Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương
ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay ở nước ta, việc nghiên cứu sinh dược học và dược động học của thuốc là một lĩnh vực tương đối mới, đang ngày càng được quan tâm. Trong khi đó, ở các nước khác, đây là một tiêu chí bắt buộc các hãng Dược phẩm phải làm nếu muốn đưa thuốc ra thị trường. Một trong những vấn đề đánh giá sinh dược học của thuốc là mức độ hấp thu thuốc và nồng độ thuốc đạt được trong huyết tương. Các phương pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong huyết tương (dịch sinh vật) là sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ), sắc ký khí (GC), sắc ký khí gắn với máy khối phổ (GC - MS ), phóng xạ miễn dịch, điện di mao quản Trong đó, HPLC đặc biệt là HPLC pha đảo với detector UV là phương pháp hayđược dùng hơn cả, do tinh ưu việt nổi trội về độ nhạy, tính chính xác, độ chọn lọc, tính kinh tế. Để có một qui trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc trong dịch sinh vật, chúng ta khảo sát các điều kiện sắc ký thích hợp như cột; dung môi pha động; lưu lượng dòng; bước sóng quy trình xử lý mẫu, khoản nồng độ khảo sát. Ketoprofen- acid -2 (- benzoyl phenyl ) propionic - là thuốc chống viêm phi steroid; có tác dụng giảm đau, chống viêm, ức chế quá trình tổng hợp prostaglandin và leukotrien; ức chế sự kết dính tiểu cầu được dùng nhiều trong điều trị thấp khớp mãn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp, thoái hoá khớp nặng. Ketoprofen là thuốc mới được đưa vào sản xuất ở nước ta và chưa có tài liệu trong nước nào đánh giá định lượng ketoprofen trong huyết tương. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương” với mục tiêu:-Khảo sát và lựa chọn dung môi chiết ketoprofen trong huyết tương cho hiệu xuất chiết cao.1 -Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng ketoprofen trong huyết tương .-Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương bằng HPLC.-Áp dụng định lượng ketoprofen trong huyết tương người sau khi uống thuốc và theo dõi độ ổn định của ketoprofen theo thời gian bảo quản.2 PHẦN I: TỔNG QUAN.1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ KETOPROFEN.1.1.1 Công thức và tính chất lý hoá[1] [ 5]. - Phân tử lượng : 254.29- Tên khoa học :acid 2 ( - benzoyl phenyl ) propionic - Tính chất: Bột kết tinh trắng, không mùi. Thực tế không tan trong nước ở 200C, tan hoàn toàn trong kiềm mạnh, ethanol 960, aceton cloroform và ether. pKa =5,94 trong hỗn hợp methanol - nước (3 : 1). Cực đại hấp thụ trong methanol ở bước sóng 255 nm. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 950C.1.1.2 Tác dụng dược lý và dược động học [5] [6].Ketoprofen là thuốc chống viêm phi steroid, thuộc dẫn chất của acid aryl propionic, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm. Ketoprofen ức chế quá trình tổng hợp prostaglandin và ức chế sự kết tập tiểu cầu.Ketoprofen được hấp thu rất nhanh vào máu , đạt nồng độ tối đa sau 45 - 60 phút nếu đặt hậu môn và 60- 90 phút sau khi uống. Liên kết với protein huyết tương 99%, thời gian bán thải là 1,5-2,5 giờ. Sau khi uống 4 giờ nồng độ ketoprofen trong bao hoạt dịch cao hơn trong máu. Thuốc qua được hàng rào nhau thai. Một phần nhỏ chuyển hoá bằng cách hydroxyl hoá, còn phần lớn liên hợp với acid glucuronic. Thải trừ chủ yếu qua nước tiểu (75- 3 CH – COOH CO CH3 90%), một ít qua phân( 1-8% ). Ở nước tiểu ( 65-75%) là dạng glucuronyl, 1% là dạng chưa biến đổi. Sau khi uống 6 giờ ketoprofen sẽ bị thải trừ 50% qua thận.1.1.3 Chỉ định [5] [6]:Ketoprofen được chỉ định điều trị dài hạn các triệu chứng trong:- Viêm thấp khớp mãn tính, đặc biệt là viêm đa khớp dạng thấp, viêm cứng khớp cột sống.