Đang tải... (xem toàn văn)
Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao băng kỹ thuật Microsatellite 4
50 Phần Kết thảo luận 4.1.Sản phẩm DNA li trích Li trích DNA bước khởi đầu quan trọng, định thành công cho phản ứng PCR sau Đối với cacao, việc li trích gặp số khó khăn cacao có lớp ngoại bì bị cutin hóa mạnh, bên mô chứa hàm lượng lớn polysaccharide, polyphenol sắc tố khác (Hoàng Thị Liễu, 2004) Qui trình li trích DNA chúng tơi đạt hiệu DNA li trích có độ tinh khiết cao, khơng bị lẫn tạp DNA lạ Vì qui trình li trích này, dịch trích DNA có chất mercapto có khả phá vỡ thành tế bào mạnh Bước ủ Rnase phân hủy RNA có mẫu li trích, góp phần hạn chế lượng DNA tạp tổng hợp từ RNA phản ứng PCR sau Đặc biệt có mặt muối sodium acetate có khả làm biến tính enzyme phân hủy DNA Mặt khác, bước sử dụng Chloroform lặp lại lần liên tiếp kết hợp với li tâm loại bỏ hết protein polysaccharide có mẫu Do đó, DNA thu tốt, đảm bảo cho phản ứng PCR xảy Kết định lượng DNA quang phổ kế cho thấy DNA mẫu đem li trích có độ tinh tương đối cao với tỉ lệ OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1.5 đến 2.2 lượng DNA có mẫu trung bình khoảng 50ng/µl Hình 4.1: Kết điện di sản phẩm li trích DNA Những mẫu có tỉ lệ OD thấp, độ tinh khơng cao, chúng tơi chạy PCR đạt kết tốt cách xử lý sau: pha loãng mẫu 2-3 lần, 51 li tâm 12000 vòng, phút 4oC để lắng cặn xuống đáy ống, nhẹ nhàng hút DNA khoảng ống để thực phản ứng PCR, trường hợp thể tích DNA phản ứng PCR tăng lên gấp đơi (4µl thay 2µl) giảm thể tích nước 2µl Bước pha lỗng mẫu giúp giảm nồng độ tạp chất lẫn sản phẩm li trích sau cùng, bước li tâm giúp thu DNA tinh với nồng độ thấp khoảng ống không bị lẫn tạp chất lắng xuống đáy ống 4.2.Sản phẩm PCR Qui trình PCR cho kết ổn định với cặp primer Tuy nhiên primer mTcCIR11 thường cho band mờ mức độ khuếch đại thấp primer khác Vì pha trộn mẫu với primer mTcCIR11 cần tăng nồng độ DNA lên gấp đơi Hình 4.2: Kết điện di sản phẩm PCR với primer mTcCIR7 Qui trình PCR cho kết tương đối ổn định Những mẫu có nồng độ DNA li trích cao cho kết tốt chạy multiplex PCR, cho band điện di sáng, rõ Do thực phản ứng multiplex PCR cần tăng nồng độ DNA lên gấp đơi Hình 4.3: Kết điện di sản phẩm multiplex PCR 52 4.3.Dữ liệu Microsatellite để định danh 21 dịng cacao Sản phẩm PCR đưa vào phân tích máy giải trình tự DNA mà khơng cần phải qua bước tinh Vì kết so sánh nghiệm thức tinh không tinh cho kết phân tích Do sản phẩm PCR không cần phải tinh trước phân tích để giảm tốn Ngồi để giảm thời gian (1 cho 16 giếng đĩa) hóa chất phân tích (size standard hidi formamide), tiến hành trộn sản phẩm PCR riêng biệt (0.5µl/1sản phẩm) với lượng size standard hidi formamide với sản phẩm Điều giúp giảm chi phí xuống lần mà cho kết phân tích tốt Những mẫu có sản phẩm PCR không xuất band gel điện di band điện di mờ cho kết phân tích máy giải trình tự DNA cách tăng lượng mẫu PCR