . 8 2.3.2.2. Một số cơ sở dữ liệu trong EBI . 8 2.3.2.3. Một số công cụ hỗ trợ phân tích trình tự sinh học . 9 2.3.3. SIB (Swiss Institute of Bioinformatics) . 9 2.3.4. DDBJ (DNA Data Bank Japan) và PDBj (Protein Database Japan) . 10 2.4. BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 12 2.4.1. Sơ lƣợc về bệnh viêm màng não mủ . 12 2.4.1.1. Định nghĩa . 12 2.4.1.2. Bệnh theo lứa tuổi 12 2.4.1.3. Các con đƣờng xâm nhiễm của vi khuẩn gây bệnh 13 2.4.2. Các triệu chứng biểu hiện lâm sàng của bệnh . 13 2.4.2.1. Những triệu chứng giai đoạn khởi phát 13 2.4.2.2. Biểu hiện lâm sàng của viêm màng não mủ . 13 2.4.3. Hậu quả của bệnh trên những đối tƣợng bị lây nhiễm 15 2.4.4. Tình hình bệnh viêm màng não mủ trên thế giới và Việt Nam . 15 2.5. VI KHUẨN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 16 2.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 18 2.6.1. Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng . 18 2.6.2. Phƣơng pháp xét nghiệm vi khuẩn học . 18 2.6.3. Phƣơng pháp miễn dịch học 19 2.6.4. Phƣơng pháp tế bào học . 19 2.6.5. Phƣơng pháp sinh hoá . 19 2.6.5.1. Đƣờng trong dịch não tủy 19 2.6.5.2. Đạm trong dịch não tủy 19 2.6.5.3. Phƣơng pháp khảo sát nồng độ lactate . 20 2.6.6. Phƣơng pháp chụp cắt lớp – CT (computer tomography) . 20 2.6.7. Phƣơng pháp xét nghiệm dựa vào kỹ thuật PCR . 20 2.7. KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ . 20 2.7.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR . 20 2.7.2. Quy trình của phản ứng PCR 21 2.7.3. Seminested PCR/ Multiplex PCR . 22 viii 2.7.3.1. Seminested PCR . 22 2.7.3.2. Multiplex PCR 22 2.7.4. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ. . 22 2.8. GENE 16S rRNA VÀ 23S rRNA 24 2.8.1. RNA ribosome (rRNA) – Cấu trúc ribosome 24 2.8.2. Gene 16S rRNA thƣớc đo tiến hóa 25 2.8.3. Gene 23S rRNA . 28 2.9. ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ BẰNG KHÁNG SINH . 28 PHẦN 3: PHƢƠNG PHÁP VÀ CÁC CHƢƠNG TRÌNH SỬ DỤNG 29 3.1. CÁC CHƢƠNG TRÌNH VÀ NGÔN NGỮ LẬP TRÌNH ĐƢỢC SỬ DỤNG 29 3.1.1. Hệ điều hành 29 3.1.2. Các chƣơng trình phân tích trình tự . 29 3.1.2.1. Chƣơng trình so sánh trình tự ClustalW 29 3.1.2.2. Chƣơng trình tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng – BLAST . 30 3.1.3. Hệ quản trị CSDL quan hệ MySQL 30 3.1.4. Apache web server . 31 3.1.5. Ngôn ngữ lập trình Perl và các gói sử dụng . 31 3.1.6. Chƣơng trình thiết kế mồi Primrose 2.17 . 32 3.2. PHƢƠNG PHÁP 33 3.2.1. Thu nhận các mẫu tin chứa trình tự và thông tin liên quan của hai gene 16S và 23S rRNA . 33 3.2.3. Thiết kế CSDL gene 16S và 23S rRNA 38 3.2.3.1. Phân tích dữ liệu 38 3.2.3.2. Thiết kế CSDL dạng bảng 39 3.2.3.3. Lƣu trữ các thông tin vào CSDL 41 3.2.4. Tích hợp CSDL gene 16S rRNA và 23S rRNA với trang web 42 3.3. Thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn viêm màng não . 42 3.3.1 Thiết kế mồi dựa trên trình tự gene 16S rRNA 43 3.3.2. Thiết kế mồi dựa trên trình gene 23S rRNA 47 3.3.3. Nhiệt độ nóng chảy của mồi . 51 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .52 ix 4.1. Kết quả thu nhận các mẫu tin chứa trình tự và thông tin liên quan của hai gene 16S và 23S rRNA . 52 4.2. CSDL gene 16S và 23S rRNA 52 4.3. Trang web thể hiện thông tin CSDL gene 16S và 23S rRNA 52 4.3.1. Trang thông tin chung về CSDL gene 16S và 23S rRNA (Home Page) . 54 4.3.2. Trang tìm kiếm (Search Page) 55 4.3.3. Trang công cụ (Tool Page) . 58 4.3.4. Trang Meningitidis 60 4.4. Kết quả thiết kế mồi phát hiện các tác nhân viêm màng màng não mủ . 60 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO .64 PHỤ LỤC [...]... thực hiện đề tài Xây dựng CSDL hai gene 16S và 23S rRNA ở vi khuẩn - Ứng dụng CSDL này để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh vi m màng não mủ 2 1.2 MỤC ĐÍCH – Thu thập trình tự và thông tin liên quan về hai gene 16S và 23S rRNA ở vi khuẩn, tổ chức thành một CSDL riêng biệt – Ứng dụng trình tự hai gene trong CSDL để thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát hiện các vi khuẩn gây bệnh vi m màng não mủ Từ đó chứng... năng sử dụng của gene 23S rRNA có nhiều ƣu điểm hơn so với gene 16S rRNA – Tìm hiểu khả năng ứng dụng trong phát hiện tác nhân gây bệnh của phần mềm Primrose 2.17 (trƣớc đó phần mềm này ra đời với mục đích phân loại phả hệ bằng gene 16S rRNA) 1.3 YÊU CẦU – CSDL phải chứa một lƣợng lớn trình tự của hai gene 16S và 23S rRNA ở các loài vi khuẩn khác nhau trong đó có vi khuẩn gây bệnh vi m màng não mủ – CSDL... Ba cơ sở dữ liệu nucleotide (GenBank – EMB – DDBJ) và công cụ tìm kiếm tương ứng Ngoài ra còn có sự kết hợp của các CSDL protein trên thế giới để tạo ra một CSDL thống nhất wwPDB (world wide Protein Database) Hình 2.5 Sự hợp nhất của ba cơ sở dữ liệu MSD, PDBj, PDB 12 2.4 BỆNH VI M MÀNG NÃO MỦ 2.4.1 Sơ lƣợc về bệnh vi m màng não mủ 2.4.1.1 Định nghĩa Vi m màng não mủ là hiện tƣợng vi m của màng não. .. pneumoniae, trực khuẩn gram âm 13 2.4.1.3 Các con đƣờng xâm nhiễm của vi khuẩn gây bệnh Một số vi trùng ở trong máu đi vào màng não cũng có thể có nguồn gốc từ vi m nội tâm mạc, vi m phổi, vi m tắc tĩnh mạch hoặc cũng có thể xâm nhập trực tiếp từ các ổ vi m xoang, vi m tai giữa, vi m mũi Ở các bệnh nhân bị chấn thƣơng sọ não hoặc có vết gãy ở xoang mũi hay bị gãy xƣơng sàng dễ bị vi m màng não Ở những trƣờng... chấn thƣơng đầu và hệ thần kinh trung ƣơng, mụn mủ vi m mãn tính, bệnh sarcom Vi m màng não mủ do vi khuẩn kỵ khí thƣờng có điều kiện nhƣ: vi m tai, vi m xoang, vi m họng, áp xe não, nhiễm khuẩn vết thƣơng sau chấn thƣơng và sau phẩu thuật thần kinh 2.6 CÁC PHƢƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BỆNH VI M MÀNG NÃO MỦ 2.6.1 Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng Ngƣời bị vi m màng não mủ thƣờng có những biểu hiện nhƣ sốt cao,... xác và độ đặc hiệu cao 2.7.4 Ứng dụng kỹ thuật PCR trong vi c phát hiện vi khuẩn gây bệnh vi m màng não mủ Gene 16S rRNA của các vi khuẩn thuộc nhóm Eubacteria có những vùng bảo tồn cao ở cấp độ nhóm, xen kẽ với các vùng biến động khác nhau giữa các loài trong nhóm Do đó, những trình tự này rất phù hợp với mục đích thiết kế mồi nhằm phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn và các kỹ thuật chẩn đoán dựa vào... hƣớng trầm trọng hơn Tại Brazil, trong giai đoạn 1973 – 1982, tỷ lệ mắc bệnh vi m màng não mủ là 45,8/100 000 dân và tử vong là 33% Tại Gioudanni, tỷ lệ mắc bệnh vi m màng não mủ là 1,1/1000 trẻ mới sinh – Tình hình vi m màng não mủ ở Vi t Nam Tại Vi t Nam, bệnh vi m màng não mủ tuy không bùng phát thành dịch nhƣng vẫn xảy ra liên tục ở các khoảng thời gian khác nhau trong năm Theo thống kê của Trung tâm... điều trị kịp thời Vi c chẩn đoán bệnh bằng các phƣơng pháp truyền thống thƣờng hạn chế về mặt thời gian Phƣơng pháp PCR hiện nay đƣợc sử dụng rộng rãi do tính đơn giản, nhanh và chính xác Gene 16S và 23S rRNA là hai gene thích hợp cho vi c thiết kế mồi đặc hiệu để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh vi m màng não Với các lý do trên cùng với sự đồng ý hƣớng dẫn của TS Trần Thị Dung và Cử nhân Lƣu Phúc Lợi,... não Ở những trƣờng hợp này, sự nhiễm trùng thƣờng do các vi khuẩn hiện diện ngoài da của bệnh nhân Các phẫu thuật ngoại thần kinh cũng có thể gây vi m màng não nhất là các thủ thuật đụng chạm đến dịch não tủy hoặc do các trƣờng hợp vi m cốt tủy ở xƣơng sọ và cột sống Vi m màng não còn có thể do nhiễm các vi khuẩn từ môi trƣờng bên ngoài nhƣ các bệnh nhân bị phỏng dễ bị nhiễm Staphylococcus aureus, Pseudomonas... hình bệnh vi m màng não mủ trên thế giới và Vi t Nam – Tình hình nhiễm bệnh trên thế giới Bệnh vi m màng não nói chung (bao gồm cả vi m màng não mủ) xảy ra ở tất cả các nơi trên thế giới nhƣng những trận dịch lớn nhất và thƣờng xuyên lặp lại là ở vùng bán khô cằn của vùng cận sa mạc Sahara, châu Phi Khu vực này còn đƣợc biết với tên “The meningitis belt” (tạm dịch là “vành đai bệnh vi m màng não ) . “XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN – ỨNG DỤNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC. 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN – ỨNG DỤNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE 16S VÀ 23S RIBOSOM RNA Ở VI KHUẨN ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH VI M MÀNG NÃO MỦ (Bacterial
