Một số vấn đề sinh học phân tử Võ Thị Hương Lan NXB Đại học quốc gia Hà Nội 2007 181 tr Từ khoá: ADN, GEN, genome, nhiễm sắc thể, ty thể, lục tạp, geomic, ADN, tái tổ hợp, ngân hàng ADNc, cDNA, ADN genome , phản ứng PCR, kỹ thuật gen, phương pháp lai, Protein, tổng hợp protein, vận chuyển protein, tín hiệu tế bào, truyền tín hiệu tế bào, Thụ thể tyrosine kinase, Protein G, sinh trưởng, phát triển, hệ gen lưỡng bội, phơi, chu trình tế vào, phân chia tế bào Tài liệu Thư viện điện tử ĐH Khoa học Tự nhiên sử dụng cho mục đích học tập nghiên cứu cá nhân Nghiêm cấm hình thức chép, in ấn phục vụ mục đích khác khơng chấp thuận nhà xuất tác giả Mục lục LỜI NÓI ĐẦU U Chương ADN VÀ GEN 1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.3 1.3.1 1.3.2 1.4 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.5 1.5.1 1.5.2 1.6 1.7 Khái niệm gen Genome (hệ gen) 10 Genome tế bào prokaryot (tế bào nhân sơ) 11 Genome tế bào eukaryot (tế bào nhân thực) 13 Cấu trúc sợi nhiễm sắc tế bào eukaryot 14 Histone cấu trúc nucleosome 15 Methyl hoá ADN 17 Các gen genome eukaryot 18 Các gen họ gen 20 Gen lặp lặp lại liên tục 21 Pseudogen (gen giả) 23 Thành phần ADN lặp lại genome eukaryot 23 ADN vệ tinh (satelitte DNA) ADN tiểu vệ tinh (minisatelitte DNA) 23 Các đoạn ADN có khả di chuyển 24 Tương tác T-ADN với genome thực vật 29 ADN ty thể lục lạp 32 1.7.1 1.7.2 1.8 ADN ty thể 32 ADN lục lạp 33 Genomics 33 1.8.1 So sánh genome 33 1.8.2 Genome người 34 1.8.3 Nghiên cứu Genomics thực vật 35 Chương HOẠT ĐỘNG CỦA GEN TRONG TẾ BÀO .38 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.3 2.4 Kiểm soát hoạt động gen phiên mã 41 Kiểm soát khởi đầu phiên mã 42 Kiểm soát kết thúc phiên mã 50 Các protein điều khiển (regulatory proteins) 51 Kiểm soát sau phiên mã 53 Kìm hãm dịch mã liên quan đến cấu trúc vùng 5'UTR phân tử ARNm 53 Độ dài đuôi polyA ảnh hưởng tới độ bền vững phân tử ARNm 54 Độ bền vững ARNm 54 ARN anti-sense 55 Phản ứng đọc sửa ARNm - "RNA editing" 56 Kiểm soát giai đoạn dịch mã sau dịch mã 57 Biến đổi phân tử ARNm tế bào eukaryot 59 2.4.1 Phản ứng cắt intron nối exon 60 2.4.2 Các intron có khả tự cắt khỏi phân tử ARNm-Phản ứng self-splicing 62 2.4.3 Phản ứng trans-splicing nối hai exon hai phân tử ARNm 64 2.4.4 Cấu trúc chung phân tử ARNm 64 Chương KỸ THUẬT ADN TÁI TỔ HỢP 66 3.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4 3.5 3.5.1 3.5.2 3.5.3 3.5.4 3.6 3.7 3.7.1 3.7.2 3.8 3.8.1 3.8.2 3.8.3 3.8.4 3.8.5 Phân cắt, phân ly ADN 66 Đưa đoạn ADN vào vector 67 Các vector sử dụng kỹ thuật tách dòng 68 Đưa ADN vào vector 70 Ngân hàng ADN 72 Ngân hàng ADNc (cDNA library) 72 Ngân hàng ADN genome (genomic DNA library) 74 Sàng lọc dòng từ ngân hàng ADN 76 Phương pháp sàng lọc chung 76 Phương pháp sàng lọc phân biệt "differential screening" 77 Phương pháp dọc nhiễm sắc thể “chromosome walking” 78 Nhảy bước nhiễm sắc thể “jumping on chromosome” 80 Các phương pháp lai 80 Phương pháp