lên gấp đơi (1µl thay 0.5µl) hỗn hợp mang điện di Trong trường hợp khơng nhận kết phân tích microsatellite (No data), chúng tơi tiến hành hồn thiện phản ứng cách nâng lượng mẫu phản ứng PCR lên gấp đơi (4µl thay 2µl) Do chúng tơi thu kết phân tích tất mẫu với primer Kết phân tích 21 dịng cacao khảo sát với cặp pimer tóm tắt bảng 4.1 4.2 với cặp al đặc trưng sau loại trừ allele dropping (xem trang 54) Từ kết này, nhận thấy primer sử dụng phân biệt 21 kiểu gen khác Với đặc tính đồng trội (codominant), cặp al khác gọi dị hợp (VD: al 235- al 250), cặp al giống gọi đồng hợp (VD: al 288- al 288) Dựa vào bảng liệu chúng tơi định danh 21 dịng cacao khảo sát dựa vào đặc điểm microsatellite chúng xây dựng bảng liệu microsatellite 21 dịng cacao phục vụ cho cơng tác định danh phân tích đa dạng di truyền 53 Bảng 4.1: Dữ liệu microsatellite thu với primer Thứ tự Tên dòng 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 BAL 209 BAL 244 BR 25 KKM 225 PBC 123 PBC 154 PBC 157 PBC 159 PBC 230 PBC 236 QH 1213 QH 22 QH 441 CT1 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 mTcCIR mTcCIR 11 A1 A2 A1 A2 288 290 298 305 292 292 295 314 302 305 298 308 286 286 295 298 288 290 295 305 288 305 298 305 288 302 295 305 288 302 298 305 286 288 305 314 290 290 298 305 288 290 295 298 288 302 295 298 288 288 295 295 288 288 141 314 288 290 141 305 269 269 150 150 288 294 305 314 288 288 288 314 286 294 141 314 288 288 288 288 286 286 150 314 mTcCIR 15 A1 A2 252 254 244 246 235 244 235 244 235 250 232 252 235 250 235 244 235 250 235 250 252 254 232 252 232 252 248 250 244 248 242 252 244 248 252 252 248 250 248 250 248 250 Bảng 4.2: Dữ liệu microsatellite thu với primer Thứ tự 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tên dòng BAL 209 BAL 244 BR 25 KKM 225 PBC 123 PBC 154 PBC 157 PBC 159 PBC 230 PBC 236 QH 1213 QH 22 QH 441 CT1 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 mTcCIR A1 A2 155 157 157 157 153 155 153 155 155 157 153 157 155 157 155 157 155 157 153 157 153 157 153 157 157 157 153 153 153 157 153 157 153 157 155 157 153 153 153 153 153 153 mTcCIR 18 A1 A2 344 346 337 344 331 344 331 346 331 342 342 344 331 346 331 346 331 342 342 344 344 346 342 344 342 344 335 344 333 344 333 335 333 335 344 344 342 342 342 342 335 342 54 Allele dropping Allele dropping al xuất lần lần lặp lại thí nghiệm Đó al xuất khơng ổn định, nồng độ mẫu thấp, bị tạp nhiễm với kiểu gen khác q trình thí nghiệm, việc thêm vào nucleotid adenosine (A) vào đầu 3’ đoạn DNA khuếch đại (Smith et al., 1996), lỗi phân tích máy ABI 3100 Những al cần ghi nhận để loại bỏ lần phân tích sau Trong q trình thí nghiệm, số mẫu lặp lại 2-3 lần với primer để tìm nồng độ pha lỗng thích hợp để định danh lại mẫu mã hóa Từ đó, ghi nhận xuất allel dropping số dịng sau: Dịng PBC 159 có allele dropping với primer mTcCIR15: al 246 Dòng PBC 154 có allele dropping