- Bệnh cứng khớp gây đau và tàn phế. Điều trị ngắn hạn các triệu chứng trong các cơn cấp tính của các bệnh:- Bệnh thấp khớp ngoài khớp (đau vai cấp tính, viêm gân . ).- Viêm khớp vi tinh thể.- Thoái hoá khớp.- Dạng viên nang còn dùng để giảm đau: đau lưng, đau rễ thần kinh .1.1.4 Chống chỉ định [6]:- Dị ứng với ketoprofen, aspirin, và các thuốc chống viêm phi steroid cùng loại.- Loét dạ dày-tá tràng tiến triển.- Suy thận nặng, suy gan tế bào nặng.- Phụ nữ có thai( 3 tháng cuối) và cho con bú.1.1.5 Tác dụng không mong muốn [6]- Tác dụng phụ ở đường tiêu hoá: khó chịu vùng dạ dày-ruột, đau dạ dày, buồn nôn, nôn mửa, táo bón, tiêu chảy, nặng thì loét dạ dày, xuất huyết tiêu hoá, thủng ruột.- Nhức đầu, chóng mặt, buồn ngủ.- Phản ứng quá mẫn ở da( nổi ban, mề đay, ngứa) và đường hô hấp (suyễn, nhất là những người dị ứng với aspirin và các kháng viêm không steroid khác).4 - Giảm nhẹ hồng cầu ở người bị thiếu máu, một vài trường hợp giảm bạch cầu nhẹ đã được ghi nhận.1.1.6 Liều dùng:Liều khởi đầu: 300 mg chia làm 3 lần, uống khi no.Liều duy trì: 150-200mg hoặc nạp ngày 1-2 viên thuốc đạn.Tiêm bắp ngày100-200mg chia 2 lần.Không nên phối hợp Ketoprofen với thuốc chống đông máu đường uống và các kháng viêm không steroid khác (kể cả salicylat liều cao) do làm tăng nguy cơ loét và xuất huyết tiêu hoá.1.1.7 Dạng bào chế [5] [6].- Viên nang 25mg, 50mg, 75mg.- Viên nén 100mg, 150mg.- Viến bao tan ở ruột 50mg.- Viên bao tác dụng kéo dài 200mg, viên nang tác dụng kéo dài 100mg, 150mg, 200mg.- Thuốc tiêm 100mg.- Thuốc mỡ 2,5%. Biệt dược: Biprofenid, Profenid, Kefenid, Fastum, Ketum, Ketopron….1.1.8 Các phương pháp định lượng.A. Phương pháp acid- bazơ:Định lượng ketoprofen nguyên liệu, xác định điểm tương đương bằng chỉ thị đỏ phenol [18] hoặc bằng phương pháp đo điện thế [ 10] [18].• Tiến hành:Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân chính xác) vào 25ml alcol. Thêm 25ml nước và vài giọt đỏ phenol. Chuẩn độ với NaOH 0,1N.Song song làm một mẫu trắng trong cùng điều kiện.1ml NaOH 0,1N tương đương với 25,43mg C16H14O3.5 - Hoc: Ho tan khong 200mg Ketoprofen (cõn chớnh xỏc) vo 25ml alcol. Thờm 25ml nc Chun vi NaOH 0,1N, xỏc nh im tng ng bng bc nhy in th.1ml NaOH 0,1N tng ng vi 25,43mg C16H14O3.B. Phng phỏp quang ph [7] [8][10]: Dựng nh lng ketoprofen trong ch phm.Ho mt lng ch phm cú cha khong 50 mg ketoprofen (cõn chớnh xỏc) trong 300 ml methanol 75 %, lc trong 10 phỳt, thờm methanol 75 % va 500 ml. Lc. Ly 5 ml dch lc pha loóng thnh 100 ml vi methanol 75 % v em o hp th ca dung dich ny bc súng 258nm; cuvet thch anh cú chiu dy 1 cm vi mu trng l methanol 75%.Tớnh kt qu da vo A (1%, 1cm) bc súng 258 nm l 662.C. Phng phỏp sc ký lng hiu nng cao ( HPLC ).Dựng nh lng ketoprofen trong huyt tng v xỏc nh tp cht trong nguyờn liu.STT TI LIU PHA NG CT MU TH1 [10] [18] m phosphat pH 3,5 - ACN - H2O (2:43:55)C18 5àm150*4,6 mmNguyờn liu2 [10] NH4CH3COO 1% - MeOH - ACN (55:30:15)C18 5àm200*4,6 mmNguyờn liu3 [13] m phosphat pH 3,2 - ACN (60:40)C18 2àm250*4,6 mmHuyt tng4 [12] NH4CH3COO 20 mM - MeOH; iu chnh pH 7,0.C18 4 àmHuyt tng5 [11] ACN : AcOH 1% ( 38 : 62 ).C18 10àm3,9*300 mm Huyt tng6 [16] m