Southern blots 81 Phương pháp northern blots 82 Kỹ thuật lai in-situ 82 Điều kiện phản ứng lai 82 RFLP nghiên cứu genome lập đồ gen 83 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 86 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 87 Một số dạng phản ứng PCR 88 Kỹ thuật gen 89 Nghiên cứu vai trò ADN điều khiển, chức gen protein 89 Thay gây đột biến gen 92 Gây tăng cường chức gen 93 Gen báo cáo “reporter gene” 96 Biến đổi genome thực vật 96 Chương TỔNG HỢP VÀ VẬN CHUYỂN PROTEIN 98 4.1 4.2 4.3 4.3.1 4.3.2 4.4 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.5 4.6 Vai trò ARN vận chuyển (ARNt) tổng hợp protein 98 Tổng hợp protein máy Ribosome 100 Vận chuyển protein 102 Vận chuyển vào mạng lưới nội chất 103 Vận chuyển protein cấu trúc màng (membrane proteins) 105 Biến đổi sau dịch mã kiểm tra chất lượng protein khoang ER 108 Tạo cầu liên kết disulfide (S-S) cuộn gấp khoang ER 108 Hình thành cấu trúc multimer từ chuỗi peptide 109 Quá trình đường hoá protein 109 Vận chuyển từ mạng lưới nội chất đến Golgi Lysosome 110 Vận chuyển từ Golgi đến bề mặt tế bào: Con đường tiết ngoại bào (exocytosis) 110 Chương TRUYỀN TÍN HIỆU TẾ BÀO .112 5.1 5.2 5.2.1 5.2.2 5.3 5.4 5.4.1 5.4.2 5.5 5.5.1 5.5.2 5.5.3 5.6 5.7 5.7.1 5.7.2 5.7.3 5.8 Thụ thể bề mặt tế bào 114 Thụ thể nối với protein G 117 Protein G 117 Hoạt hố ức chế cAMPase thơng qua protein G 119 Protein kinase phụ thuộc cAMP (cAPK kinase A) 121 Thụ thể tyrosine kinase protein Ras 124 Thụ thể tyrosine kinase (RTKs) 124 Protein Ras chuỗi phản ứng truyền tín hiệu hoạt hoá thụ thể tyrosine kinase 127 Tín hiệu thứ cấp Ca+2 chuỗi truyền tín hiệu 129 Inositol phospholipid 130 Inositol triphosphate (IP3) vận chuyển Ca+2 khỏi ER 130 Calmodulin- protein tạo phức với Ca+2 tế bào 132 Khuếch đại tín hiệu bên ngồi tế bào 133 Truyền tín hiệu qua thụ thể nối với enzym bề mặt tế bào 135 Thụ thể guanylyl cyclase 135 Các oncogene tín hiệu dẫn truyền từ thụ thể tyrosine kinase 136 Protein MAP kinase 136 Tyrosine kinase phối hợp với thụ thể Thụ thể Tyrosine phosphatase 137 Chương CHU TRÌNH VÀ PHÂN CHIA TẾ BÀO 139 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 Những đặc tính chu trình tế bào 139 Chu trình tế bào giai đoạn phát triển phôi sớm 143 Protein cyclin 145 Nấm men hệ thống kiểm soát chu trình tế bào 147 Kiểm soát phân bào động vật 150 Vai trò sợi vi ống tubulin phân bào 152 Chương SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN 154 7.1 Kiểm sốt xác định giới tính 155 7.2 Phát triển ruồi giấm Drosophila 158 7.3 Hoạt động gen có nguồn gốc từ mẹ q trình hình thành trục đầu-đi trục lưng-bụng 159 7.3.1 7.3.2 7.3.3 7.3.4 Nhóm gen định phát triển phần đầu ngực ấu thể (anterior-group genes) 160 Nhóm gen qui định phát triển phần đuôi (posterior-group genes) 162 Nhóm gen qui định phát triển trục lưng-bụng (dorsoventral-group genes) 162 Nhóm gen qui định phát triển cấu trúc tận ấu thể (terminal-group genes)164 7.4 