Đang tải... (xem toàn văn)
Nhân dòng gen prion từ giống bò Hanwoo của hàn quốc
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG QUỐC BẢO NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ HANWOO (Bos Taurus Coreanae) CỦA HÀN QUỐC LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ HANWOO (Bos Taurus Coreanae) CỦA HÀN QUỐC LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực GS.TS Kwon Moosik ĐẶNG QUỐC BẢO (Pr PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY GENE CLONING PRION (PrP) FROM KOREAN BOVINE: HANWOO (Bos taurus Coreanae) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Ph.D Kwon Moosik Dr Nguyen Ngoc Tuan Student DANG QUOC BAO TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học Các Thầy Cơ Phịng Quan Hệ Quốc Tế Các Thầy Khoa Công Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan, Hàn Quốc Đã truyền đạt cho em kiến thức quý báu giúp đỡ em thời gian em học tập trƣờng Đặc biệt xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến: TS Kwon Moosik- Trƣởng môn Công Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ em nghiên cứu thực đề tài TS Nguyễn Ngọc Tuân- Trƣởng phòng Sau Đại Học, Đại Học Nông Lâm giúp đỡ nhiều hƣớng dẫn tận tình trình viết khố luận TS Trần Thị Dung- Trƣởng mơn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm tạo điều kiện cho em thực đề tài Ths Kim Yong Hwan anh chị phòng thí nghiệm Cơng Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan tận tình hƣớng dẫn, bảo em suốt thời gian em thực khóa luận Xin cảm ơn bạn lớp động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập làm khóa luận tốt nghiệp Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ bên thời điểm Thủ Đức, ngày 10 tháng 08 năm 2006 iii TĨM TẮT ĐẶNG QUỐC BẢO, Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 ―NHÂN DỊNG GEN PRION (PrP) TỪ BÒ HANWOO (BOS TAURUS COREANAE) CỦA HÀN QUỐC‖ Giáo viên hƣớng dẫn GS TS KWON MOOSIK PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN BSE bệnh truyễn nhiễm prion, bệnh đƣợc quan tâm giới nghiên cứu Hiện nhà khoa học tiến hành nghiên cứu để tạo kit chẩn đoán sớm bệnh BSE, nghiên cứu tập trung nghiên cứu cấu trúc protein PrPsc, dạng protein gây bệnh prion Bƣớc đầu nghiên cứu protein PrPsc, tiến hành nhân dịng giải trình tự gen prion Tách chiết DNA từ máu bò Hanwoo PCR để khuếch đại gen prion Gen prion đƣợc khuếch đại có kích thƣớc 651 bp, sau đƣợc kết buộc vào véc tơ pGEMT easy chuyển vào vi khuẩn E coli DH5α Khuẩn lạc chứa véc tơ tái tổ hợp có màu trắng môi trƣờng LB chuyên biệt (Amp+, Xgal, IPTG) Plasmid thu đƣợc sau trình tinh đƣợc giải mã trình tự Kết giải trình tự thành cơng cho thấy giống gần nhƣ hồn tồn trình tự gen prion bị Hanwoo bị châu Âu Việc thành cơng q trình nhân dòng bƣớc đầu quan trọng cho mục tiêu cuối nghiên cứu tạo kit chẩn đoán bệnh BSE iv ABSTRACT Prion — short for proteinaceous infectious particle — is a unique type of infectious agent, as it is made only of protein Prion was termed in 1982 by Prusiner, who was prized Nobel for his research on prion Bovine spongiform encephalopathy (BSE) is one of the most notable prion diseases BSE is not only potential risk on bovine but also on human Until now Korea is free from BSE (Tae-Yung Kim et al,2005), but the BSE is high risk damage society The study on BSE is absolutelly remarkable As the first step of our prion study, we were attempted cloning full gene of prion encoding bovine prion protein from Korean bovine PrP gene was amplified from genome DNA (gDNA) of Korean bovine by