Đang tải... (xem toàn văn)
Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP
1 Chƣơng GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Trong năm gần đây, điều (Anacardium occidental L.) trở thành cơng nghiệp mạnh, có giá trị kinh tế – xã hội cao nước ta Hằng năm, doanh thu từ điều đem cho nước ta hàng trăm triệu USD, trở thành nước xuất nhân điều đứng thứ giới, vượt qua Ấn Độ, đứng sau Brazil [4] Bên cạnh đó, việc canh tác điều cịn giúp nước ta giải vấn đề xã hội khác như: phủ xanh đất trống đồi trọc, giải việc làm, đem lại thu nhập ổn định cho người nông dân vùng đất khô cằn, bạc màu,…Nước ta nằm vùng có khí hậu thuận lợi có diện tích lớn đất phù hợp cho phát triển điều, có tiềm lớn để phát triển mạnh điều Tuy nhiên tình hình canh tác điều nước ta nói chung tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu nói riêng khơng đạt tương xứng tiềm năng, suất bình qn cịn thấp, khơng đồng khơng ổn định chất lượng sản lượng, bắt nguồn từ việc phát triển điều cách tự phát, không đầu tư nghiên cứu nghiêm túc, đặc biệt nghiên cứu giống điều kỹ thuật canh tác Để đề chiến lược toàn diện phát triển điều, điều qua trọng cần phải đầu tư cho công tác lai tạo, bảo tồn phổ biến giống điều có chất lượng vượt trội so với giống có Muốn trước hết phải đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể điều có Xuất phát từ u cầu đó, phân cơng Bộ môn Công Nghệ Sinh Học–Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, hướng dẫn thầy TS Bùi Minh Trí, chúng tơi thực đề tài: “Bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể điều (Anacardium occidental L.) tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu kỹ thuật RAPD AFLP” 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu Thông qua kỹ thuật RAPD đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền nhận diện thị phân tử quần thể điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Xây dựng quy trình tiến hành kỹ thuật AFLP điều, làm sở cho việc áp dụng kỹ thuật AFLP vào nghiên cứu sâu rộng tính đa dạng di truyền nhận diện thị phân tử điều đối tượng nghiên cứu khác sau 1.2.2 Yêu cầu Thu thập mẫu điều có đặc điểm bật điển hình dựa kiểu hình như: khả chịu hạn tốt hay không tốt, suất chất lượng hạt cao hay thấp, có tính đề kháng với sâu bệnh cao hay thấp, hoa sớm hay muộn,… Ly trích DNA có chất lượng tốt từ mẫu thu (được bảo quản lạnh) làm nguyên liệu cho kỹ thuật RAPD AFLP Thực thành cơng kỹ thuật RAPD từ đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền quần thể điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, đồng thời nhận diện số đoạn DNA sử dụng thị phân tử liên quan đến tính trạng đáng quan tâm Thực kỹ thuật AFLP số mẫu DNA có chất lượng tốt, từ lựa chọn vài tổ hợp primer nhân chọn lọc thích hợp cho việc áp dụng kỹ thuật AFLP điều 1.3 Hạn chế đề tài Những nghiên cứu phân loại giống điều Việt Nam chưa thiết lập, đồng thời khó có khả nhận diện giống thực tế vườn nông hộ nên thực lấy mẫu điều có đặc điểm bật điển hình, khơng dựa đặc điểm phân loại giống Khơng có đủ điều kiện để thu thập lượng mẫu lớn Khơng có đủ điều kiện để thực phản ứng PCR – RAPD với nhiều primer tìm quy trình PCR – RAPD tối ưu Khơng có điều kiện để tiến hành kỹ thuật AFLP nhiều mẫu với nhiều tổ hợp primer chi phí thực cao Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung điều 2.1.1 Nguồn gốc điều Cây điều có tên khoa học Anacardium occidentale L Cây điều có nguồn gốc Brazil Người Bồ Đào Nha người mang điều từ Brazil sang trồng châu Á châu Phi công mở rộng thuộc địa họ Điều kiện tự nhiên châu Á phù hợp cho phát triển điều Ngày