Đang tải... (xem toàn văn)
Đánh giá tình trạng nhiễm Cucumber mosaic virus, tobacco mosaic virus, tomato spotted vild virus trên cây thuốc lá và cây đậu phộng tại tỉnh tây ninh bằng kỹ thuật elisa và chẩn đoán tobacco mosaic virus
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC …. … KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2002-2006 Sinh viên thực hiện: VĂN NGỌC DUNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC …. … KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực PGS TS BÙI CÁCH TUYẾN VĂN NGỌC DUNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 LỜI CẢM TẠ Con xin kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, người sinh thành, dưỡng dục để có ngày hơm Các em đã, chị chia sẻ vui buồn sống Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học tạo nhiều thuận lợi học tập cho em suốt bốn năm đại học Em xin cám ơn Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh Trường Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh anh chị Trung tâm tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em thời gian thực tập tốt nghiệp Vô biết ơn PGS TS Bùi Cách Tuyến tận tình hướng dẫn truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho em để em hồn tất khóa luận tốt nghiệp Trân trọng cám ơn TS Bùi Minh Trí Quý Thầy - Cơ ngồi trường hết lịng truyền đạt kiến thức bổ ích cho em suốt thời gian học tập Xin chân thành cảm ơn chị Hưng, chị Hà, anh Vũ, anh Trường, chị Hạnh, chị Dương sẵn lịng giúp đỡ để em hồn thành tốt khóa luận Cảm ơn bạn lớp Cơng Nghệ Sinh Học K28, niên khóa 2002 – 2006, đồng hành, động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập thực khóa luận TP Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006 Văn Ngọc Dung iii TÓM TẮT VĂN NGỌC DUNG Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 09/ 2006 “ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (ARACHIS HYPOGAEA L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR” Hội đồng hướng dẫn PGS TS BÙI CÁCH TUYẾN Đề tài thực huyện Tân Biên, huyện Bến Cầu, huyện Dương Minh Châu tỉnh Tây Ninh Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh, từ tháng 03/ 2006 đến tháng 08/ 2006 Nội dung tiến hành: Tìm hiểu mức độ nhiễm TMV, CMV TSWV thuốc đậu phộng tỉnh Tây Ninh Thu thập mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh địa bàn điều tra Tiến hành chẩn đoán kỹ thuật ELISA nhằm xác định mẫu dương tính với TMV, CMV TSWV Chọn mẫu dương tính với TMV thực RT – PCR, với mục đích xây dựng quy trình RT – PCR chẩn đốn TMV, nhằm khẳng định lại kết ELISA Kết thu được: Chưa phát TSWV thuốc đậu phộng huyện thu thập mẫu tỉnh Tây Ninh Thuốc Tây Ninh nhiễm TMV với tỷ lệ cao (69,1%) Trong đó, huyện Tân Biên nhiễm TMV chủ yếu (69,2%) Bến Cầu CMV (60,6%) Kỹ thuật RT – PCR bước đầu khuếch đại đoạn gen đặc trưng TMV với kích thước 1000 bp Điều cho thấy dòng TMV gây bệnh thuốc Việt Nam biến đổi so với dòng virus khác iv MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt x Danh sách hình xi Danh sách bảng xii Danh sách biểu đồ xiii MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – Yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu thuốc 2.1.1 Vị trí phân loại 2.1.2 Nguồn gốc phân bố 2.1.3 Đặc điểm di truyền 2.1.4 Đặc điểm hình