Đang tải... (xem toàn văn)
Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật Rapd
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHƢỚC DOANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng / 2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******************* BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS BÙI MINH TRÍ NGUYỄN PHƢỚC DOANH Niên khóa: 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng / 2007 LỜI CẢM TẠ Con muốn hôn lên đôi vầng trán nhiều nếp nhăn Cha Mẹ để bày tỏ lòng yêu thƣơng với ngƣời Suốt đời xin khắc ghi công ơn sinh thành, dƣỡng dục Cha Mẹ nuôi dƣỡng khôn lớn cho ăn học nên ngƣời Con muốn Cha Mẹ biết yêu Cha Mẹ nhiều lắm, ln tự hào Cha Mẹ Con xin chân thành biết ơn ngƣời thân u gia đình ln động viên tạo điều kiện cho ăn học đến ngày hơm Em xin gởi lịng biết ơn đến: Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Ban Chủ nhiệm Thầy, Cơ Bộ môn Công nghệ sinh học Ban quản lý Rừng phịng hộ Cần Giờ, anh Bình, anh Kiệt thuộc phòng kỹ thuật tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho phép em thực đề tài Em xin đặc biệt gởi lòng biết ơn tri ân sâu sắc đến Thầy - Tiến sỹ Bùi Minh Trí – giáo viên hƣớng dẫn, nhiệt tình dẫn, giúp đỡ truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý giá nghiên cứu nhƣ sống, giúp em hoàn thành đề tài ứng dụng nhiều thời gian tới Và cảm ơn đến anh chị cơng tác Trung tâm phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại học Nông Lâm: chị Hƣng, chị Dung, chị Liên, anh Khoa, anh Phƣơng, anh Vũ…cùng bạn sinh viên Công nghệ sinh học K29 thƣơng yêu, chia nhiều buồn vui, động viên, giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Xin chân thành cảm ơn ! NGUYỄN PHƢỚC DOANH iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN NGUYỄN PHƢỚC DOANH, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Đề tài “BƢỚC ĐẦU HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD” đƣợc tiến hành Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007 Mắm trắng loài ngập mặn thực sự, giữ nhiều vai trị quan trọng có phân bố rộng khu dự trữ sinh Cần Giờ Tuy nhiên, trải qua hoạt động khai thác ngƣời, quần thể mắm trắng ngày thối hóa suy giảm diện tích nghiêm trọng Vì vậy, nghiên cứu đa dạng di truyền trở nên cần thiết để cung cấp thông tin cho việc thiết lập chiến lƣợc tái tạo phục hồi đa dạng sinh học hệ sinh thái Những kết đạt đƣợc: Thu đƣợc 50 mẫu mắm trắng có tính chất đại diện cao cho quần thể Tối ƣu quy trình ly trích DNA, thu nhận DNA chất lƣợng cao đáp ứng yêu cầu nghiên cứu Sinh học phân tử Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho mắm trắng, sử dụng primer OPAC10 Với 14 mẫu DNA phân tích thu đƣợc tổng cộng 49 băng, trung bình 3,5 băng cho mẫu Có băng đa hình kích thƣớc 450 bp, 390 bp, 330 bp, 300 bp,100 bp, 50 bp băng đồng hình kích thƣớc 200bp Kết thực phản ứng RAPD đƣợc xử lý mần mềm NTSYS thu đƣợc phân loài đem phân tích Cây phân lồi cho thấy số đồng dạng di truyền cao từ 0,55 – Điều có nghĩa đa dạng di truyền quần thể mắm trắng khu dự trữ sinh Cần Giờ mức thấp cần đặc biệt ý đến công tác bảo tồn, phục hồi đa dạng di truyền mắm trắng đa dạng sinh học rừng Cần Giờ, đáp ứng mục tiêu phát triển bền vững rừng thời gian tới iv SUMMARY NGUYEN PHUOC DOANH, Nong Lam university “PREMILINARY RESEACH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Avicennia alba IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA USING RAPD” This thesis was carried out at Chemical & Biological Analysis And Experiment Center, Nong Lam university from April to August 2007 Avicennia alba is an important true mangrove species because of it’s large distribution, especially in Can Gio Mangrove Biosphere Reserve Area However, over – exploitation by human activities has induced to a steady decline and degraduation Studies on population genetics are necessary to provide basic information for establishing the strategies for conserving and recovering biodeversity of the ecosystem The obtained results were: Fifty of Avicennia alba leaf samples were collected The genome DNA isolation protocol was improved to get high quality DNA The RAPD – PCR procedure was developed and optimized suitable for Avicennia alba using primer OPAC10 Totally 49 amplicons were generated with an average of 3,5 applicons per individual There were only one isomorphic băng (200 bps) and six polymorphic băngs (50 bps, 100 bps, 300 bps, 330 bps, 390 bps, and 450 bps) A phylogenic tree was drawn by using NTSYS sofware based on RAPD results This phylogenic shown a high coefficient similarity from 0.55 to in 14 analized samples It suggested that the genetic diversity of Avicennia alba population is relatively poor So, strategies for conserving and recovering their genetic diversity in Can Gio biodiversity is urgently needed v MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi Phần GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu 1.4 Giới hạn đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu khu dự trữ sinh Cần Giờ 2.1.1 Đặc điểm tự nhiên 2.1.2 Cấu trúc 2.1.3 Các tiềm rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.4 Vai trò khu dự trữ sinh 2.1.5 Các nguy đe dọa rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2 Giới thiệu mắm trắng (Avicennia alba) 10 2.2.1 Vùng phân bố 10 2.2.2 Hình thái học mắm trắng 11 2.2.3 Giá trị kinh tế mắm trắng 13 2.2.4 Những trạng mắm trắng rừng ngập mặn Cần Giờ 13 2.2.5 Những nghiên cứu khoa học mắm trắng 14 vi 2.3 Khái niệm đa dạng di truyền 14 2.3.1 Đa dạng sinh học 14 2.3.2 Ý nghĩa tầm quan trọng đa dạng sinh học 14 2.3.3 Các phân mức đa dạng sinh học 15 2.3.3.1 Đa dạng hệ sinh thái 15 2.3.3.2 Đa dạng loài 15 2.3.3.3 Đa dạng di truyền 16 2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học Việt Nam 17 2.4 Phƣơng pháp chiết tách DNA thực vật 18 2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR) 19 2.5.1 Khái niệm 19 2.5.2 Thành phần vai trò chất phản ứng PCR 19 2.5.3 Nguyên tắc phản ứng PCR 20 2.5.4 Ứng dụng kỹ thuật PCR 21 2.5.5 Ƣu nhƣợc điểm kỹ thuật PCR 21 2.6 Các thị phân tử dùng nghiên cứu tính đa dạng di truyền 22 2.6.1 Nhóm không dựa PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 22 2.6.2 Nhóm dựa PCR 23 2.6.2.1 SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) 23 2.6.2.2 Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat) 24 2.6.2.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 25 2.6.2.4 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 30 Phần VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 33 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành 33 3.1.1 Thời gian tiến hành 33 3.1.2 Địa điểm 33 3.2 Vật liệu nghiên cứu 33 3.2.1 Mẫu thực vật 33 vii 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 34 3.2.2.1 Hóa chất dùng ly trích DNA 34 3.2.2.2 Hóa chất dùng kiểm tra DNA 35 3.2.2.3 Hóa chất dùng để thực phản ứng RAPD 36 3.2.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 36 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 37 3.3.1 Phƣơng pháp ly trích DNA 37 3.3.2 Kiểm tra DNA ly trích 39 3.3.2.1 Kiểm tra định tính DNA phƣơng pháp điện di gel 39 3.3.2.2 Kiểm tra định lƣợng DNA quang phổ kế 39 3.3.3 Thực kỹ thuật RAPD 40 3.3.4 Phân tích số liệu phần mềm NTSYSpc2.1 42 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Kết thu thập mẫu mắm trắng khu dự trữ sinh Cần Giờ 43 4.2 Kết trình bảo quản mẫu 44 4.3 Kết q trình ly trích DNA tổng số 44 4.4 Kết trình thực phản ứng RAPD 47 4.4.1 Kết thí nghiệm 47 4.4.2 Kết thí nghiệm 50 4.5 Đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền mắm trắng khu dự trữ sinh Cần Giờ 50 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Đề nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC viii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD nghiệm thức 40 Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD nghiệm thức 40 Bảng 3.3 Thành phần hóa chất phản ứng RAPD nghiệm thức 41 Bảng 3.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD nghiệm thức 41 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 4.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 47 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Hình 2.2 Cây mắm trắng khu dự trữ sinh Cần Giờ 11 Hình 2.3 Lá hoa mắm trắng 12 Hình 2.4 Trái mắm trắng 12 Hình 2.5 Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR 20 Hình 2.6 Cơ chế cắt enzyme MseI EcoRI 26 Hình 2.7 Cơ chế gắn adapter MseI adapter EcoRI 26 Hình 2.8 Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc phản ứng AFLP 27 Hình 2.9 Cơ chế khuếch đại chọn lọc phản ứng AFLP 28 Hình 2.10 Cơ chế phản ứng kỹ thuật AFLP 29 Hình 2.11 Sự bắt cặp khuếch đại phản ứng RAPD – PCR 30 Hình 4.1 Sơ đồ vị trí lấy mẫu Khu Dự trữ sinh Cần Giờ 43 Hình 4.2 Kết ly trích theo quy trình quy trình 45 Hình 4.3 Kết ly trích theo quy trình 45 Hình 4.4 Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích tối ƣu 46 Hình 4.5 Kết ly trích theo quy trình 46 Hình 4.6 Kết thực phản ứng RAPD nghiệm thức 48 Hình 4.7 Kết thực phản ứng RAPD nghiệm thức 48 Hình 4.8 Sản phẩm RAPD với primer mắm đen (Avicennia officinalis) 49 Hình 4.9 Sản phẩm RAPD thí nghiệm mắm trắng 50 Hình 4.10 Kết thực RAPD mắm trắng 51 Hình 4.11 Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích 52 x ... Minh Đề tài “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD? ?? đƣợc tiến hành... thực đề tài: “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD? ?? 1.2 Mục đích ... TRANG Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Hình 2.2 Cây mắm trắng khu dự trữ sinh Cần Giờ 11 Hình 2.3 Lá hoa mắm trắng 12 Hình 2.4 Trái mắm trắng 12