PCR following primers forward and reverses primer The recombinant PrP of full sequence cDNA is 651bp long encoding 217 amino acids Amplified gene was then transmitted in to pGEM-T easy vector Subsequently, recombination vector was transformed into compentent cell E coli DH5α Recombinant plasmid of PrP was then further analyzed through sequencing v MỤC LỤC Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách bảng xi Danh sách bảng hình ảnh x CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Prion 2.2 Bệnh não dạng xốp bị bệnh khác có ngun nhân pion 2.2.1 Bệnh não dạng xốp bò 2.2.2 Các bệnh khác có nguyên nhân prion 2.3 Sự nhân dòng 2.3.1 Kỹ thuật PCR 2.3.2 Kỹ thuật điện di 2.3.3 Véc tơ plasmid 2.3.4 Sự kết buộc 2.3.5 Biến nạp vi khuẩn E coli 2.3.6 Chọn lọc vi khuẩn đƣợc biến nạp 2.3.7 Giải trình tự 2.3.7.1 Phƣơng pháp Sanger Coulson 2.3.7.2 Phƣơng pháp Maxam – Gilbert 2.3.7.3 Giải trình tự hệ thống tự động CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 10 3.2 Vật liệu 10 vi 3.3 Dụng cụ hoá chất 10 3.3.1 Dụng cụ 10 3.3.2 Hóa chất 10 3.3.3 Các dung dịch 11 3.4 Mồi PCR 11 3.5 Khuếch đại gen prion từ gen bò Hàn Quốc kỹ thuật PCR 11 3.6 Kỹ thuật điện di thạch agarose phân tách gen prion 12 3.6.1 Kiểm tra sản phẩm PCR 12 3.6.2 Thạch tinh DNA 12 3.7 Tách chiết tinh DNA 12 3.8 Sự kết buộc 13 3.9 Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E coli 13 3.10 Chuẩn bị plasmid 14 3.11 Giải trình tự 14 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 4.1 Kết 15 4.1.1 Khuếch đại gen prion kỹ thuật PCR 15 4.1.2 Tinh đoạn PCR từ sản phẩm PCR 16 4.1.3 Gắn đoạn DNA vào véc tơ pGEM-T easy 17 4.1.4 Biến nạp vào vi khuẩn E coli 17 4.1.5 Giải trình tự sản phẩm 18 4.2 Thảo luận 18 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 20 5.1 Kết luận 20 5.2 Đề nghị 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 PHỤ LỤC 23 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp ampicillin BSE Bovine spongiform encephalopathy (Bệnh viêm não dạng xốp bò) bp base pair (cặp base) cDNA complementary deoxyribonucleic acid CJD Creutzfeldt-Jakob disease dNTP deoxynucleoside triphosphate DNA deoxyribonucleic acid E coli Escherichia coli EDTA ethylen diamine tetraacetic acid EtBr ethidium bromide g gram gDNA genome DNA (bộ gen) Kb kilobase LB Luria-Bertani-medium (môi trƣờng Luria-Bertani) M molar MBM meat and bone meal (bột xƣơng thịt) ml millilitre μl microlitre mM millimolar mRNA messenger ribonucleic acid NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia OIE The International Office for Epizootic Diseases Văn phòng quốc tế bệnh dịch PrP prion protein PrPc cellular prion protein PrPSc scrapie-associated prion protein Rpm round per minute (vòng/phút) viii TE Tris-HCl EDTA Tris Tris hydroxymethyl aminomethane TSE Transmissible Spongiform Encephalopathies UV ultraviolet V Volt vCJD variant Creutzfeldt-Jakob disease ix ... 5 2.3 Sự nhân dịng Khố luận bƣớc đầu q trình nghiên cứu nhóm nghiên cứu Hàn Quốc với mục tiêu thực nhân dòng giải mã đoạn gen prion giống bò Hanwoo (Bos taurus coreanae) Hàn Quốc Gen prion đƣợc... protein prion giống bò Hanwoo (Hàn Quốc) 1.3 Yêu cầu Thiết kế mồi phát gen prion thực phản ứng PCR Chuyển gen prion vào véc tơ pGEM-T easy, biến nạp véc tơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli Nhân dòng. .. dạng protein gây bệnh prion Bƣớc đầu nghiên cứu protein PrPsc, tiến hành nhân dịng giải trình tự gen prion Tách chiết DNA từ máu bò Hanwoo PCR để khuếch đại gen prion Gen prion đƣợc khuếch đại