điều trải rộng ranh giới vĩ tuyến 25o Bắc 25o Nam Trước kia, điều trồng chủ yếu để che phủ đất, chống xói mịn,…Mãi đến tận đầu kỷ 20 nhân điều thực trở thành nơng sản có giá trị tồn giới [2][3] 2.1.2 Đặc điểm thực vật học điều Cây điều loài thân mộc vùng nhiệt đới, sống lâu năm (đến khoảng 30 – 40 năm hay cao hơn), chịu hạn tốt, sinh trưởng phát triển vùng đất khô cằn, bạc màu mà lương thực khác khó sống 2.1.2.1 Thân cành Thân thường cao khoảng – m, nơi đất tốt đến 10 – 12 m, đường kính vịng thân đạt 40 – 50 cm Chiều cao thân có liên hệ mật thiết với mật độ trồng Nếu trồng với mật độ dày, thân tăng trưởng chiều cao mạnh cành nhánh nhỏ ngắn, thưa thớt, cho nhiều hoa trái Thông thường khoảng cách trồng phổ biến khoảng – 10 m Tán điều rộng, trung bình khoảng 10 m, có đạt 20 m [2] 2.1.2.2 Hệ rễ Cây điều có rễ cọc rễ ngang Ở vùng đất khô, mạch nước ngầm thấp, rễ cọc đâm xuống sâu để hút nước, điều có khả chịu hạn cao vững Rễ cọc điều tuổi sâu khoảng m Hệ thống rễ ngang mọc cách mặt đất khoảng 12 cm 2.1.2.3 Lá Lá điều thuộc loại đơn, ngun Lá thường có dạng thn hay hình trứng, thường trịn Lá non có màu xanh hay đỏ tía tùy giống, già có màu xanh thẫm Theo Rao Hassan (1957), thời gian trung bình từ non đến trưởng thành khoảng 20 ngày [3] 2.1.2.4 Hoa điều Hoa điều nhỏ, đài hợp, có năm cánh rời Khi nở cánh hoa có màu trắng hay vàng có sọc đỏ, sau chuyển thành màu hồng sẫm Hoa điều có hai loại: hoa đực hoa lưỡng tính Hoa đực gồm tồn nhị đực, hoa lưỡng tính có khoảng – 12 nhị đực có nhụy Nhụy gồm bầu nỗn nằm vòi dài (dài mập nhị đực) Theo Copeland (1961), bầu noãn chứa noãn nhất, thụ tinh phát triển thành hạt điều [2] Hoa điều mọc thành chùm có từ vài chục đến – trăm hoa, gồm hoa đực hoa lưỡng tính, hoa đực chiếm tỉ lệ cao, cịn hoa lưỡng tính dao động từ – 30 % tổng số hoa chùm Số hoa lưỡng tính đậu tới chín cho thu hoạch khoảng 10 % Những chùm hoa đầu cuối vụ thường nhiều hoa đực, chùm hoa vụ có tỉ lệ hoa lưỡng tính cao Tỉ lệ hoa lưỡng tính cịn tùy thuộc vào khác vườn Bình qn tỉ lệ hoa lưỡng tính chùm khoảng 12 – 15 % [3] Mùa hoa điều nở mùa khô Hoa điều thường nở từ tháng 11 kéo dài đến tận tháng năm sau, nhiên hoa nở rộ tháng – tháng Sự nở hoa có liên hệ mật thiết với nhiệt độ mơi trường Có chênh lệch thời điểm nở hoa, với hoa chùm Hoa điều nở từ sáng sớm tới trưa, sau bắt đầu héo Sau thụ phấn xong, trình thụ tinh bắt đầu: hạt phấn nảy nầm đầu núm nhụy đưa tinh tử xuyên qua vòi nhụy vào bầu noãn để thụ tinh cho tế bào trứng Thụ tinh xong bắt đầu trình hình thành phát triển hạt điều Quả điều thật phần mà ta hay gọi hạt, phần gọi thực phần cuống phình to ra, gọi giả Hạt điều phát triển trước nhanh giả gần cuống Khi hạt điều tăng trưởng đến kích thước tối đa, có hình thành đầy đủ phận, bước vào giai đoạn chín lúc giả tăng trưởng mạnh [2] Hạt điều có hình dạng giống thận, non có màu xanh, chín khơ chuyển qua màu nâu xám xám hồng Hạt điều nước ta thường dài 2,6 – 3,1 cm, dày 1,2 – 1,7 cm, nặng khoảng – g Cấu tạo hạt điều gồm phần rõ rệt: Phần vỏ cứng: chiếm khoảng 60 % – 70 % trọng lượng hạt điều, phần dầu vỏ hạt chiếm 20 % – 22 % trọng lượng hạt Phần giữa: lớp vỏ lụa, lúc cịn non đóng vai trị cung cấp chất dinh dưỡng ni hạt, chín teo lại, chiếm khoảng % trọng lượng hạt Phần cùng: nhân hạt điều, phơi hạt có đầy đủ chồi mầm, thân mầm rễ mầm Bộ phận có kích thước lớn phơi hai mầm có chứa nhiều chất dinh dưỡng để nuôi mầm mọc [3] Sau thụ tinh xong hoa điều lưỡng tính phát triển thành giả hạt chín Có nhiều hạt giả chưa kịp chín rụng, gọi tượng rụng trái non Tỉ lệ rụng trái non phụ thuộc vào cây, vụ, nhiều