thái 2.1.5 Đặc điểm trồng trọt 2.1.5.1 Yếu tố khí hậu 2.1.5.2 Yếu tố đất đai 2.1.5.3 Yếu tố sinh vật 2.1.6 Giá trị kinh tế sử dụng 2.2 Giới thiệu đậu phộng 2.2.1 Vị trí phân loại 2.2.2 Nguồn gốc phân bố v 2.2.3 Đặc điểm di truyền 2.2.4 Đặc điểm hình thái 2.2.5 Đặc điểm trồng trọt 2.2.5.1 Yếu tố khí hậu 2.2.5.2 Yếu tố đất đai 2.2.5.3 Yếu tố sinh vật 2.2.6 Giá trị kinh tế sử dụng 2.3 Một số bệnh thực vật virus gây 11 2.3.1 Sơ lược chung virus gây hại thực vật 11 2.3.1.1 Đặc điểm chung 11 2.3.1.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật 11 2.3.2 Một số bệnh virus khác gây hại thuốc 12 2.3.3 Một số bệnh virus khác gây hại đậu phộng 13 2.4 Giới thiệu Tomato Spotted Wilt Virus 14 2.4.1 Nguồn gốc lan truyền TSWV 15 2.4.2 Cấu trúc virus TSWV 15 2.4.3 Phân loại TSWV 15 2.4.4 Dãy ký chủ TSWV 16 2.4.5 Con đường truyền bệnh 16 2.4.6 Điều kiện phát triển bệnh 17 2.4.7 Triệu chứng bệnh nhiễm TSWV 17 2.4.8 Khống chế bệnh TSWV 20 2.5 Giới thiệu Tobacco Mosaic Virus 20 2.5.1 Nguồn gốc TMV 20 2.5.2 Cấu trúc virus TMV 21 2.5.3 Phân loại TMV 21 2.5.4 Dãy ký chủ TMV 21 2.5.5 Con đường truyền bệnh 21 2.5.6 Điều kiện phát triển bệnh 22 2.5.7 Triệu chứng bệnh nhiễm TMV 22 2.5.8 Khống chế bệnh TMV 24 vi 2.6 Giới thiệu Cucumber Mosaic Virus 24 2.6.1 Nguồn gốc CMV 24 2.6.2 Cấu trúc virus CMV 24 2.6.3 Phân loại CMV 24 2.6.4 Dãy ký chủ CMV 25 2.6.5 Con đường truyền bệnh 25 2.6.6 Điều kiện phát triển bệnh 26 2.6.7 Triệu chứng bệnh nhiễm CMV 27 2.6.8 Khống chế bệnh CMV 27 2.7 Phương pháp chẩn đoán bệnh virus gây 29 2.7.1 Phương pháp chẩn đốn kính hiển vi điện tử 29 2.7.2 Phương pháp chẩn đoán thị 29 2.7.3 Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng 29 2.8 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 30 2.8.1 Nguyên lý ELISA 30 2.8.2 Phân loại ELISA 30 2.8.2.1 ELISA trực tiếp 30 2.8.2.2 ELISA gián tiếp 30 2.8.2.3 Sandwich ELISA 31 2.8.3 Các yếu tố ảnh hưởng phản ứng ELISA 31 2.8.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết phản ứng ELISA 31 2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction) 31 2.9.1 Nguyên tắc 31 2.9.2 Ưu nhược điểm phản ứng PCR 33 2.10 RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) 34 2.10.1 Nguyên tắc 34 2.10.2 Phương pháp thực phản ứng tổng hợp cDNA 34 2.11 Một số kỹ thuật PCR khác 35 2.11.1 Kỹ thuật PCR đảo 35 2.11.2 Kỹ thuật NESTED – PCR 35 2.11.3 Kỹ thuật RACE (Rapia Amplification of cDNA Ends) 35 vii 2.12 Những nghiên cứu nước bệnh TMV, CMV, TSWV gây 36 2.13.1 Những nghiên cứu giới 36 2.13.2 Những nghiên cứu Việt Nam 36 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 37 3.2 Phương pháp lấy mẫu 37 3.3 Dụng cụ 37 3.4 Phương pháp chẩn đoán TMV, CMV TSWV dDAS – ELISA 38 3.4.1 Hóa chất 38 3.4.2 Phương pháp thực 38 3.4.2.1 Ly trích mẫu 38 3.4.2.2 Thực phản ứng ELISA 38 3.5 Phương pháp chẩn đoán TMV RT – PCR 40 3.5.1 Hóa chất 40 3.5.2 Phương pháp thực 41 3.5.2.1 Ly trích RNA 41 3.5.2.2 Khuếch đại RT – PCR 42 3.5.2.3 Đổ gel điện di 43 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 4.1 Chẩn đoán kỹ thuật ELISA 45 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TSWV đậu phộng huyện Dương Minh Châu Bến Cầu 45 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV TSWV thuốc thu thập huyện