Phosphat 0,05M pH 7 : ACN (90 : 10 ).C18 5 àm4,6*250mmHuyt tngD. Phơng pháp điện di mao quản: Định lợng ketoprofen trong huyết tơng [14] và tách đồng phân của ketoprofen [17].1.2 Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ).6 Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography ) còn gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiện đại ra đời vào những năm cuối 1960. Nó đợc xây dựng và phát triển không ngừng và ngày càng thể hiện rõ tính u việt, đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu sinh dợc học của thuốc. Phân loại các phơng pháp sắc ký [ 2]:- Sắc ký phân bố : + sắc ký lỏng- lỏng.+sắc ký phân bố pha liên kết.- Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao.- Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao.- Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel ( sắc ký theo loại cỡ ). Trong phân tích sinh dợc học và kiểm nghiệm, ngời ta hay sử dụng phơng pháp sắc ký lỏng phân bố pha liên kết (Bonded Phase Chromatography ). Đặc điểm phơng pháp [2]: Trong sắc ký lỏng phân bố pha liên kết, pha tĩnh đợc gắn hoá học (liên kết ) với chất mang ( Silicagel ) tạo nên hợp chất cơ Siloxan Nhóm Silanol Dẫn chất Dẫn chất Siloxan của Silicagel clorosilan- Nếu R là một nhóm ít phân cực nh octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl và dung môi phân cực nh methanol, acetonitril thì có sắc ký pha đảo (sắc ký pha ngợc ).7SiCH3CH3CH3ClCH3OHSi RSiSi OCH3CH3R +H3CH3C - Nếu R là nhóm khá phân cực nh: alkylamin - ( - CH2- )n-NH2 hay alkyl nitril -( - CH2- )n- CN và dung môi ít phân cực nh hexan thì ta có sắc ký pha thuận.- Cách chọn pha: thờng chọn pha tĩnh có tính chất phân cực giống các chất cần tách và khác với pha động. Nguyên tắc của phơng pháp [2] [3]:Các chất trong hỗn hợp đợc tách dựa trên khả năng phân bố khác nhau của chúng vào hai pha không hoà lẫn vào nhau, luôn tiếp xúc nhau: một pha tĩnh và một pha động.Dung dịch mẫu thử đợc đa vào hệ thống sắc ký qua van tiêm mẫu và đợc dung môi pha động kéo tới cột phân tích nhờ một bơm cao áp. Tại cột xảy ra quá trình tách, những phân tử nào có ái lực thấp với pha tĩnh thì đợc rửa giải ra trớc, còn những phân tử nào có ái lực mạnh với pha tĩnh thì đợc rửa giải ra sau. Chất ra khỏi cột đợc phát hiện bằng detector gắn với máy ghi, máy tính hay máy tích phân. Thời gian lu tR là đặc trng định tính của chất, chiều cao hay diện tích pic là đặc trng định lợng của chất. Sắc ký đợc tiến hành so với chuẩn. Một số thông số đặc trng của HPLC [2]:Ví dụ: Ta có 1 sắc đồ sau:- Thời gian lu tR ( phút ) là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh của pic. So sánh thời gian lu của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính đợc chất đó.- Thời gian chết tM ( phút ) là thời gian của một chất không bị lu giữ tức là bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi.- Thời gian lu hiệu chính tR, đợc tính theo công thức:8 tR = tR, + tM ( hay tR, = tR - tM ).- Thừa số dung lợng k dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất Qs tR tR - tMVR -VM k = = = =QMtM tM VM - Thừa số chọn lọc : Mô tả tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất. kB kB tR,B = = = kA kA tR,AQui ớc B là chất bị lu giữ mạnh hơn A nên 1. Để tách riêng 2 chất thì > 1, thờng từ 1,05 2,00.- Số đĩa lý thuyết N: Biểu thị hiệu lực cột sắc ký.N = 2bwrt x 16 hoc N = 22/1wrt x 54,5 Trong ú: WB chiu rng pic ỏy pic. W1/2 chiu rng pic o na chiu cao ca nh.