nguyên nhân khác như: di truyền, thời tiết bất thường, sâu bệnh, đất khô úng lầy, thiếu hụt chất dinh dưỡng nghiêm trọng Sau trồng khoảng – năm, điều bắt đầu hoa kết trái Năng suất vườn, năm, vườn điều với thường khác nhau, phụ thuộc chủ yếu vào giống, kỹ thuật trồng thời tiết Năng suất hạt điều trung bình nước ta khoảng 1,1 tấn/ha [4] 2.1.3 Đặc điểm sinh thái điều 2.1.3.1 Khí hậu Các yếu tố thuận lợi cho sinh trưởng phát triển điều : Chế đô mưa: Theo Ohler (1979), lượng mưa thích hợp giới hạn từ 1.000 – 2.000 mm/năm, có mùa mưa tập trung, khơng đến sớm, sau mùa khơ kéo dài – tháng [2] Chế độ nhiệt: Thích hợp từ 20oC – 37oC, cực thuận 27oC [9] Một điều ảnh hưởng rõ rệt đến suất hạt điều sương muối Khi có nhiều sương muối trùng với thời kỳ kết hạt non cây, nhiều hạt non bị thối đen, suất giảm Cây điều nước ta thường bị ảnh hưởng nhiều sương muối Chế độ ánh sáng: Cây điều ưa sáng hồn tồn, thích hợp vùng mà độ dài ngày đêm bầu trời quang đãng Số nắng khoảng 2000 h/năm [3] Độ ẩm tương đối: Độ ẩm khơng khí thích hợp từ 65 % – 80 % 2.1.3.2 Đất đai Cây điều mọc nhiều loại đất khác (đất đỏ, đất cát, đất xám phù sa cổ, đất sỏi đá,…), nhiên muốn đạt suất cao địi hỏi phải có tầng đất mặt sâu, thành phần giới nhẹ, thoát nước tốt, pH đất từ 4,5 – 6,5 Vườn trồng phải nhổ cỏ thường xuyên để phát triển tốt 2.1.3.3 Mật độ trồng Thông thường mật độ trồng thích hợp 10 m x 10 m, mật độ điều phát triển tốt chiều cao tán [3] 2.1.4 Giống điều phƣơng pháp nhân giống Giống loại trồng từ hạt khác, điều có khả xảy thụ phấn chéo cao phát tán rộng, quần thể điều có tính đa dạng di truyền cao Trong thực tế, Việt Nam có giống điều chủ yếu như: PN1, MH4/5, MH5/4, BO1 (là giống điều ghép cao sản) Bên cạnh cịn giống điều khác chưa phân loại [3] Theo kinh nghiệm nơng dân, có giống điều chủ yếu là: điều Ấn Độ có tán rộng, đọt non màu đỏ cho suất cao song hay bị sâu hại điều Việt Nam có tán hẹp đọt non màu xanh, suất không cao điều Ấn Độ song khả chống chịu sâu hại cao 2.1.4.1 Đặc điểm thực vật học giống điều Về hình dạng cây: Có thân cao thân lùn Giữa dạng cịn có nhiều dạng trung gian phong phú Về màu sắc lá: Có giống có non màu nõn chuối già màu xanh nhạt, có giống có non từ màu hồng đến đỏ tía già màu xanh đậm Về hoa: Có giống hoa nở muộn, nở sớm chênh 10 – 15 ngày, số lượng hoa chùm khác (có giống chùm có vài chục hoa, có giống lại có vài trăm hoa chùm), tỉ lệ hoa đực/hoa lưỡng tính bình qn chùm thay đổi tùy giống (có giống có tỉ lệ hoa lưỡng tính thấp khoảng % hay có giống cao đến khoảng 30 %) Tỉ lệ hoa lưỡng tính sau nở đậu thành trái khác nhau, có nhiều khoảng – 10 trái, – trái Về giả: Khác biệt màu sắc, hình dạng, kích cỡ, mùi vị giống Có giống màu đỏ, màu hồng, màu vàng, đỏ sọc xanh Có giống trịn, dài, to hay nhỏ Có giống chín, có giống nhạt, ăn khé cổ có nhiều tananh nước Về hạt suất hạt: Khác biệt hạt đặc điểm hình dạng, kích thước, trọng lượng, tỉ lệ nhân Có giống hạt trịn mẩy, có giống hạt lép Có giống hạt to nặng, chín trọng lượng khơ đạt đến g/hạt (khoảng 127 – 132 hạt/kg), có giống hạt nhỏ, đạt 3,5 g/hạt (gần 300 hạt/kg) Có giống tỉ lệ nhân đạt 20 % trọng lượng hạt, có giống đạt 30 % trọng lượng hạt 2.1.4.2 Phƣơng pháp nhân giống điều Các phương pháp nhân giống điều chủ yếu chiết, ghép, gieo hạt, nhiên thực tế nông dân thường dùng phương pháp chọn điều mẹ tốt để lấy hạt làm giống Ngoài ra, nông dân thường mua giống cao sản từ công ty giống 2.1.5 Sản xuất điều giới Từ mọc hoang dại vùng Đông Bắc Brazil, ngày điều trồng nhiều nơi giới, chủ yếu nước có nông nghiệp phát triển hay nước phát triển Hiện có khoảng 