Tân Biên Bến Cầu 46 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm CMV thuốc huyện Tân Biên Bến Cầu 47 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV thuốc huyện Tân Biên Bến Cầu 48 4.1.5 Tỷ lệ nhiễm CMV hay nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp CMV TMV số mẫu thu thập 50 4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát thuốc 51 4.2 Kết RT – PCR 55 viii KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC 63 ix 51 4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc thuốc Sau so sánh kết chẩn đoán phương pháp ELISA triệu chứng thuốc quan sát đồng ruộng, tỷ lệ thuốc nhiễm bệnh thể qua Bảng 4.6 Biểu đồ 4.5 Bảng 4.6 Tỷ lệ thuốc nhiễm bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc Triệu chứng Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%) Lá dày, phồng rộp (TC1) 25 Lá có khảm xanh – vàng (TC2) 55 70 78,6 Lá khảm nặng, hoại tử (TC3) 10 25 40 Chú thích: (+) : Dương tính TC1: Triệu chứng [Hình 4.12 (D) 4.13 (B)] TC2: Triệu chứng [Hình 4.12 (C)] TC3: Triệu chứng [Hình 4.13 (C) 4.13 (D)] 80 70 Tỷ lệ % 60 50 40 Mẫu dương tính 30 20 10 TC1 TC2 TC3 Triệu chứng Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ thuốc nhiễm bệnh theo triệu chứng Từ tỷ lệ cho phép nhận định: Các thuốc có triệu chứng khảm xanh – vàng (TC2) có khả nhiễm CMV TMV (78,6%) cao Một số thuốc có biểu triệu chứng khác như: Cây lùn, còi cọc so với khác (tất trồng lúc điều kiện canh tác nhau) Hình 4.13 (E) Nhưng tất có thay đổi hình thái vừa nêu mang hay tất triệu chứng xét Bảng 4.6 Vì vậy, nói 52 việc thu thập mẫu thuốc nhiễm CMV, TMV dựa vào triệu chứng biểu dễ dàng thu thập theo triệu chứng khác Bên cạnh đó, có số thuốc có mang triệu chứng trên, lại khơng cho kết dương tính tiến hành kiểm tra kỹ thuật ELISA Điều này, lần khẳng định việc xác định nhiễm virus mà dựa vào triệu chứng biểu khơng hồn tồn xác Trong q trình điều tra, thu thập mẫu, chúng tơi thấy có triệu chứng cong thuốc lá, triệu chứng đặc trưng TSWV gây Tuy nhiên, mẫu này, sau dùng kỹ thuật ELISA để chẩn đốn khơng cho kết dương tính Có lẽ, số lượng TSWV q ít, khơng đủ để biểu thành phản ứng dương tính Trong nghiên cứu này, chưa xác định tỷ lệ nhiễm bệnh giống thuốc Vì bà nông dân đa số biết mua giống công ty thôi, không quan tâm đến giống thuốc trồng Một lý nữa, chưa có điều kiện để đánh giá tình trạng nhiễm CMV, TMV TSWV thuốc trồng nhà lưới (ngăn cách bọ trĩ, rệp thuốc mang virus tới lây nhiễm cho cây) thuốc trồng vườn Tổng Công ty Thuốc tỉnh Tây Ninh, nên nghiên cứu thực cánh đồng trồng thuốc hộ gia đình Vì thế, chúng tơi chưa khảo sát tỷ lệ nhiễm virus thuốc trồng tự nhiên trồng điều kiện cách ly với côn trùng môi giới truyền bệnh 53 (A) (C) (B) (D) Hình 4.12: Hình chụp thuốc khỏe bệnh huyện Bến Cầu (2006) (A): Cây thuốc khỏe (B), (C), (D): Triệu chứng thuốc nhiễm virus TMV 54 (A) (B) (C) (D) (E) (F) Hình 4.13: Hình chụp thuốc khỏe bệnh huyện Tân Biên (2006) (A): Cây thuốc khỏe (B), (C), (D), (E), (F): Triệu chứng nhiễm virus CMV TMV 55 4.2 Kết RT – PCR Sau có kết chẩn đốn kỹ thuật ELISA, chọn mẫu dương tính mạnh với TMV tiến hành chẩn đoán kỹ thuật RT – PCR Tiến hành ly trích RNA tổng số (80 µl) từ thuốc kit ly trích AurumTM Total RNA Mini Kit Bio – Rad cung cấp Thực phản ứng tổng hợp cDNA (20 µl) với kit iScript TM cDNA Synthesis Kit Bio – Rad cung cấp Kết RT – PCR thu có thành phần hóa chất chu trình nhiệt sau: Bước 1: Tổng hợp cDNA Thành phần hóa chất: 5X iScript Reaction Mix μl iScript Reverse Transcriptase μl 13 μl Nuclease free water RNA tổng số μl Tổng thể tích 20 μl Chu trình nhiệt: phút 25oC 40 phút 42oC phút 85oC Giữ 4oC Bước 2: Khuếch đại cDNA PCR Thể tích Nồng độ cuối μl 1X MgCl2 2,5 μl 2,5 mM dNTP 1μl 200 µM 0,5 μl 0,5 μl primer F µl 0,4 μM primer R µl 0,4 μM iTaq buffer 10X iTaq DNA polymerase Nuclease free water cDNA Tổng thể tích 34 µl 5µl 50 μl 56 Chu trình nhiệt: chu kỳ phút 94oC 35 chu kỳ phút 94oC phút 57oC phút 15 giây 72oC chu kỳ phút 72oC Giữ 4oC 10 phút Đổ gel điện di sản phẩm PCR Gel agarose có nồng độ 1,5%, tiến hành điện di với hiệu điện 50 V, cường độ dòng điện 245 mA, vòng 60 phút Ngâm EtBr vòng 20 phút Kết điện di 1000 bp Hình 4.14 Kết điện di sản phẩm PCR thuốc nhiễm TMV huyện Tân Biên La : Thang chuẩn 1000 bp 1, 2, : Sản phẩm PCR mẫu 22, 26, 42 Sản phẩm PCR Hình 4.14 có kích thước khoảng 1000 bp 57 1000 bp Hình 4.15 Kết điện di sản phẩm PCR thuốc nhiễm TMV huyện Bến Cầu La : Thang chuẩn 1000 bp 4, 5, : Sản phẩm PCR mẫu 53, 54, 62 Sản phẩm PCR Hình 4.15 có kích thước khoảng 1000 bp Kết điện di Hình 4.14 Hình 4.15 cho thấy sản phẩm PCR thu có kích thước khoảng 1000 bp thay 921 bp Tuy kết không với lý thuyết sản phẩm có kích thước gần với kích thước lý thuyết Các mẫu 22, 26, 42 (thu thập huyện Tân Biên) mẫu 53, 54, 62 (thu thập huyện Bến Cầu) mẫu cho kết dương tính với TMV rõ chẩn đoán kỹ thuật ELISA Các mẫu sau tiến hành RT – PCR sản phẩm PCR thu có kích thước khoảng 1000 bp Năm 2005, Lâm Ngọc Hạnh, Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh tiến hành chẩn đoán TMV cà chua tỉnh Lâm Đồng phương pháp RT – PCR., với cặp mồi sử dụng Kết sản phẩm PCR thu có kích thước khoảng 1000 bp Điều chứng minh rằng: Có diện TMV mẫu thuốc thu thập Thuốc huyện Tân Biên Bến Cầu tỉnh Tây Ninh nhiễm mơt dịng TMV 58 Như vậy, bước đầu kết luận, Việt Nam, cà chua thuốc nhiễm dịng TMV Tuy nhiên, dịng virus lại có khác biệt với dòng virus dùng để thiết kế cặp mồi Vậy câu hỏi đặt là: Dòng TMV Việt Nam biến đổi so với dịng virus khác? Phải cặp primer thiết kế dựa dòng TMV Trung Quốc, khuếch đại đoạn có kích thước 921 bp TMV nhiễm bệnh Trung Quốc Nhưng sản phẩm PCR thu có kích thước khoảng 1000 bp, điều giải thích dịng TMV Việt Nam có biến đổi cấu trúc Sự biến đổi xảy thay đổi địa lý, khí hậu nước, nên TMV biến đổi cho phù hợp với điều kiện ngoại cảnh Việt Nam Trong nghiên cứu này, chưa có điều kiện chẩn đốn TMV gây bệnh loài khác chưa giải trình tự đoạn sản phẩm PCR thu nên chúng tơi chưa trả lời xác câu hỏi 59 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau tiến hành chẩn đoán TMV, CMV TSWV mẫu thuốc đậu phộng huyện Tân Biên, Bến Cầu, Dương Minh Châu thuộc tỉnh Tây Ninh, thu kết sau: Thuốc đậu phộng địa bàn điều tra, vào thời điểm điều tra, chưa có biểu việc nhiễm TSWV Dịch bệnh virus thuốc tỉnh Tây Ninh vào thời điểm nghiên cứu chủ yếu TMV gây nên (69,1%) Thuốc trồng huyện Tân Biên có tỷ lệ nhiễm CMV (60,6%) TMV (69,2%) cao Thuốc trồng huyện Bến Cầu nhiễm TMV chủ yếu (68,8%) Bước đầu chẩn đoán diện TMV thuốc trồng tỉnh Tây Ninh kỹ thuật RT – PCR 5.2 Đề nghị Với trở ngại nghi vấn trình nghiên cứu bệnh virus thuốc đậu phộng, chúng tơi có số đề nghị sau: Tiếp tục theo dõi mức độ nhiễm TSWV thuốc đậu phộng thời điểm khác vùng khác tỉnh Tây Ninh Nghiên cứu thêm mức độ lây nhiễm, điều kiện phát triển, biện pháp phòng trừ bệnh TMV, CMV TSWV thuốc đậu phộng nhằm hạn chế thiệt hại dịch bệnh xảy Tiến hành ly trích thu RNA phương pháp siêu ly tâm khuynh độ đường để so sánh với quy trình ly trích kit Thực việc chẩn đoán TMV kỹ thuật RT – PCR loại khác, ký chủ TMV, góp phần xác định rõ dịng TMV Việt Nam Giải trình tự đoạn sản phẩm PCR để bổ sung vào ngân hàng liệu gen virus Việt Nam hỗ trợ cho nghiên cứu sâu 60 Phần TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Ngọc Bích, 2003 Bước đầu nghiên cứu số bệnh virus vùng thuốc tỉnh Tây Ninh Luận văn thạc sĩ khoa học Nơng nghiệp, Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005 Sinh học phân tử, tái lần thứ Nhà xuất giáo dục, trang 190 – 198, 200 – 206 Lâm Ngọc Hạnh, 2005 Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus Tomato Spotted Wilt Virus) cà chua tỉnh Lâm Đồng kỹ thuật ELISA bước đầu xây dựng trình chẩn đoán Tobacco Mosaic Virus kỹ thuật RT – PCR Khóa luận tốt nghiệp Ngành Cơng nghệ sinh học, Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh Vũ Cơng Hậu, Ngô Thế Dân, Trần Thị Dung, 1995 Cây lạc Nhà xuất Nông nghiệp, trang 199 – 223, 318 – 368 Phạm Hoàng Hộ, 1993 Cây cỏ Việt Nam Nhà xuất Trẻ, 2, tập 2, trang 968 PGS TS Nguyễn Thị Lang, GS TS Bùi Chí Bửu, 2005 Sinh học phân tử Giới thiệu ứng dụng Nhà xuất Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh, trang 87 – 98 ThS Võ Thị Thu Oanh, 2002 Bệnh đại cương Bộ môn Bảo vệ thực vật Khoa Nông học Trường Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh, trang 47 – 53 Lê Đình Thụy, Phạm Kiến Nghiệp, 1996 Thuốc – Trồng chế biến Nhà xuất TP Hồ Chí Minh, trang 14 – 17, 42 – 48, 77 – 84 Nguyễn Đình Trường, 2005 Nghiên cứu trạng nhiễm bệnh TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) ớt kỹ thuật ELISA bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đốn kỹ thuật RT – PCR Khóa luận tốt nghiệp Ngành Công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh 61 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 10 Antigus, M Lapidot, N Ganaim, J Cohen, O Lachman, M Pearlsman, B Raccah and A Gera, 1997 Biological and Molecular Characterization of Tomato Spotted Wilt Virus in Israel Phytoparasitica 25 (4), page 319 – 330 11 John R Crowther, the International Atomic Agency, Vienna, Australia, 2001 The ELISA Guidebook, volume 149 Human Press, New Yersey, page 11 – 21 12 Karen Delahaut, UW – Madison IPM Program, February 2002 Onion thrips University of Wisconsin – Extension 13 R T V Fox, School of Plant Sciences, University of Reading, UK, 1993 Principles of Diagnostic Techniques in Plant Pathology Cab International, Wallingford, Oxon OX1KDE UK, page 129 – 138 14 Natalie P Goldberg, Extension PlantPathologist, 2005 Tomato Spotted Wilt Virus Guide H – 242 Cooperative Extension Service, College of Agriculture and Home Economic, New Mexico State University 15 Tom Kucharek et al, March 2002 Tomato Spotted Wilt Virus of Agronomic, Vegetable and Ornamental Crops Circ – 0914 16 Georgia P Love, Agricultural Extension Agent, Roberson County Center of the North Carolina Cooperative Extension Service, May 2004 Tomato Spotted Wilt Virus 17 C L Madahar, Botary Departmbent, Panjab University, India, 1999 Molercular Biology of Plant viruses Kluwer Acadimic Publishers Printed in the United State of American, page 78 – 79 18 M J McPherson, School of Biochemistry and Molercular Biology, University of Leeds, Leed, UK and S G Moller, Laboratory of Plant Molecular Biology, Rockefeller University, NewYork, USA, 2001 PCR BIOS Scientific Publishers Ltd, Newtwc Place, Magdulen Road, Oxford OX4 dRE, UK, 276 pages 19 M Murakami, M Gallo – Meagher, D W Gorbet, R L Meagher, March 2006 Utilizing immuoassays to determine systemic tomato spotted wilt virus infection for elucidating field resistance in peanut Crop Protection, volume 25, issue ISSN 0261 – 2194 20 Scott C Ockey M S., Senior Research Associate and Sherman V Thomson Ph D., Extension Plant Pathologist Emeritus Tomato Spotted Wilt Virus Exotic Pest Monitoring Series EPMS 007 62 21 Sambrook and Russell Molecular Cloning, 2001 A laboratory manual, third edition, volume Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold spring Harbor, NewYork, page 8.46 – 8.61 22 Sherwood, J L., German, T L., Moyer, J W and D E Ullman, 2003 Tomato Spotted Wilt The Plant Health Instructor DO1: 10.1094/PHI - - 2003 - 0163 - 02 < http://www.apsnet.org/education/LessonsPlantPath/TomatoSpottedWilt/ > 23 Dr Ken Whitman, LSU Plant Pathologist, 27 September 2004 Tomato Spotted Wilt Virus, volume 04 No 9, page 24 Plant Pathology Teacher Workshop, University of Georgia Department of Plant Pathology, 2001 Tomato Spotted Wilt Virus in Peanuts TÀI LIỆU TỪ INTERNET 25 < http://www.apsnet.org/tobaco/index.html > 26 < http://www.biologie.uni-hamburg.de/lehre/bza/e2tmve.htm > 27 < http://www.ces.ncsu.edu/depts/pp/notes/oldnotes/tb1.htm > 28 < http://www.godot.ncgr.org/ww/Vol2/german.html > 29 < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/Blast.cgi > 30 < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTBdB/71010001.htm > 31 < http://www.oznet.csu.edu/dp_hfrr/extensn/problems/cucmsaic.htm > 32 < http://www.peanutsusa.org.uk/index.cfm?fuseaction=homepage&pid=64 > 33 < http://www.tomatospottedwiltinfo.org/tobaco/index/ > 34 35 36 < http://www.sac.cpes.peachnet.edu/spottedwilt > 63 Phụ lục HÌNH KẾT QUẢ ELISA TEST VIRUS TSWV Các giếng D2, E2 Đĩa 1, Đĩa 2, Đĩa 3, Đĩa Đĩa giếng đối chứng dương: Màu vàng Các giếng C11 Đĩa F8 Đĩa 3: Màu vàng giống đối chứng dương nhiễm từ chất tạo màu 64 Phụ lục BẢNG MẪU ĐIỀU TRA Mã số Nơi lấy mẫu Chủ hộ Giống Tuổi Tình trạng vườn Cách trồng Phương pháp trồng Diện tích trồng Năng suất Độ vườn Có vectơ truyền bệnh hay không Mùa vụ Bệnh có thường xảy khơng Triệu chứng 65 ... “ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (ARACHIS HYPOGAEA L.) TẠI TỈNH TÂY NINH. .. TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT... tài: ? ?Đánh giá tình trạng nhiễm Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus, Tomato Spotted Wilt Virus thuốc (Nicotiana tabacum L.) đậu phộng (Arachis hypogaea L.) tỉnh Tây Ninh kỹ thuật ELISA chẩn