Hoạt động gen hệ gen lưỡng bội (phôi) 164 7.3.5 Các gen tạo đốt "gap" 166 7.3.6 7.3.7 Các gen cặp đốt "pair-rule" 166 Các gen phân cực đốt 167 7.5 Các gen chọn lọc 167 Lời nói đầu Với mong muốn chia sẻ bạn đọc mối quan tâm Sinh học phân tử, lĩnh vực học tập nghiên cứu Việt Nam, xuất sách "Một số vấn đề Sinh học phân tử" nhằm giới thiệu trình quan trọng xảy tế bào (trình bày chương 1, 2, 4, 5, chương 7) số kỹ thuật sử dụng để nghiên cứu q trình (chương 3) Những q trình nghiên cứu mức độ phân tử phần làm sáng tỏ giống khác cấu trúc genome, cấu trúc gen tế bào prokaryot eukaryot (chương 1) Những cấu trúc liên quan đến cách thức kiểm sốt hoạt động gen giai đoạn phiên mã, sau phiên mã dịch mã để tổng hợp protein (chương 2) Quá trình tổng hợp protein, biến đổi cấu trúc protein cách thức để nhận biết vận chuyển protein đặc hiệu đến vị trí đích khác tế bào tiết bên giới thiệu chương Ngoài ra, chức hoạt tính protein tham gia trình truyền tín hiệu trình bày chương 5; protein tham gia chu trình tế bào trình bày chương protein tham gia kiểm sốt biệt hố, phát triển, sinh trưởng hình thành thể giới thiệu chương Để học kiến thức chuyên sâu lĩnh vực sinh học phân tử, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy, cô Khoa Sinh học Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội (nay Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) Đồng thời xin chân thành cảm ơn Phó Giáo sư Trương Nam Hải Giáo sư Nguyễn Mộng Hùng có nhận xét góp ý quý báu cho sách Lần đầu xuất bản, chắn sách cịn có thiếu sót, tơi mong nhận phê bình, góp ý bạn đọc đồng nghiệp Với cảm ơn chân thành! Tác giả Chương ADN VÀ GEN 1.1 Khái niệm gen Trải qua thời gian dài, khái niệm định nghĩa gen hình thành dựa vào kết thí nghiệm, trước hết thí nghiệm di truyền cổ điển Đầu tiên, từ phép lai đậu có tính trạng khác theo dõi di truyền chúng, Menden đưa kết luận tính trạng định allen gen Một gen có nhiều allen Mức độ biểu tính trạng phụ thuộc vào kết hợp hai allen Đơn giản gen có allen (Aa) Khi tính trạng biểu mức độ khác nhau: trội (AA), bán trội (Aa), lặn (aa) Tiếp theo đó, với loạt thí nghiệm tiến hành ruồi giấm Drosophila, Morgan cộng nhận thấy số tính trạng định khơng phải alen gen mà nhiều gen Điều quan trọng nữa, dựa vào tần số trao đổi chéo hai nhiễm sắc thể tương đồng trình phân bào giảm nhiễm (meiosis), Morgan lập đồ di truyền (genetic map) cho phép xác định vị trí gen nhiễm sắc thể Hai gen gần tần số trao đổi chéo chúng nhỏ Trên thực tế, đồ di truyền cho biết vị trí gen liên quan đến tính trạng đột biến mà khoảng cách chúng tính tần số trao đổi chéo (cM) Tuy nhiên, trao đổi chéo không xảy vị trí sợi nhiễm sắc thể khiến cho khoảng cách vị trí đồ di truyền lúc tỷ lệ với tần số trao đổi chéo Trước năm 1940, vị trí gen nhiễm sắc thể xem hạt cườm chuỗi Trao đổi chéo xem xảy gen mà xảy gen Vì vậy, từ kết thí nghiệm, nhà di truyền đưa đặc tính để xác định gen: Gen qui định tính trạng quan sát chiếm vị trí nhiễm sắc thể Gen xem đơn vị di truyền nhỏ bị đột biến Gen xem đơn vị di truyền nhỏ mà trao đổi chéo xảy gen Trao đổi chéo thực gen tương đồng Từ đặc tính này, rõ ràng hai tính trạng khơng giống phân biệt phải hai gen khác qui định Rõ ràng, khái niệm gen ban đầu cho phép xác định mối tương quan theo kiểu đột biến - tính trạng - gen Trong thực tế, việc xác định tần số trao đổi chéo để tìm vị trí gen gặp nhiều khó khăn phải sàng lọc cá thể đột biến từ số lượng cá thể lớn hệ cháu qua phép lai khác Mặt khác, phân tích trao đổi chéo, vị trí gen xác định đồ di truyền không phản ảnh chức riêng biệt chúng Nhược điểm khắc phục nhờ thí nghiệm bổ trợ chức (complementation tests) Ví dụ, kết hợp tế bào nấm men Neurospora dạng đơn bội bị đột biến có biểu khả mọc môi trường thiếu histidine, nhà di truyền nhận số tế bào luỡng bội phục hồi khả sinh sơi mơi trường khơng có histidine Kết phép lai dịng tế bào đột biến cho phép xác định tính trạng liên quan đến hai gen khác đường sinh tổng hợp histidine Dựa vào tần số trao đổi chéo, gen có vị trí phân bố điểm khác đồ di truyền Như vậy, thí nghiệm bổ trợ chức cho phép phân biệt gen nhóm gen qui định tính trạng Các nghiên cứu nhà di truyền Clarence P Oliver Melvin M Green thực ruồi giấm phát thấy trao đổi chéo xảy gen Nói cách khác, gen chứa nhiều đột biến khác Nhà di truyền học Seymour Benzer xác định 199 vị trí đột biến gen rIIA thực khuẩn thể T4 Đặc biệt nhờ vào việc khám phá cấu trúc ADN, Charles Yanofsky cộng lần đưa chứng rõ ràng trao đổi chéo xảy nucleotide gen nghiên cứu gen mã cho enzym tổng hợp tryptophan E.coli Nhờ kết đặc biệt quan trọng mà khái niệm gen hoàn thiện Lúc gen xem đoạn nucleotide mang mã di truyền cho acid amin sợi peptide Từ khái niệm ban đầu cho gen hạt cườm chuỗi (chuỗi nhiễm sắc thể genome) trao đổi chéo đột biến xảy hạt cườm nhà di truyền học tìm mối liên hệ tuyến tính mã di truyền ba gen với trật tự acid amin sợi polypeptide Hình 1.1: Hai protein mã đoạn ADN điểm bắt đầu (hoặc kết thúc) trình phiên mã tổng hợp ARNm xảy vị trí khác đoạn ADN tạo sợi ARNm khác (A) điểm khởi đầu dịch mã tổng hợp protein phân bố vị trí khác sợi ARNm (B) Tuy nhiên, khái niệm gen nêu khơng thể giải thích cho số tượng sau: a/ Hiện tượng gen gối lên (overlapping genes): đoạn ADN hai gen không nằm mà gen nằm gối đầu lên gen Như thế, phần ADN có gen nằm gối lên chứa mã di truyền cho hai gen Có thể xảy trường hợp sau: * Hai phân tử ARNm phiên mã từ vị trí bắt đầu kết thúc khác đoạn ADN Kết hai phân tử protein (được dịch mã từ hai sợi ARNm) có chứa đoạn acid amin giống hệ hai protein chức khác tế bào (Hình 1.1A) * Một phân tử ARNm phiên mã từ đoạn ADN dùng làm khuôn để tổng hợp hai chuỗi polypeptide khác điểm bắt đầu dịch mã (start codon) phân bố lệch (hiện tượng lệch khung đọc) Hai protein khác hồn tồn trình tự acid amin chức tế bào (Hình 1.1B) b/ Một đoạn ADN mang mã di truyền gen nên phiên mã tổng hợp nên loại ARNm