50 nước trồng điều toàn giới Những nước sản xuất điều chủ yếu: Ấn Độ, Brazil, Việt Nam, GuineaBissau, Ivory Coast, Benin, Nigeria, Mozambique, Tanzania,… Bảng2.1 Sản xuất nhân hạt điều giới niên vụ 1997 2000 – 2001 ĐVT: Nƣớc/khu vực 1997 2000 – 2001 Ấn Độ 350.000 425.000 Brazil 180.000 200.000 Việt Nam 110.000 140.000 Tanzania 80.000 150.000 Nigieria 40.000 30.000 Mozambique 30.000 20.000 Indonesia 30.000 30.000 Guinea-Bissau - 45.000 Benin - 20.000 Các nuớc châu Phi nói tiếng Pháp - 70.000 Các nước khác 80.000 70.000 Cộng 900.000 1.200.000 Nguồn:[4] Ngoài nhân điều sản phẩm có giá trị kinh tế cao cịn có dầu hạt điều (CNSL – Cashew nut shell liquid) – sản phẩm tạo trình chế biến hạt điều lấy nhân xuất khẩu, chiếm khoảng 18 – 23 % trọng lượng hạt điều, có thành phần acid anacardic cardol CNSL sản phẩm nguyên liệu đa năng, dùng cho cơng nghiệp hóa chất, chế tạo bố thắng, lớp phủ cho ly hợp, chế tạo loại sơn,vecni, loại nhựa,…Những nước sản xuất CNSL chủ yếu Brazil, Ấn Độ, Mozambique, Tanzania,… Ngồi trái điều cịn dùng làm ngun liệu công nghiệp chế biến nước giải khát phát triển số nước (Brazil, Ấn Độ,…) Gỗ điều dùng ngành đồ gỗ mỹ nghệ nội thất gia đình Bên cạnh đó, điều cịn có số tác dụng chữa bệnh số nước sử dụng như: giảm đau, lợi tiểu, điều trị hen suyễn (Brazil), thuốc sát trùng (Peru),…[3] 10 2.1.6 Sản xuất điều Việt Nam Việt Nam nằm khu vực nhiệt đới gió mùa, có khí hậu thuận lợi cho điều phát triển Cây điều đưa vào nước ta từ kỷ 18 hay sớm (Johnson, 1973) [2], đến đầu năm 1975, điều trồng phổ biến để phủ xanh đất trống đồi trọc bom đạn chiến tranh Cho đến cuối thập kỷ 80 kỷ 20 bắt đầu xuất nhân điều [3] Kể từ mốc thời gian đến nay, phát triển điều khơng phải lúc thuận lợi, có lúc người nông dân trồng điều phải chặt bỏ hết vườn điều để trồng tiêu, cà phê,… giá điều thấp mùa liên tục Tuy nhiên ngành trồng điều phát triển mạnh, đạt thành tựu đáng ghi nhận Năm 2004, nước có 400.000 diện tích trồng điều, năm cho sản lượng cao ngành điều từ trước đến nay, xuất 107.000 nhân điều, tăng 25 % so với năm 2003, giá trị kim ngạch xuất đạt 425 triệu USD, tăng 40 % so với năm 2003, thị trường Mỹ chiếm 41 %, Trung Quốc 20 %, Úc 10 %, lại thị trường khác Năm 2004, Việt Nam thức trở thành nước xuất hạt điều đứng hàng thứ giới, vượt qua Ấn Độ, đứng sau Brazil Năm 2005, tiêu ngành điều sản xuất chế biến khoảng 450.000 điều thô, xuất 110.000 nhân điều, giá trị kim ngạch xuất đạt từ 430 – 450 triệu USD, phấn đấu hoàn thành kế hoạch trồng 50.000 điều cao sản đến năm 2010, tồn diện tích điều nước thay giống cao sản [4] 70 IA I IB IIA1.1 IIA1 IIA1.2 IIA II IIA2 IIB 0,59 0,69 0,79 Coefficient 0,90 1,0 Hình 4.19 Cây di truyền quần thể điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Theo di truyền, quần thể điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu chia thành 26 nhánh, trung bình nhánh có 1,6 mẫu, có mức độ tương đồng di truyền từ 59 % đến 100 % Theo đánh giá thông qua kỹ thuật RAPD, quần thể 71 điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có tính đa dạng di truyền mức từ trung bình đến trung bình Chúng tơi nhận thấy quần thể điều huyện Tân Thành có mức độ phân bố rộng nhất, đồng thời có mức độ tương đồng di truyền cao nhất, thể điều có nhiều mẫu hồn tồn giống (hướng mũi tên) Quần thể điều huyện Xuyên Mộc có mức độ đa dạng di truyền cao, đồng thời có chất di truyền giống với quần thể điều huyện Tân Thành Quần thể điều huyện Châu Đức có mức độ đa dạng cao, biểu mức độ phân bố phân tán rộng di truyền, đồng thời chất di truyền gần với quần thể điều huyện Tân Thành Như vậy, với