Đang tải... (xem toàn văn)
Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú bằng kỹ thuật Real - time PCR
1 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nuôi trồng thủy sản ngành kinh tế quan trọng đóng góp phần đáng kể thị phần xuất số quốc gia giới đặc biệt nước Châu Á Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan,Việt Nam, In-đô-nê-xi-a, Ấn Độ Hiện để tăng sản lượng nuôi tôm, việc áp dụng kỹ thuật tiên tiến nuôi thâm canh suất cao tăng diện tích ni có nhiều tác động đến mơi trường sinh thái vùng nuôi Vấn đề ô nhiễm môi trường, bùng phát dịch bệnh thường xuyên diễn Trong bệnh đốm trắng chiếm tỷ lệ cao Bệnh gây thiệt hại không nhỏ cho nghề nuôi tôm sú từ năm 1993 - 1994 tác động mạnh đến nghề nuôi tôm công nghiệp giới Bệnh đốm trắng gây tác hại nghiêm trọng tôm sú Đặc trưng bệnh gây nên tỷ lệ chết cao gây chết hàng loạt cho tôm sú nuôi thời gian ngắn ao nuôi bị nhiễm bệnh Sự lan rộng dịch bệnh đốm trắng làm sản lượng tôm nuôi Đài Loan từ 95.000 vào năm 1987 giảm xuống 30.000 vào năm 1988 (Liao ctv., 1992; trích Thuy Thi Ngoc Phan, 2001); Việt Nam sản lượng tôm nuôi từ 50.000 vào năm 1995 giảm xuống 30.000 năm 1997 (World Shrimp Farming, 1997; trích Trần Thị Hoàng Dung, 2000) Hiện nay, việc nghiên cứu để tìm phương pháp điều trị bệnh cịn nhiều khó khăn chưa có hiệu rõ ràng Phương pháp để hạn chế thiệt hại bệnh đốm trắng gây biện pháp phòng bệnh q trình ni Trong đó, việc chẩn đốn bệnh đốm trắng giai đoạn tôm giống trước thả nuôi việc chẩn đoán bệnh kịp thời giai đoạn ni để có biện pháp xử lý thích hợp điều vô cần thiết Kỹ thuật PCR từ lâu xem cách tiếp cận hứa hẹn việc phát mầm bệnh Trong năm qua, kỹ thuật PCR phát triển không ngừng thông qua cải tiến nguyên lý, thiết bị hóa chất Phương pháp Real - time PCR cải tiến kỹ thuật PCR Phương pháp Real - time PCR rút ngắn thời gian phân tích kết Khả định lượng kỹ thuật Real - time PCR đảm bảo giảm thiểu xác suất dương tính giả kết phân tích Với ưu điểm vậy, phương pháp Real - time PCR cho phép phát định lượng virus gây bệnh tôm trước xuất biểu sinh lý (Tạp chí Thủy sản, số – 2004) Điều có ý nghĩa đặc biệt quan trọng giúp cho chủ trại tơm có đủ thời gian đưa giải pháp hợp lý để phòng ngừa ngăn chặn dịch bệnh trước bệnh bùng phát Ở Việt Nam, kỹ thuật PCR dùng phổ biến chẩn đoán virus gây bệnh đốm trắng tôm nuôi Hiện nay, Real – time PCR, nước ta chưa có cơng trình nghiên cứu công bố việc sử dụng kỹ thuật phát định lượng virus gây bệnh đốm trắng tơm sú ni Do đó, đồng ý môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm, hướng dẫn ThS Phan Thị Ngọc Thủy ThS Nguyễn Thái Thủy, thực đề tài “Phát định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm sú (Penaeus monodon) kỹ thuật Real - time PCR” nhằm phát nhanh, xác định lượng virus gây bệnh đốm trắng; góp phần phòng ngừa lây lan bùng phát dịch bệnh 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích - Thử nghiệm kỹ thuật Real - time PCR để phát định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm sú nuôi - So sánh kỹ thuật mới: Real - time PCR kỹ thuật sử dụng: Nested PCR phát WSSV tôm sú nuôi - Ứng dụng kỹ thuật Real - time PCR để phát định lượng WSSV giai đoạn tôm sú nuôi từ thực tiễn 1.2.2 Yêu cầu - Nắm vững hiểu rõ kỹ thuật PCR Real - time PCR - Sử dụng thành thạo hệ thống PCR Real - time PCR - Bố trí thí nghiệm, xây dựng thành cơng quy trình phát định lượng WSSV tôm sú nuôi kỹ thuật Real - time PCR - Phát định lượng virus gây bệnh đốm trắng tôm sú giai đoạn nuôi qua mẫu thu từ thực tế - Theo dõi, ghi nhận tình trạng thu hoạch ao thả nuôi tôm thu mẫu để xét nghiệm WSSV Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu khái quát tôm sú (Penaeus monodon) Tơm sú lồi có kích thước lớn họ tơm he (Penaeidae) Kích thước lớn đạt đến 290 – 305 mm (200 – 250 gram), trung bình đạt từ 190 – 195 mm, nặng 150 gram Chúng ưa sống nơi có đáy bùn cát, độ trong, độ mặn cao ổn định Tuy nhiên, tơm sú có khả thích ứng với độ mặn rộng thời kỳ trưởng thành, thuận lợi cho nghề ni tơm đầm mặn, lợ ven biển Mùa vụ sinh sản từ tháng 11 - năm sau (Bộ Thủy Sản, 1996) 2.1.1 Phân loại Theo Phạm Văn Tình (2001), tôm sú định loại sau: Ngành: Arthropoda - Ngành chân khớp Lớp: Crustacea - Lớp giáp xác Bộ: Decapoda - Bộ mười chân Họ chung: Penaeidae Họ: Penaeidae - Họ tơm he Giống: Penaeus Lồi: Penaeus monodon Tên địa phương: tôm sú, tôm cỏ, tôm he, tôm giang (Trần Minh Anh, 1989) Tiếng Anh: Black tiger shrimp, Tiger prawn, Giant tiger prawn, Grass shrimp, Tumbo prawn (Nguyễn Văn Chung, 2000) 2.1.2 Vùng phân bố Phạm vi phân bố tôm sú rộng, từ Ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài Loan, phía Đơng Tahiti, phía Nam Châu Úc phía Tây Châu Phi Nhìn chung, tơm sú phân bố từ kinh độ 300E đến 1550E từ vĩ độ 350N tới 350S xung quanh nước vùng xích đạo, đặc biệt In-đơ-nê-xi-a, Mã Lai, Phi-líp-pin Việt Nam (Phạm Văn Tình, 2001) Tơm giống (PL) tơm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển vùng rừng ngập mặn ven bờ Khi tôm trưởng thành di chuyển xa bờ chúng thích sống vùng nước sâu (Phạm Văn Tình, 2001) 2.1.3 Chu kỳ sống Trong thiên nhiên, ấu trùng tôm sú trải qua ba thời kỳ biến thái (Nauplius – Protozoea – Mysis) Ấu trùng theo sóng biển dạt vào cửa sơng, vùng nước lợ có độ mặn 15 - 30‰ Tại môi trường nước lợ, ấu trùng (larvae) phát triển sang thời kỳ hậu ấu trùng Postlarvae Sau Postlarvae chuyển sang thời kỳ ấu niên Juvenile đồng thời bơi biển, tiếp tục tăng trưởng phát triển (Vũ Thế Trụ, 1993) Tôm đẻ trứng vào ban đêm (thường từ 22 đến giờ), trứng sau đẻ 14 – 15 giờ, nhiệt độ 27 – 280 nở thành ấu trùng (Nauplius) Ấu trùng phát triển qua giai đoạn sau: - Nauplius giai đoạn: 36 – 51 - Protozoea giai đoạn: 105 – 120 - Mysis giai đoạn: 72 Sau chuyển thành Postlarvae, Juvenile, Adult (giai đoạn trưởng thành) Tôm sú đẻ quanh năm, tập trung vào hai thời kỳ chính: tháng – tháng – 10 Tuổi thọ tôm sú đực khoảng 1,5 năm; khoảng năm (Phạm Văn Tình, 2001) Hình 2.1 Vịng đời tôm sú Penaeus monodon (Nguồn: FAO Multimedia Asia Co., Ltd., 1999) 2.2 Tình hình dịch bệnh WSSV giới Việt Nam 2.2.1 Trên giới Bệnh đốm trắng (WSSV – White Spot Syndrome Virus) bệnh nguy hiểm tôm nuôi Bệnh xảy tất nước nuôi tôm ảnh hưởng phần lớn đến nghề nuôi tôm công nghiệp giới (Nguyễn Văn Hảo, 2000) Trong thời gian qua, bệnh đốm trắng bùng phát nhiều khu vực nuôi tôm giới, đặc biệt nước Châu Á Bệnh đốm trắng gây tỷ lệ chết cao gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm công nghiệp Trung Quốc, Nhật Bản, In-đô-nê-xi-a Ấn Độ Trong thời gian 1994 – 1995, virus gây bệnh đốm trắng gây chết hầu hết tôm nuôi (P monodon; P indicus) dọc theo bờ biển phía Đơng Ấn Độ phía Tây Ấn Độ (Tạp chí thơng tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số – 2004) Theo Nguyễn Văn Hảo (2004), bệnh đốm trắng xuất Bắc Á vào năm 1992 – 1993, đồng thời nhanh chóng lan rộng khắp khu vực Châu Á giới nước có hình thức ni tơm cơng nghiệp thâm canh Dịch bệnh đốm trắng phát lần Đài Loan năm 1992, Trung Quốc – 1993, Nhật Bản – 1994, sau nước In-đô-nê-xi-a, Thái Lan, Mã Lai, Ấn Độ, Băng-la-desh, bang Texas (Hoa Kỳ) – 1995 gây tổn thất nghiêm trọng sản lượng tôm nuôi Ở Thái Lan, dịch bệnh đốm trắng bùng nổ làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225.000 năm 1995 xuống 160.000 năm 1996 làm thiệt hại 500 triệu USD Ở nước Châu Á bệnh gây thiệt hại khoảng tỷ USD năm (Nguyễn Văn Hảo, 2000) Thực tế nước khu vực Đông Nam Á, bệnh đốm trắng xem phổ biến nguy hiểm hầu hết nghiên cứu tập trung ngăn ngừa lan nhiễm bùng nổ bệnh đốm trắng ao nuôi (Nguyễn Văn Hảo, 2000) 2.2.2 Ở Việt Nam Theo Bùi Quang Tề (2003), từ năm 1993 – 1994 đến bệnh đốm trắng tôm thường xuất vùng nuôi tôm ven biển từ nuôi quảng canh đến nuôi thâm canh, bệnh gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tơm Ở tỉnh ven biển phía Nam từ năm 1993 – 1994, tượng tôm chết hàng loạt tôm sú nuôi xác định ba loại bệnh: bệnh MBV, bệnh đốm trắng bệnh đầu vàng (Tạp chí thơng tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số – 2004) Từ năm 1996 đến nay, tơm ni thương phẩm Khánh Hịa địa phương khác nước chịu tác hại lớn bệnh đốm trắng Bệnh xảy hàng năm, diện rộng, có vụ ni 80% diện tích nuôi tôm địa phương bị thất thu hay thu hoạch sớm dự kiến (Bộ Thuỷ Sản, 2003) Năm 2001, Bùi Quang Tề cộng điều tra 483 hộ nuôi tôm sú thuộc 23 huyện tỉnh ven biển phía Bắc (Quảng Ninh, Hải Phịng, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hố, Nghệ An, Hà Tĩnh) có 166 hộ (34,3%) có tơm ni tôm cua tự nhiên mang mầm bệnh đốm trắng có 169 hộ (34,99%) có tơm chết bệnh đốm trắng Năm 2003, Bùi Quang Tề cộng phân tích bệnh WSSV kỹ thuật PCR 145 mẫu tôm sú tôm chân trắng nuôi tỉnh ven biển miền Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Thanh Hố Hà Tĩnh) tơm Postlarve (PL) đưa từ Quảng Nam Đà Nẵng chuyển Bắc Kết cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng tôm (PL) đưa từ Đà Nẵng, Quảng Nam 23,08%; tơm sú ni thương phẩm tỉnh phía Bắc 26,92%; tơm chân trắng 13,33% (Tạp chí thông tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số – 2004) Theo báo cáo kết nuôi trồng thủy sản (NTTS) năm 2003, nước có 546.757 ni tơm nước lợ thương phẩm, diện tích có tôm nuôi bị bệnh chết 30.083 Các tỉnh, thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ni tơm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tơm bị chết nước Bệnh xảy với tôm chủ yếu bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh vi khuẩn Vibrio Kết kiểm tra bệnh tôm giống nhập Hải Phòng Quảng Ninh năm 2003 Trạm nghiên cứu NTTS nước lợ thực cho thấy tỷ lệ nhiễm virus gây bệnh đốm trắng từ 25 - 46,6%, trung bình 38,9% Theo số liệu từ Trung Tâm Môi Trường Dịch Bệnh (Viện nghiên cứu NTTS I), Thanh Hóa có 40% diện tích ni tơm bị bệnh, phần lớn thường bệnh đốm trắng Bệnh tập trung vùng nuôi tôm công nghiệp khu công nghiệp Hoằng Phụ, với 70/110 nuôi tôm bị nhiễm bệnh Ở Hà Tĩnh, số 150 ni tơm bị bệnh, có 67 bị bệnh đốm trắng, 27 có tơm ni bị chết Theo kết nghiên cứu Viện Nghiên Cứu NTTS II, tỉnh Nam Bộ, tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng mẫu tơm có biểu bệnh thu đầm nuôi quảng canh cải tiến 56% Những ngày đầu năm 2004, nhiều tỉnh Đồng Bằng Sơng Cửu Long xảy tình trạng tôm nuôi bị chết virus gây bệnh đốm trắng gây nên bệnh lây lan nhanh từ đầu vụ Hiện nay, bệnh đốm trắng diễn gây nhiều tổn thất cho nhiều hộ dân tỉnh (Tạp chí Thủy sản, số – 2004) Nhìn chung, tình hình dịch bệnh đốm trắng diễn Việt Nam nghiêm trọng ảnh hưởng mạnh đến ngành Thủy sản nước 2.3 Bệnh đốm trắng tôm 2.3.1 Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) 2.3.1.1 Định danh phân loại Định danh - Giống: Non Occuluded Baculovirus - Họ: Baculoviridae - Họ phụ: NudiBaculoviridae Theo hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (2002), nhà khoa học phân loại virus gây bệnh đốm trắng giống Whisspovirus thuộc họ Nimaviridae (Tạp chí thơng tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số – 2004) Tác nhân virus gây bệnh đốm trắng gọi nhiều tên nhiều nhóm nghiên cứu khác (Wang Y C et al., 1996): - WSSV: White Spot Syndrome Virus - WSBV: White Spot Baculovirus Virus - WSVD: White Spot Viral Disease - WSS: White Spot Syndrome - WSV: White Spot Virus - SEMBV: Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus Disease - HHNBV: Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Baculovirus Hiện nay, WSSV tên thông dụng virus gây bệnh đốm trắng tôm sú (Lightner D V, 1996) Các chủng virus gây bệnh đốm trắng bao gồm: Bảng 2.1 Các chủng virus gây bệnh đốm trắng Tên virus Virus Trung Quốc (HHNBV) Virus tôm Nhật (RVPJ–1) Virus tơm Nhật (RV-PJ-2) Virus bệnh đốm trắng (WSBV) Kích thước virus 120 x 360 nm Kích thước nhân 83 x 276 nm 84 x 226 nm 89 x 201 nm 70 – 150 x 350 – 380 nm 56 – 67 x 330 – 350 nm (Nguồn: Tạp chí thông tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số – 2004) 2.3.1.2 Đặc điểm hình thái Virus dạng hình que, kích thước 120 x 275 mm, có phụ đầu, kích thước 70 x 300 mm Virus có lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15 – 28 kD Vỏ bao có hai lớp protein VP28 VP29; Nucleocapsid có ba lớp VP26, VP24, VP15 Nhân cấu trúc ADN mạch đơi (Tạp chí thông tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số – 2004) Hình 2.2 Virus đốm trắng (WSSV) hình que dƣới kính hiển vi điện tử Hình 2.3 Virus nhuộm âm huyết tƣơng tôm sú nhiễm bệnh WSSV, số thể virus có (vạch kẻ a = 240 nm (theo Graindorge & Flegel, 1999)) (Nguồn: Bùi Quang Tề, 2003) 2.3.1.3 Đặc tính sinh học Virus đốm trắng ký sinh tổ chức ngoại bì, trung bì, mang, quan