khác Điều xảy mã di truyền phân bố theo khung đọc khác đoạn ADN (Hình 1.2) Do đó, hai protein có thành phần acid amin chức khác hoàn toàn tổng hợp Một đột biến xảy vị trí đoạn ADN gây ảnh hưởng đến hai gen Điều gây khó khăn cho việc xác lập đồ tính trạng Hình 1.2: Hai gen mã cho hai protein nằm đoạn ADN mã di truyền hai gen phân bố theo khung đọc khác c/ Đối với sinh vật eukaryot, gen thường bao gồm đoạn nucleotide chứa mã di truyền (exon) xen kẽ với đoạn không chứa mã (intron) Các exon intron phiên mã sang phân tử ARN (gọi phân tử tiền thân ARN thông tin-ARNm) Sau đó, intron bị cắt bỏ đi, exon nối lại với theo thứ tự để tạo phân tử ARNm hồn chỉnh Có thể xảy trường hợp số intron tất intron bị loại khỏi phân tử ARNm Mặt khác xảy tất exon số exon nối với Việc lựa chọn intron để cắt tạo phân tử ARNm khác chúng xuất phát từ loại ARNm tiền thân phiên mã từ khn ADN (Hình 1.3) Đây tượng cắt nối intron-exon luân phiên (alternative splicing) Hình 1.3: Quá trình lựa chọn, cắt intron (I) nối exon (E) theo thứ tự khác để tạo phân tử ARNm giống số exon (E1 E3) Chúng mã cho hai chuỗi polypeptide có chức khác tế bào d/ Gen mã cho polyprotein: Polyprotein sản phẩm việc dịch mã từ phân tử ARNm, sau phân tử protein bị cắt thành đoạn peptide nhỏ Phân tử polyprotein khơng có hoạt tính Chỉ có đoạn peptide có chức khác Ví dụ, hormon adrenocorticotropic (ACTH), lipotropic (LPHs), hormon kích hoạt melanocyte (MSHs) enkephalin tạo từ phân tử proopiomelanocortin ban đầu (Hình 1.4) Như thực tế, đoạn ADN chép loại ARNm có nhiều loại protein tạo thành e/ Một số gen không mang thông tin di truyền cho protein: Một điều rõ ràng phân tử ARN ribosome (ARNr), ARN vận chuyển (ARNt) chép từ ADN chúng khơng dịch mã Ngồi ra, nhân tế bào eukaryot cịn tìm thấy phân tử ARNsn kích thước nhỏ (small nuclear RNA) đảm nhiệm nhiều chức khác tham gia vào việc biến đổi phân tử ARNm (cắt intron nối exon), kiểm tra lại thông tin di truyền chúng (cơ chế đọc sửa ARNm), tác động đến độ bền vững ARNm tế bào chất tham gia vào chế bất hoạt gen (ARNi-interference RNA tạm dịch ARN nhiễu) Do đó, đoạn ADN mã cho loại ARN phải xác định gen lẽ đột biến chúng liên quan đến việc xuất tính trạng lạ Hình 1.4: Phân tử proopiomelanocortin phân cắt để tạo hormon MSH, LPH, CLIP β-endorphin có hoạt tính Từ khái niệm gen hình thành thay đổi dần để phù hợp với kết thí nghiệm, sinh học phân tử ngày định nghĩa gen sau: Gen đoạn ADN cần thiết cho tổng hợp polypeptide có hoạt tính phân tử ARN cần thiết cho hoạt động tế bào Như vậy, gen bao gồm vùng chứa mã di truyền (codon region) mà gồm đoạn ADN (các vùng ADN điều khiển (regulatory elements)) cần thiết cho việc phiên mã (Hình 1.5) Mặt khác, có đoạn ADN có cấu trúc hay trình 10 tự nucleotide giống gen chúng không phiên mã không biểu chức nên chúng khơng thể xem gen Hình 1.5: Cấu trúc gen mã cho protein tế bào nhân thực (eukaryote gene) Vị trí nucleotide phiên mã sang phân tử ARN ký hiệu +1 Nucleotide nằm trước vị trí +1 ký hiệu –1 (khơng có vị trí 0) Các nucleotide nằm trước vị trí ( +1) thuộc vùng promoter Các intron nằm xen kẽ exon Intron bị loại khỏi phân tử ARNm phản ứng cắt nối intron-exon (spilicing) Chiều phiên mã mũi tên 1.2 Genome (hệ gen) Genome chứa tồn thơng tin di truyền lập trình đảm bảo hoạt động sống cho tế bào Đa số genome vi khuẩn phân bố nhiễm sắc thể có kích thước nhỏ có dạng vịng khép kín Ngược lại, phần genome nhân tế bào eukaryot thường lớn phân bố nhiễm sắc thể dạng thẳng Thông tin di truyền không nằm trình tự nucleotide (genetic information) mà phụ thuộc nhiều vào cấu hình khơng gian nhiễm sắc thể (di truyền ngoại sinh- epigenetic information) Trình tự nucleotide toàn genome xác định số sinh vật mơ hình (model organisms) đại diện cho giới sinh vật vi khuẩn E.coli, nấm men, ruồi giấm, giun tròn, Arabidopsis người Bản đồ mà khoảng cách vị trí tính đơn vị nucleotide xem xác Bản đồ gọi đồ vật lý (physical map) Ngồi cịn có số loại đồ khác Ví dụ, đồ di truyền (genetic map) cho biết mối liên hệ vị trí nhóm gen với hay thị (markers) nhiễm sắc thể Các thị hình thái (biểu tính trạng), đa dạng protein (protein polymorphisms), đa dạng độ dài đoạn giới hạn (restriction fragment length polymorphisms-RFLPs), đa dạng độ dài trình tự đơn giản (simple sequence length polymorphisms-SSLPs) đa dạng đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên (randomly amplified polymorphic DNA-RAPD) Khoảnh cách vị trí đồ di truyền tính cM (centiMorgan) dựa vào tần số trao đổi chéo Hai vị trí gần khó xảy trao đổi chéo chúng phân bào giảm nhiễm Tuy nhiên, trao đổi chéo không xảy vị trí nhiễm sắc thể nên đơn vị centiMorgan khơng phản ảnh xác khoảng cách vị trí đồ di truyền Kết hợp đồ vật lý đồ di truyền cho biết xác khoảng cách gen (tính trạng), thị phân tử liên quan đến tính trạng cần nghiên cứu Genome đơn tập hợp gen Genome vi khuẩn sinh vật eukaryot bậc thấp thường không lớn gen phân bố sát Hầu hết gen có genome bị gián đoạn đoạn ADN không chứa mã di truyền (intron) Ngược lại, thành phần ADN chứa gen chiếm tỷ lệ nhỏ so với toàn genome tế bào eukaryot bậc cao Các gen tế bào eukaryot bậc cao thường chứa nhiều intron phân bố xa Từ năm 70, thí nghiệm gây bão hồ đột biến, nhà di truyền học xác định số gen nằm đoạn nhiễm sắc thể ... Nam, xuất sách "Một số vấn đề Sinh học phân tử" nhằm giới thiệu trình quan trọng xảy tế bào (trình bày chương 1, 2, 4, 5, chương 7) số kỹ thuật sử dụng để nghiên cứu q trình (chương 3) Những trình... chuyên sâu lĩnh vực sinh học phân tử, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy, cô Khoa Sinh học Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội (nay Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội)... thứ tự để tạo phân tử ARNm hồn chỉnh Có thể xảy trường hợp số intron tất intron bị loại khỏi phân tử ARNm Mặt khác xảy tất exon số exon nối với Việc lựa chọn intron để cắt tạo phân tử ARNm khác