mức độ đa dạng di truyền cao cho thấy quần thể điều huyện Châu Đức, Tân Thành, Xuyên Mộc đa dạng, đồng thời có mức độ tương đồng di truyền cao với quần thể điều huyện khác cho thấy quần thể điều huyện Châu Đức, Tân Thành, Xuyên Mộc có khả thích nghi cao với điều kiện canh tác huyện khác nói riêng tồn tỉnh nói chung Cơng tác chọn giống nên tập trung huyện này, có khả chọn giống điều tốt huyện khả phổ biến giống tốt địa bàn tồn tỉnh lớn Tính đa dạng di truyền đặc điểm bật có liên quan đến hiệu kinh tế đánh giá trung bình, nói, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có tiềm lớn để phát triển điều có chất lượng cao đồng địa bàn toàn tỉnh, thuận lợi cho công việc phổ biến kỹ thuật canh tác Công việc sau thu hoạch thuận lợi sử dụng công nghệ đồng để chế biến hạt điều, sủ dụng loại tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng nhân điều thành phẩm, góp phần làm tăng ổn định giá trị nhân điều thành phẩm 4.2.2.10 Hạn chế kết đánh giá đa dạng di truyền kỹ thuật PCR – RAPD Kết đánh giá đa dạng di truyền chưa thực xác đầy đủ, bắt nguồn từ nguyên nhân sau: Số lượng mẫu thu thập chưa đủ để thể thực tế, chưa mang tính đại diện cao 72 Kết ly trích DNA khơng tốt, thực phản ứng PCR – RAPD cho 50 mẫu, thu kết 41 mẫu Các mẫu không tách chiết DNA chủ yếu thuộc huyện Châu Đức Xuyên Mộc, làm ảnh hưởng đến kết chung huyện có diện tích trồng điều nhiều tỉnh Phản ứng PCR – RAPD chưa hoàn thiện Do hạn chế kỹ thuật điện di agarose không cho độ phân tách cao, độ dài band khơng phân biệt mắt thường nên nhận định sai độ dài band 4.2.3 Kết thực kỹ thuật AFLP số mẫu DNA điều 4.2.3.1 Kết cắt giới hạn gắn adapter (hình 4.20) TT1 TT31 CD40 TT78 TT4 TT9 VT38 CD45 ĐC Hình 4.20 Kết phản ứng cắt gắn adapter Chúng tơi thấy có dấu hiệu cắt gắn adapter số đoạn có kích thước khác trải dài điện di Số lượng đoạn tạo lớn 4.2.3.2 Kết phản ứng nhân tiền chọn lọc (hình 4.21) 73 TT1 TT31 CD40 XM78 TT4 TT9 VT38 CD45 Hình 4.21 Kết phản ứng nhân tiền chọn lọc Trên điện di có dấu hiệu nhân tiền chọn lọc số phân đoạn 4.2.3.3 Kết thực phản ứng nhân chọn lọc Sử dụng máy giải trình tự gene AB Applied Biosystem 3100 điện di sản phẩm phản ứng nhân chọn lọc Các đoạn DNA nhân hiển thị dạng peak đồng thời cho ta biết độ dài đoạn Kết minh họa hình 4.23 Hình 4.22 Kết AFLP điện di máy AB sequencer 3100 Kết điện di AFLP cho thấy có khác biệt rõ ràng mẫu, đoạn nhân chọn lọc tạo phân biệt với đến nucleotide, giúp phát 74 khác biệt rõ ràng mà phương pháp điện di truyền thống khơng thể có Chiều dài đoạn tạo có độ tin cậy lớn mức độ lặp lại hoàn toàn giống mẫu cao, ước lượng cách so sánh vị trí tương đối đoạn nhân chọn lọc với thang chuẩn Tuy nhiên nhiều đoạn ngắn khoảng 100 basepairs (không lấy làm kết khơng có độ tin cậy cao), cho thấy kỹ thuật AFLP DNA điều phải tiến hành hồn thiện 4.2.3.4 Phân tích kết AFLP số mẫu DNA điều Kết cho thấy có tổ hợp primer cho số band nhiều nhất, trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết thực AFLP số mẫu DNA điều Tổng số Tổ hợp primer nhân chọn lọc Band Band đồng hình đa hình 36 (2,8 %) 35 (97,2 %) 14 (7,3 %) 13 (92,7 %) band tạo MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) MseI + CAA – EcoRI + AGG (Green) MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) MseI + CAA – EcoRI + ACG (Green) Từ kết AFLP nhận thấy số điều sau: Tổng số band tạo kỹ thuật AFLP nhiều hẳn so với kỹ thuật RAPD, làm tăng khả Các đoạn tạo có chiều dài ngắn, 500 basepairs Có thể phân biệt đoạn đến nucleotide, điều làm tăng độ tin cậy xác phân tích kết để đánh giá đa dạng di truyền.của kết 75 Mức độ phát band đa hình cao nhiều so với kỹ thuật RAPD Theo kết điện di giải trình tự (danh sách band tổ hợp primer nhân chọn lọc trình bày phụ luc), nhận thấy số band đặc biệt: Với mẫu TT4, TT9, VT38 CD45 thực với tổ hợp primer nhân chọn lọc thứ gồm: MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) MseI + CAA – EcoRI + AGG (Green), kết thu 36 band, chúng tơi nhận thấy band 127 base pairs, 224 base pairs, 255 base pairs, 307 base pairs 309 base pairs có mẫu CD45, thị phân tử cho tính trạng nhỏ mẫu CD45 Band 223 base pairs có mẫu VT8, thị phân tử tính trạng hạt có mẫu VT8 Band 456 base pairs có mẫu TT4, thị phân tử tính trạng nhỏ, cịn xanh mà già có mẫu TT4 Với mẫu TT1, TT31, CD40 XM78 thực với tổ hợp primer nhân chọn lọc thứ hai gồm: MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) MseI + CAA – EcoRI + ACG (Green), kết thu 14 band, chúng tơi nhận thấy band 181 base pairs band 254 base pairs có mẫu TT31 thị phân tử tính trạng vàng mẫu TT31 Các band tiếp tục nghiên cứu (giải trình tự,…) cho số thông tin quan trọng liên quan đến tính trạng hạt to số tính trạng khác Chúng tơi tiến hành phân tích đa dạng di truyền tổ hợp primer khác Sử dụng phần mềm NTSYS xây dựng di truyền hình 4.23 4.25: Hình 4.23 di truyền mẫu TT4, TT9, VT38 CD45 thực với tổ hợp primer nhân chọn lọc thứ gồm tổ hợp: MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) MseI + CAA – EcoRI + AGG (Green) 76 TT4 CD45 TT9 VT38 0,37 0,43 0,49 0,55 0,61 Coefficient Hình 4.23 Cây di truyền kết AFLP tổ hợp primer nhân chọn lọc thứ Qua hình 4.23 chúng tơi nhận thấy mức độ tương đồng di truyền mẫu hạ thấp xuống từ 37 % – 61 %, đồng thời mẫu thuộc nhánh riêng biệt, điều cho ta thấy mức độ đa dạng di truyền mẫu TT4, TT9, VT38 CD45 cao Chúng tiến hành so sánh với mức độ đa dạng di truyền mẫu thực kỹ thuật RAPD (hình 4.24) TT4 CD45 TT9 VT38 0,70 0,75 0,80 Coefficient 0,85 0,90 Hình 4.24 Cây di truyền mẫu TT4, TT9, VT38, CD45 thực RAPD Chúng nhận thấy mức độ tương đồng di truyền mẫu TT4, TT9, VT38, CD45 thực RAPD cao, từ 70 % – 90 %, cao hẳn so với sử dụng kỹ thuật AFLP Như TT9 VT38 giống tới 90 % theo RAPD, 61 % theo AFLP Như vậy, mức độ đa dạng di truyền mẫu TT4, TT9, VT38, CD45 thực theo kỹ thuật AFLP cao so với kỹ thuật RAPD 77 Hình 4.25 di truyền mẫu TT1, TT31, CD40 XM78 thực với tổ hợp primer nhân chọn lọc thứ hai gồm tổ hợp: MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) MseI + CAA – EcoRI + ACG (Green) TT1 CD40 XM78 TT31 0,45 0,50 0,55 Coefficient 0,60 0,65 Hình 25 Cây di truyền kết AFLP tổ hợp thứ hai Tương tự tổ hợp primer nhân chọn lọc thứ nhất, mức độ tương đồng di truyền mẫu TT1, TT31, CD40 XM78 từ 45 % - 65 %, đồng thời thuộc nhánh khác nhau, cho thấy mức độ đa dạng di truyền mẫu cao Chúng thực so sánh với mức độ đa dạng di truyền mẫu thực kỹ thuật RAPD (hình 4.26) TT1 XM78 TT31 CD40 0,60 0,65 0,70 Coefficient 0,75 0,80 Hình 4.26 Cây di truyền mẫu TT1, TT31, CD40, XM78 thực RAPD Chúng nhận thấy mức độ đa dạng di truyền mẫu TT1, TT31, CD40, XM78 thực theo kỹ thuật AFLP cao so với thực theo kỹ thuật RAPD nhận thấy mức độ tương đồng di truyền RAPD cao so với AFLP 78 4.2.3.5 Đánh giá hiệu kỹ thuật AFLP so với kỹ thuật RAPD Sau so sánh kết kỹ thuật AFLP với kết cảu kỹ thuật RAPD, bước đầu nhận định đặc điểm bật kỹ thuật AFLP so với kỹ thuật RAPD là: Tổng số sản phẩm khuếch đại tạo kỹ thuật AFLP nhiều hẳn so với kỹ thuật RAPD Mức độ phát đa hình kỹ thuật AFLP cao hẳn so với kỹ thuật RAPD có khả phân biệt độ dài đoạn cao Kỹ thuật AFLP có khả đánh giá mức độ đa dạng di truyền với độ tin cậy cao nhiều so với kỹ thuật