với primer mTcCIR15:al 244 Dịng PBC 154 có allele dropping với primer mTcCIR18:al 331 Dịng BAL 209 có allele dropping với primer mTcCIR18:al 331 Có mẫu lặp lại thí nghiệm lần, cần lặp lại thí nghiệm lần để khẳng định allele dropping, bao gồm: Dịng BAL 209 có allele dropping với primer mTcCIR11: al 295 Dòng PBC 123 có allele dropping với primer mTcCIR15: al 244 Dịng QH 441 có allele dropping với primer mTcCIR15: al 244 Dịng QH 441 có allele dropping với primer mTcCIR11: al 298 Dòng BAL 244 có allele dropping với primer mTcCIR11: al 150 Dịng QH 1213 có allele dropping với primer mTcCIR15: al 235, al 244 Al dropping 246 55 Hình 4.4: Giống PBC 159 có allele dropping 246 với primer mTcCIR15 4.4.Kết nhận diện mẫu mã hóa Với liệu microsatellite primer mTcCIR15, mTcCIR18 mTcCIR8 (bảng 3.7), tiến hành định danh cách phân tích mức độ đồng di truyền 13 mẫu mã hóa với 13 dịng cacao tương ứng với chúng phần mềm Cervus dựa tiêu sau: loci đưa vào phân tích Có loci có al hồn tồn giống Số loci sai khác cho phép Sự chênh lệch số lượng loci đưa vào phân tích số loci giống cao kết phân tích mức độ đồng di truyền có độ tin cậy cao, hay kết định danh xác ngược lại Cịn số loci sai khác cao độ tin cậy kết thấp, việc định danh khơng xác Hình 4.5: Các tiêu để kiểm tra mức độ đồng di truyền 56 Kết phân tích cho 10 cặp cá thể đồng di truyền thỏa mãn tiêu trên, đồng thời kết nhận diện hay định danh tương ứng với 10 mẫu mã hoá Kết định danh có độ xác cao hồn tồn khơng có loci sai khác (mismatching loci 0) Bảng 4.3: Kết nhận diện phần mềm Cervus **** Parameters **** Number of loci: Minimum number of loci needed for match: Number of mismatching loci allowed: **** Genotype matches **** The following individuals had matching genotypes in the genotype file: ID1 Loci typed ID2 Loci typed Matching loci Mismatching loci BAL209 A10 3 BR25 A9 3 KKM225 A5 3 PBC154 A12 3 PBC157 A11 3 ]PBC159 A8 3 PBC230 A13 3 PBC236 A6 3 QH1213 A7 3 QH22 A4 3 TOTAL: 10 Còn lại ba mẫu mã hóa A2, A3, A14 dịng cacao BAL 244, PBC 123 QH441 chưa nhận diện Kết phân tích microsatellite cho thấy: - Dữ liệu microsatellite với primer mTcCIR18, mTcCIR15, mTcCIR8 mẫu A2 BAL244 hoàn toàn giống với loci primer mTcCIR18 mTcCIR8, chúng khác loci primer mTcCIR15: mẫu A2 bị thiếu al 246 (xem phụ lục trang 65 ) - Dữ liệu microsatellite với primer mTcCIR18, mTcCIR15, mTcCIR8 mẫu A3 PBC123 hoàn toàn giống với loci primer mTcCIR18 57 mTcCIR8, chúng khác al loci xác định loci primer mTcCIR15:al 250 al đặc trưng mẫu A3, mẫu PBC123 al 250 khơng phải al đặc trưng mà thay vào al 244 (xem phụ lục trang 66) - Dữ liệu microsatellite với primer mTcCIR18, mTcCIR15, mTcCIR8 mẫu A14 QH441 hoàn toàn giống với loci primer mTcCIR18 mTcCIR8, chúng khác al loci xác định primer mTcCIR15: al 252 al đặc trưng mẫu A14, mẫu QH441 al 252 al đặc trưng mà thay vào al 244 (xem phụ lục trang 77) Sự sai khác al tượng allele dropping xảy q trình phân tích trình tự microsatellite Tuy có sai khác al kết phân tích đủ để kết luận mẫu A2 mã hóa cho dịng cacao BAL244, mẫu A3 mã hóa cho dịng cacao PBC123, mẫu A14 mã hóa cho dịng cacao QH441 Bảng 4.4: Kết nhận diện mẫu mã hóa Giống lấy mẫu Mẫu mã hóa Giống nhận diện Đánh giá kết BAL 244 A2 BAL 244 Sai khác al PBC 123 A3 PBC 123 Sai khác al QH 22 A4 QH 22 Chính xác KKM22 A5 KKM225 Chính xác PBC 236 A6 PBC 236 Chính xác QH 1213 A7 QH 1213 Chính xác PBC 159 A8 PBC 159 Chính xác BR 25 A9 BR 25 Chính xác BAL 209 A10 BAL 209 Chính xác PBC 157 A11 PBC 157 Chính xác PBC 154 A12 PBC 154 Chính xác PBC 230 A13 PBC 230 Chính xác QH 441 A14 QH 441 Sai khác al Việc định danh không sử dụng hỗ trợ việc nhận diện kiểu hình thực tế việc định danh ln có hỗ trợ cách nhận diện kiểu hình dựa vào 58 kinh nghiệm (như nhận diện qua hình dạng, màu sắc hoa, quả) nên đơn giản thuận tiện Nhưng lợi phương pháp định danh microsatellite áp dụng từ giai đoạn ươm nhà lưới, chưa có hoa hay để giúp cho việc nhận diện kiểu hình Uu điểm việc định danh từ giai đoạn giúp loại bỏ kịp thời bị nhầm lẫn giống trước đem vườn trồng 4.5 So sánh liệu microsatellite Khi so sánh liệu microsatellite giống cacao NA33, AMAZ15/15, PA107 vườn sưu tập giống cacao, Đại Học Nông Lâm, với liệu tương ứng chúng ngân hàng cacao giới ICGD chúng tơi nhận thấy có khác biệt primer (được trình bày bảng 4.4, 4.5 4.6) Như giống cacao NA33, AMAZ15/15, PA107 sưu tập giống cacao Đại Học Nông Lâm Ngân hàng cacao giới ICGD khơng giống nhau, nguồn gốc lai tạo khác Tuy nhiên, kết cho thấy phương pháp kỹ thuật phân tích chúng tơi với phương pháp phân tích microsatellite ngân hàng cacao giới Điều hỗ trợ cho việc so sánh đa dạng di truyền giống cacao Đại Học Nông Lâm với giống cacao giới dựa liệu Microsatellite Bảng 4.5: Dữ liệu microsatellite giống NA33 NA 33 Primer Primer11 Primer 18 Kết Kết sở thí nghiệm 290 290 Al đồng hợp 295 305 Al dị hợp liệu ICGD 289 293 Al dị hợp 305 305 Al đồng hợp 333 342 Al dị hợp 333 343 Al dị hợp NA33- ICGD Bảng 4.6: Dữ liệu microsatellite giống AMAZ15/15 59 AMAZ15/15 Kết thí nghiệm 288 292 Al dị hợp 244 254 Al dị hợp Primer15 Primer 18 AMAZ15/15- ICGD sở liệu ICGD 289 293 Al dị hợp 245 257 Al dị hợp 333 346 Al dị hợp Primer Kết 340 340 Al đồng hợp Bảng 4.7: Dữ liệu microsatellite giống PA107 Primer Primer1 Kết Kết sở thí nghiệm PA107 liệu ICGD 244 244 Al đồng hợp 337 346 Al dị hợp 242 242 Al đồng hợp 337 347 Al dị hợp PA107-ICGD 4.6.Kết phân tích multiplex PCR Một lợi kỹ thuật microsatellite thực máy giải trình tự thực lúc nhiều phản ứng PCR, lúc điện di nhiều sản phẩm PCR thiết bị nhận diện sản phẩm Lợi cho phép kết hợp thực lúc nhiều phản ứng PCR hay multiplex PCR để giảm chi phí hóa chất thời gian thí nghiệm Phản ứng multiplex PCR thực với primer có nhiệt độ bắt cặp 46oC có màu huỳnh quang khác nhau: mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 