- phõn gii RS l i lng o mc tỏch hai cht trờn mt ct sc ký. tR,B tR,ARs = 1/2( WB + WA ) tỏch riờng hai cht, Rs 1,5 ( khi 2 sc cú ln cựng c ).- Chiu cao pic hay din tớch pic l c trng nh lng ca cht. Khi so sỏnh chiu cao pic hay din tớch pic ca mu th v chun trong cựng iu kin lm ta tớnh c hm lng hot cht trong mu th. Pha tnh v pha ng trong HPLC [3].*Pha tnh trong HPLC chớnh l cht nhi ct lm nhim v tỏch mt hn hp cht phõn tớch. Nú l nhng cht rn, xp v kớch thc ht rt nh, ng kớnh c ht t 3-10àm, din tớch b mt riờng thng t 50-500 m2/g.Cn c theo bn cht chớnh ca quỏ trỡnh sc ký trờn ct tỏch, ngi ta chia nú thnh nhiu loi nh hp ph, phõn b, trao i ion v rõy phõn t. 9 Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật HPLC. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký phân bố pha liên kết. Bản chất chính của sự tách trong loại sắc ký này là dựa trên khả năng tách của các chất trong hai pha không hoà lẫn vào nhau. Các yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật HPLC: + Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không có các phản ứng hoá học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích. + Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký. + Tính chất bề mặt phải ổn định. + Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt. + Cỡ hạt phải tương đối dồng nhất. Pha tĩnh thường được chế tạo trên các chất nền sau: + Pha tĩnh trên nền Silicagel ( SiO2 ) + Pha tĩnh trên nền Oxid nhôm ( Al2O3 ) + Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ ( polystyren, cellulo .) + Pha tĩnh trên nền mạch carbon.Trong 4 loại này thì nền Silicagel được sử dụng nhiều nhất và pha tĩnh được chế tạo trên nền này cũng có nhiều ưu việt hơn, như khả năng chịu áp cao, độ trương nở nhỏ khi thay đổi dung môi rửa giải, bền với nhiệt.*Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan ( chất phân tích ) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trính sắc ký. Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ như Metanol, Acetonitril, n-Hexan, hay cũng có thể là hỗn hợp của hai hay nhiều dung môi trộn với nhau theo những tỷ lệ phù hợp. Nó cũng có thể là dung dịch nước của các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức, chất làm chậm. Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng cho nó, để có được hiệu quả tốt. Pha động là một trong 10 [...]... chuẩn nội phải đảm bảo tách khỏi ketoprofen và ổn định trong điều kiện sắc ký Pha các dung dịch ketoprofen và acid-2-(4-isobutylphenyl) propionic, ketoprofen và acid -2-[( 6- methoxy) naphtyl] propionic (IS1) trong pha động và trong huyết tơng Tiến hành chạy sắc ký, xác định thời gian lu tR của các chất, tính thừa số chọn lọc của các chất đối với ketoprofen, từ đó xác định chất nội chuẩn ( chất có ... Xây dựng phơng pháp định lợng ketoprofen trong huyết tơng Xõy dng ng chun trong pha ng: Pha mt dóy cỏc dung dch hn hp ket v IS trong pha ng vi cỏc nng ca ket l 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml ; 0,8mcg/ml ; 2mcg/ml ; 5mcg/ml v nng IS l 25mcg/ml Tin hnh chy sc ký vi iu kin nh trang 21 Kt qu thu c biu th bng din tớch pic t ú tớnh t s din tớch pic ca ket v IS Bng 4: Kt qu xõy dng ng chun nh lng Ketoprofen trong. .. sắc ký không quá lâu Do đó trong đề tài này chúng tôi chọn hệ dung môi pha động số 6 ACN : AcOH : Tri : H2O ( 50 : 0,5 : 0,3 : 49,2 ) *Bớc sóng: Để tăng độ nhạy khi phát hiện ketoprofen trong huyết