RAPD Kỹ thuật AFLP có khả tốt việc phát thị phân tử với độ tin cậy cao so với kỹ thuật RAPD Tuy nhiên tiến hành kỹ thuật AFLP có số khó khăn so với kỹ thuật RAPD, quy trình tiến hành nhiều thời gian, chi phí cao máy móc thiết bị phức tạp khó thao tác 79 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua q trình thực thí nghiệm trên, rút số kết luận sau: 5.1.1 Phần thu thập mẫu Thu thập mẫu từ 80 cá thể trội thu thập liệu có liên quan tất cá thể 5.1.2 Phần tách chiết DNA Chúng tiến hành tách chiết 80 mẫu thu thập được, kết thu 55 mẫu cho nồng độ DNA trung bình khoảng 70 – 80.ng/μl Chúng tơi nhận thấy DNA điều sau tách chiết thường bị gãy nhiều, nồng độ DNA thấp khó tách DNA điều non 5.1.3 Phần kỹ thuật RAPD, đánh giá đa dạng di truyền nhận diện thị phân tử Nói chung, phản ứng PCR – RAPD sử dụng primer 11 mà thực ổn định, khả nhân cao Đã nhận biết band có độ dài khoảng 550 base pairs, 600 base pairs, 700 base pairs, 750 base pairs, 900 base pairs, 1050 base pairs, 1200 base pairs, 1400 base pairs, 1600 base pairs, 1900 base pairs 2300 base pairs, bands khoảng 550 base pairs, 900 base pairs 1050 base pairs band đặc trưng thực phản ứng PCR – RAPD với primer 11 Hai band 600 base pairs 700 base pairs đặc biệt, tiếp tục nghiên cứu để sử dụng thị phân tử cho tính trạng liên quan Bước đầu chúng tơi nhận định tính đa dạng di truyền điều trồng tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu mức trung bình đến trung bình Theo sơ đồ di truyền hệ số tương đồng di truyền biến động từ 0,53 – 1, điều đồng nghĩa với nhận định quần thể điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có mức độ tương đồng di 80 truyền cao, mức độ tập trung giống cao, thuận lợi cho công tác phân loại giống phổ biến kỹ thuật canh tác, phát triển mạnh diện tích canh tác giống có chất lượng cao hay tìm kiếm cá thể trội để lai tạo giống với chất lượng tốt hẳn giống có 5.1.4 Phần kỹ thuật AFLP Quá trình xây dựng phương pháp tiến hành kỹ thuật AFLP điều nhận thấy tổ hợp primer nhân chọn lọc cho nhiều band với mức độ xuất đa hình cao, gồm: MseI + CAA – EcoRI + ACT (màu xanh dương) MseI + CAA – EcoRI + AGG (màu xanh cây) MseI + CAA – EcoRI + ACA (màu xanh dương) MseI + CAA – EcoRI + ACG (màu xanh cây) Bước đầu nhận thấy kết đánh giá đa dạng di truyền dựa kỹ thuật RAPD AFLP có khác rõ rệt, kỹ thuật AFLP cho kết tốt có độ tin cậy cao hẳn kỹ thuật RAPD, khả nhận diện thị phân tử kỹ thuật AFLP tốt đáng tin cậy 5.2 Đề nghị 5.2.1 Về phƣơng hƣớng phát triển canh tác điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Dựa kết luận rút ra, đề nghị ban ngành có liên quan đến ngành nơng nghiệp nói chung đến việc quy hoạch phát triển điều nói riêng tỉnh cần tiến hành khảo sát tình hình canh tác điều địa bàn tỉnh quy mơ lớn, từ rút tình hình canh tác điều tỉnh để tiến hành phổ biến kỹ thuật canh tác đem lại hiệu kinh tế cao cho nông dân trồng điều, quan trọng đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể điều, tìm giống điều tốt phù hợp cho điều kiện canh tác tỉnh Ngồi cịn tìm nguồn gene cá thể hay giống điều tốt ổn định để làm nguyên liệu cho nghiên cứu lai tạo giống Chỉ đánh giá đầy đủ tính đa dạng di truyền điều tỉnh nhà vạch chiến lược phát triển điều phù hợp, tránh tình trạng phát triển tự phát 81 5.2.2 Về nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nhận diện thị phân tử điều Thực công việc lấy mẫu điều quy mô lớn khảo sát kỹ đặc điểm điều bật Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tách chiết DNA điều, đặc biệt điều cịn non Tiếp tục hồn thiện quy trình PCR – RAPD DNA điều Với band đặc biệt (600 base pairs 700 base pairs) cho thơng tin hữu ích, khuyến cáo nên cắt band giải trình tự band Bên cạnh tiếp tục thử nghiệm kỹ thuật khác (như kỹ thuật microsatellies – SSR) để đánh giá tính đa dạng di truyền phát thị phân tử điều Có thể điện di agarose khơng thể nhận diện hết band hay phân biệt band có độ dài gần nhau, chúng tơi khuyến cáo cần cải tiến điện di (điện di gel lớn hơn, máy điện di tốt, ….) giải trình tự để biết độ dài đoạn Từ kết bước đầu xây dựng phương pháp tiến hành kỹ thuật AFLP điều, tiếp tục hồn thiện quy trình để có hiệu cao nhất, làm tiền đề cho việc áp dụng kỹ thuật điều quy mô lớn, xem xét khả áp dụng kỹ thuật đối tượng nghiên cứu khác 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng Nhà xuất Nông nghiệp Tp.HCM 275 trang Hoàng Chương Cao Vĩnh Hải, 2002 Kỹ thuật trồng điều Nhà xuất Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 147 trang Đường Hồng Dật, 1999 Cây điều-Kỹ thuật trồng triển vọng phất triển Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội 153 trang Đề án phát triển điều đến năm 2010 Bộ Nông nghiệp phát triển Nông thôn, 2000 Phạm Thành Hổ, 1998 Di truyền học Nhà xuất Giáo Dục Tp HCM 612 trang Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu Công nghệ sinh học Nhà xuất Nông nghiệp Tp HCM 220 trang Hồng Thị Liễu, 2004 Phân tích mức độ đa dạng di truyền xây dụng phương pháp nhận diện giống cacao sở kỹ thuật PCR Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Nông học, Đại học Nơng lâm Tp HCM Hồng Văn Tiến, Lê Khắc Thận Lê Dỗn Diên, 1997 Sinh hóa học với sở khoa học Công nghệ gene Viện khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, Nhà xuất Nông nghiệp Tp HCM Nguyễn Thị Trinh, 2005 Bước đầu điều tra trạng canh tác xây dựng ngân hàng gene invitro cho dòng giống điều tỉnh Bình Thuận Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Nơng học, Đại học Nông lâm Tp HCM 10 Nguyễn Văn Uyển Nguyễn Tiến Thắng, 2000 Những kiến thức Công nghệ sinh học Nhà xuất Giáo Dục Tp HCM 244 trang 11 Bùi Trang Việt, 2001 Sinh học Phân tử Khoa sinh học, ĐH Quốc gia Tp HCM, trường ĐH Khoa học tự nhiên Tp HCM 83 Tài liệu tiếng nƣớc 12 Brown T.A., 1997 Gene cloning an introduction Third edition UMIST, Manchester, UK Chapman and Hall 334 pages 13 Kazutoshi Okuno, Shuichi Fukuoka, 1998 Manual for DNA extraction in plants Japan international cooperation agency 42 pages 14 Roger L Miesfeld, 1999 Applied Molecular Genetics The University of Arizona Tucson, Arizona Wiley – Liss 293 pages 15 Samal S., Rout G R., Lenka P.C., 2003 Analysis of genetic relationships between populations of cashew (Anacardium occidental L.) by using morphologicalcharacterisation and RAPD markers Plant soil environ; p 176 – 182 16 www.keygene.com/technologies/technologies.aflp.htm 17 www.appliedbiosystems.com Các từ khóa: AFLP, CTAB, AFLP protocol,… 18 www.keygene.com Các từ khóa: AFLP,… 84 ... qua kỹ thuật RAPD đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền nhận di? ??n thị phân tử quần thể điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Xây dựng quy trình tiến hành kỹ thuật AFLP điều, làm sở cho việc áp dụng kỹ thuật. .. lạnh) làm nguyên liệu cho kỹ thuật RAPD AFLP Thực thành cơng kỹ thuật RAPD từ đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền quần thể điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, đồng thời nhận di? ??n số đoạn DNA sử dụng... thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể phát thị phân tử với độ tin cậy cao [1] [6] [17] [18] Nguyên lý kỹ thuật AFLP trình bày hình 2.2 Hình 2.2 Nguyên lý kỹ thuật AFLP 24