Kết phân tích microsatellite sản phẩm multiplex PCR giúp phân biệt nhanh chóng mẫu có kết giống đến cặp primer Ví dụ mẫu QH441 BAL244 có kết giống với primer mTcCIR8 phân biệt chúng dễ dàng kết primer cịn lại khác Do cần lần phân tích thay lần với primer riêng biệt Quan trọng kết có hiệu kinh tế cao, giúp giảm chi phí cho giai đoạn PCR lẫn giai đoạn phân tích microsatellite 60 Ngồi ra, trộn sản phẩm PCR riêng biệt với primer (có màu huỳnh quang khác nhau) mẫu đem phân tích trình tự kết tương tự thực phản ứng multiplex PCR Ưu điểm cách làm so với multiplex PCR kết hợp phân tích lúc primer có nhiệt độ lai khác (trong phương pháp multiplex PCR địi hỏi primer phải có nhiệt độ lai), khuyết điểm chi phí cao phương pháp multiplex PCR số phản ứng PCR thực nhiều gấp lần QH441 mTcCIR15 mTcCIR8 mTcCIR11 BAL244 mTcCIR8 mTcCIR15 mTcCIR11 61 Hình 4.6:So sánh kết mẫu multiplex PCR giống primer mTcCIR8 mTcCIR7 mTcCIR15 mTcCIR11 Hình 4.7:Kết phân tích mẫu CT3 phương pháp kết hợp sản phẩm PCR riêng biệt với primer mTcCIR7, mTcCIR15 mTcCIR11 4.7 Kết phân tích tính đa dạng di truyền Với liệu microsatellite 21 dòng cacao khảo sát nằm quần thể: CT, PBC, BAL, QH, BR KKM, dùng phần mềm Genetix để xử lý liệu microsatellite cá thể quần thể, từ mơ tả quan hệ di truyền gần xa quần thể, cá thể quần thể dựa khoảng cách chúng biểu đồ Kết phân tích sau: Các quần thể có quan hệ di truyền gần nhau: • Quần thể QH quần thể BAL • Quẩn thể BR, KKM PBC Các quần thể có quan hệ di truyền xa nhau: • Quần thể BR quần thể QH • Quần thể BR quần thể BAL • Quần thể BR quần thể CT • Quần thể KKM quần thể QH • Quần thể KKM quần thể BAL • Quần thể KKM quần thể CT 62 Các cá thể phân tích quần thể BAL QH có quan hệ di truyền gần với Riêng quần thể BR KKM có cá thể đại diện nên khơng thể nhận xét mặt cá thể Quần thể PBC có cá thể, đó: • cá thể PBC 123, PBC 157 PBC 236 có quan hệ di truyền gần • cá thể PBC 159 PBC 230 có quan hệ di truyền gần xa cá thể • Cá thể cịn lại PBC 154 có quan hệ di truyền xa với cá thể khác quần thể PBC Quần thể CT có cá thể, đó: • cá thể CT1, CT5, CT7, CT8, CT9 có quan hệ di truyền gần • cá thể CT3, CT4 CT6 có quan hệ di truyền xa với xa với cá thể lại quần thể CT Riêng cá thể CT6 có quan hệ di truyền gần với cá thể PBC 154 QH 441 ... mTcCIR 18 A1 A2 344 346 337 344 331 344 331 346 331 342 342 344 331 346 331 346 331 342 342 344 344 346 342 344 342 344 335 344 333 344 333 335 333 335 344 344 342 342 342 342 335 342 54 Allele dropping... 21 dòng cacao khảo sát dựa vào đặc điểm microsatellite chúng xây dựng bảng liệu microsatellite 21 dòng cacao phục vụ cho cơng tác định danh phân tích đa dạng di truyền 53 Bảng 4. 1: Dữ liệu microsatellite. .. 250 235 244 235 250 235 250 252 2 54 232 252 232 252 248 250 244 248 242 252 244 248 252 252 248 250 248 250 248 250 Bảng 4. 2: Dữ liệu microsatellite thu với primer Thứ tự 10 11 12 13 14 15 16