lymphoid biểu bì vỏ kitin Virus xâm nhập vào nhân tế bào gây hoại tử sưng to Virus sống tồn nước có độ mặn từ – 40‰, độ pH từ – 10, có khả chịu đựng nhiệt độ từ – 800C (Trần Thị Việt Ngân, 2002) 2.3.2 Vật chủ mang mầm bệnh WSSV Virus gây bệnh đốm trắng phân bố rộng nhiều vật chủ, virus không nhiễm số lồi tơm he (Penaeus) ni Tây bán cầu mà xuất rộng mười chân (Decapoda) gồm loài cua giáp xác khác Ở Việt Nam, mầm bệnh WSSV nhiễm nhiều lồi tơm he nuôi sống tự nhiên: tôm sú (P mondon); tôm thẻ (P indicus); tôm rảo (Metapenaeus ensis); tôm đất (M lysianassa); tôm chân trắng (L vannamei) nhập vào nuôi Việt Nam (Tạp chí thơng tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số – 2004) 2.3.3 Các đƣờng lây truyền WSSV Bệnh đốm trắng virus WSSV lây lan nhanh qua hai đường chính: - Lây lan theo chiều dọc (Vertical transmission): từ bố mẹ nhiễm bệnh lây lan cho - Lây lan theo chiều ngang (Horizontal transmission): bị nhiễm virus từ nguồn nước nuôi, từ cua, còng mang virus từ ao sang ao kia, từ dùng cụ sản xuất mang mầm bệnh, từ tơm chết, người chim, cị vơ tình đưa vào ao,…(Trần Thị Việt Ngân, 2002) Trong đó, lây lan theo chiều ngang đường lan truyền chủ yếu Bệnh đốm trắng dễ bị bùng phát tôm bị sốc mơi trường biến đổi xấu (Tạp chí thơng tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số – 2004) 10 LÂY NHIỄM THEO CHIỀU DỌC LÂY NHIỄM THEO CHIỀU NGANG Hình 2.4 Hai vịng lây nhiễm virus gây bệnh đốm trắng WSSV ao nuôi (theo Passano L M., 1960) (Nguồn: Trần Thị Việt Ngân, 2002) 2.3.4 Cơ chế xâm nhập Virus gây hội chứng đốm trắng xâm nhập vào tôm cư trú nhiều phận tơm mơ nội bì, mơ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi phận khác Sau xâm nhập vào tế bào chủ, virus tiến hành tự nhân dựa sở vật chất lượng tế bào Thơng qua q trình này, số lượng thể virus tăng lên nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường tế bào Khi quan sát kính hiển vi, tế bào bị nhiễm virus thường có nhân phình to Virus phát triển đến giai đoạn phá vỡ nhân giết chết tế bào, virus lan truyền môi trường nước, tìm ký chủ khác lại tiếp tục xâm nhập cơng (Trần Thị Việt Ngân, 2002) Ngồi ra, tôm ăn phải virus tự tồn bùn ao nước dẫn đến nhiễm mầm bệnh WSSV (Chou H Y ctv., 1996; trích Trần Thị Hoàng Dung, 2000) 2.3.5 Triệu chứng bệnh Dấu hiệu bệnh lý đặc trưng: tôm bị bệnh giảm ăn rõ rệt, mệt mỏi, vỏ bì chùng lỏng với đốm trắng từ 0,2 – mm đường kính, biểu bề mặt bên vỏ Trong nhiều trường hợp, tôm hấp hối bệnh WSSV chuyển sang màu hồng đến màu ... hệ thống PCR Real - time PCR - Bố trí thí nghiệm, xây dựng thành cơng quy trình phát định lượng WSSV tôm sú nuôi kỹ thuật Real - time PCR - Phát định lượng virus gây bệnh đốm trắng tôm sú giai... dịch bệnh 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích - Thử nghiệm kỹ thuật Real - time PCR để phát định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm sú nuôi - So sánh kỹ thuật mới: Real - time PCR kỹ thuật. .. Nested PCR phát WSSV tôm sú nuôi - Ứng dụng kỹ thuật Real - time PCR để phát định lượng WSSV giai đoạn tôm sú nuôi từ thực tiễn 1.2.2 Yêu cầu - Nắm vững hiểu rõ kỹ thuật PCR Real - time PCR - Sử