tơng chúng tôi tiến hành xác định cực đại hấp thụ của ketoprofen trong điều kiện giống nh phân tích mẫu thực Pha dung dịch ketoprofen chuẩn trong dung môi pha động Quét phổ UV Ketoprofen có cực đại hấp thụ... chiết lần bốn đuổi dung môi, hoà tan trong pha động và tiến hành chạy sắc ký thì không phát hiện đợc ketoprofen trong dịch chiết lần bốn Nh vậy chiết ba lần là phù hợp Nhận xét: Chiết lặp ketoprofen bằng ACN hiệu xuất chiết cao, gần nh chiết đợc hết (97,06%) ketoprofen trong huyết tơng, nhng thời gian xử lý mẫu quá dài Còn chiết đơn (chiết dới hợp thức) ketoprofen trong huyết tơng hiệu xuất chiết tuy thấp... tớch ketoprfen trong huyt tng b.Xõy dng phng phỏp nh lng ketoprofen trong huyt tng Xõy dng ng chun trong pha ng: Pha 1 dóy dung dch hn hp ketoprofen v cht chun ni trong pha ng vi nng ketoprofen ln lt l 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml v nng cht chun ni l 25àg/ml Tin hnh chy sc ký, xỏc nh thi gian lu v din tớch pic ca ketoprofen v chun ni, t ú tớnh c t s din tớch pic gia ketoprofen. .. dng ng chun Ketoprofen trong huyt tng Nng ( mcg /ml ) 0,05 0,2 0,8 2 5 AKet AIS 3882 105190 14047 105131 86292 105812 232658 104177 607150 106458 RKet/IS 0,037 0,134 0,815 2,233 5,730 23 R (ket/IS) Đường chuẩn trong huyết tương 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 C (mcg/ml) th 2 : ng chun nh lng Ketoprofen trong huyt tng Phng trỡnh hi qui : y = 1,154x - 0,074 Trong ú : y l t s din tớch pic gia ketoprofen v... chất càng tách ra khỏi nhau, thờng dùng trong khoảng 1,05- 2,0 õy IS2/ket > IS1/ket nờn kh 18 nng tỏch ca IS2 v ketoprofen s tt hn kh nng tỏch ca IS1 v Ketoprofen Tc di chuyn t i ca IS2 v ketoprofen = 1,47 v tR,IS2 = 9,96 nờn thi gian lm mu cng khụng quỏ lõu Vỡ vy, cú th dựng acid -2(4 - isobutylphenyl) propionic lm ni chun trong phng phỏp nh lng Ketoprofen trong huyt tng Pha ng: Tin hnh kho sỏt... 103,5% 0,7032 Nhn xột: Nh vy, lng ketoprofen chun tỡm li l 103,5%, RSD = 1,778, n = 5 cho thy phng phỏp nh lng ny cú tớnh ỳng m bo cho phộp nh lng ketoprofen trong huyt tng Kt lun: Vi tớnh ỳng m bo, tớnh chớnh xỏc tt v s tuyn tớnh cht ch gia t s din tớch pic ketoprofen / IS v nng ketoprofen trong khong kho sỏt, cho thy phng phỏp ny cú th ỏp dng nh lng ketoprofen trong huyt tng * P DNG p dng nh lng... 4.92 4,94 Kt lun: Sau 3 thỏng bo qun mu th cú cha ketoprofen 300C, thy nng ca ketoprofen trong huyt tng vn n nh 30 PHN 3:KT LUN V XUT Trong ti ny chỳng tụi ó thc hin c mt s cụng vic sau: 1 ó kho sỏt 5 dung mụi chit ketoprofen trong huyt tng tỡm c ACN cú kh nng chit tt nht, cho hiu xut chit cao (91,2%) Xõy dng qui trỡnh x lý mu thớch hp chit ketoprofen trong huyt tng, thi gian chit ngn (60phỳt), lp... RKet/IS 0,036 0,161 0,704 2,030 5,372 22 R (ket/IS) Đường chuẩn trong pha động 6 5 4 3 2 1 0 0 2 C (mcg/ml) 4 6 th 1 : ng chun Ketoprofen trong pha ng Phng trỡnh hi qui y = 1,085 x - 0,087 Trong ú: y l t s din tớch pic gia Ket v IS x l nng Ketoprofen (mcg/ml ) H s tng quan hi qui : r = 0,9998 Xõy dng ng chun trong huyt tng Chun b mt thang chun trong huyt tng vi cỏc nng ket l 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; . định lượng ketoprofen trong huyết tương . -Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương bằng HPLC.-Áp dụng định lượng ketoprofen trong huyết. liệu trong nước nào đánh giá định lượng ketoprofen trong huyết tương. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen