Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O TRƯ NG Đ I H C M THÀNH PH H CHÍ MINH KHOA CƠNG NGH SINH H C Giáo trình TH C T P VI SINH GÂY B NH Biên so n: Dương Nh t Linh Nguy n Văn Minh Tp.HCM, năm 2008 (Lưu hành nội bộ) Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh M CL C PH N 1: M T S K THU T CƠ B N Bài 1: Kh o sát tr c ti p BÀI 2: K thu t kháng sinh đ PH N 2: M T S K THU T Đ NH DANH VI KHU N BÀI 1: K thu t đ nh nhóm c u khu n BÀI 2: K thu t đ nh danh ph y khu n t BÀI 3: K thu t đ nh danh tr c khu n m xanh BÀI 4: K thu t đ nh danh vi khu n thương hàn Salmonella typhi PH N 3: K THU T PHÂN TÍCH B NH PH M BÀI 1: Phương pháp l y g i b nh ph m BÀI 2: Phân tích b nh ph m: m u m ch t d ch PH N 4: PH N NG HUY T THANH H C BÀI 1: Ph n ng ngưng k t kháng nguyên - kháng th BÀI 2: Ph n ng ngưng k t h ng c u HA (Hemagglutination test) Ph n ng ngăn tr ngưng k t h ng c u HI (Hemagglutination Inhibition test) Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh PH N 1: M T S K THU T CƠ B N Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh Bài 1: KH O SÁT TR C TI P I/ CÁC PHƯƠNG PHÁP KH O SÁT TR C TI P Soi tươi - Qua kính hi n vi thư ng + Soi tươi không c n n n, phương pháp soi tươi qua kính hi n vi đóng b t t quang, v i b nh ph m đư c đ t m t gi t nư c mu i sinh lý m t lame kính, treo hay ép dư i m t lamelle Phương pháp n y dùng đ xem s di đ ng c a vi khu n + Soi tươi c n n n, phương pháp soi tươi qua kính hi n vi đóng b t t quang v i b nh ph m đư c đ t m t gi t dung d ch màu làm n n dung d ch m c tàu; nigrosin; methylene blue, m t lame kính, ép dư i m t lamelle Phương pháp n y dùng xem nang vi khu n, hay tìm n m men có b nh ph m Cryptococcus neoformans d ch não tu - Qua kính hi n vi n n đen hay đ o phase + Qua kính hi n vi n n đen, m c đích thơng thư ng nh t xem hình d ng s di đ ng c a vi khu n có m t b nh ph m đ t m t gi t nư c mu i sinh lý m t lame kính ép dư i m t lamelle Phương pháp đư c dùng đ tìm xo n khu n giang mai, vi khu n leptospira, hay kh o sát s di đ ng vi khu n + Qua kính hi n vi đ o phase, m c đích thơng thư ng nh t xem nang vi khu n S pneumoniae, hay tìm n m men có b nh ph m Cryptococcus neoformans d ch não Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh tu Nhu m - Nhu m Gram, phương pháp nhu m thông thư ng nh t phịng thí nghi m vi sinh Phương pháp nhu m Gram cho phép xác đ nh đư c hình d ng, cách s p x p, phân bi t vi khu n thu c lo i Gram [+] hay Gram [-] - Nhu m đơn Methylene blue ki m, phương pháp hay đư c dùng đ nhu m kh o sát có s hi n di n c a vi khu n Corynebacteria hay khơng phương pháp n y cho phép nhu m vi khu n h t bi n s c có vi khu n - Nhu m kháng acid, phương pháp hay đư c dùng đ nhu m phát hi n vi khu n kháng acid Mycobacteria - Phương pháp nhu m huỳnh quang, phương pháp nhu m vi khu n b ng ph m màu huỳnh uang, ch áp d ng cho m t s trư ng h p nhu m huỳnh quang rhodamin ph tđàm tìm vi khu n lao - Phương pháp nhu m kháng th đ c hi u đánh d u men hay đánh d u huỳnh quang, phương pháp phát hi n tr c ti p vi sinh v t mu n tìm có b nh ph m nh kháng th đ c hi u kháng nguyên vi sinh v t đư c đánh d u b ng men (phát hi n qua quan sát b ng kính hi n vi thư ng) hay b ng huỳnh quang (phát hi n qua quan sát b ng kính hi n vi huỳnh quang) - Các phương pháp nhu m khác, nhu m nang, flagella, spore…ch đư c dùng trư ng h p đ c bi t Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh II VAI TRÒ VÀ Ý NGHĨA C A KH O SÁT TR C TI P Cho k t qu r t s m, g n chung cu c Có nh ng k t qu kh o sát tr c ti p giúp bác sĩ lâm sàng phịng thí nghi m nghĩ đ n tác nhân gây b nh v i s xác g n 99%, ví d : - K t qu kh o sát tr c ti p d ch não tu th y có song c u Gram []; nghĩ đ n tác nhân N meningitidis, th y song c u Gram [+] hình mũi giáo; nghĩ đ n S pneumoniae, hay th y tr c khu n Gram [-] nh ; nghĩ đ n H influenzae… - K t qu soi tươi m ni u đ o t đàn ông th y có song c u Gram [-]; nghĩ đ n tác nhân N gonorrhoeae… - K t qu soi tươi d ch não tu th y có n m men có nang; nghĩ đ n tác nhân n m men C neoformans… - K t qu kh o sát tr c ti p ph t qu t c t cung phát hi n C trachomatis b ng phương pháp nhu m kháng th huỳnh quang đ c hi u C trachomatis dương tính đ đ k t ku n b nh nhân b nhi m vi khu n Các k t qu r t có giá tr giúp cho bác sĩ u tr ch n đư c kháng sinh u tr ban đ u, giúp phịng thí nghi m bi t đư c hư ng phân l p; đ nh danh; kháng sinh đ xét nghi m c y phân l p ti p theo Cho k t qu s m g i ý R t nhi u k t qu kh o sát tr c ti p, n u bi t t n d ng, bác sĩ lâm sàng s có hư ng u tr ban đ u phịng thí nghi m có hư ng phân l p đ nh danh Ví d : - Kh o sát tr c ti p nư c ti u, th y có vi khu n/quang trư ng Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh x100, có th nghĩ b nh nhân b nhi m trùng ti u có th ch n l a kháng sinh u tr bư c đ u tùy theo hình nh Gram c a vi khu n hi n di n m u - Kh o sát ph t nhu m Gram m u m , hay abcess, hình nh vi khu n th y b nh ph m qua ph t nhu m Gram g i ý đư c tác nhân vi khu n gây b nh, nh bác sĩ lâm sàng s có hư ng u tr ban đ u phịng thí nghi m có hư ng phân l p đ nh danh… Cho k t qu đánh giá m u có tin c y đ ni c y phân l p hay không, cho k t qu g i ý - Làm m t ph t Gram m u đàm, quan sát quang trư ng x100, có th đánh giá m u tin c y hay khơng đ có th ti p t c th c hi n q trình ni c y phân l p - Cũng qua ph t nhu m Gram m u đàm, Mn u m u tin c y, có th ti p t c qua quang trư ng x1.000 đ quan sát hình nh Gram vi khu n hi n di n, k t qu n y s r t có giá tr g i ý cho phịng thí nghi m hư ng phân l p vi khu n gây b nh, bác sĩ s có th có hư ng dùng kháng sinh u tr ban đ u Có nh ng trư ng h p m u không c n ph i làm kh o sát tr c ti p - M u quy t h ng, n u khơng có yêu c u tìm vi khu n b ch h u khơng c n thi t ph i làm kh o sát tr c ti p khơng có s khác bi t gi a m u không bênh v i m u b nh - M u phân, n u khơng có u c u tìm Campylobacter, V cholerae khơng c n thi t ph i làm kh o sát tr c ti p Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh III/ CÁC PHƯƠNG PHÁP NHU M A/ NGUYÊN T C CHUNG KHI LÀM TIÊU B N NHU M 1/ Ph t kính tiêu b n Lau nh tiêu b n s ch b ng gi y m m, hơ qua đèn c n Dùng bút chì m ho c bút lông ghi tên m u, v vòng tròn φ ≈ 15mm, m t dư i lame kính đ đánh d u v t khu n phía lame Đ t nóng đ que c y ( trư c sau thao tác ), m nút bông, hơ nhanh mi ng ng nghi m Trư ng h p 1: m u nuôi c y canh dinh dư ng, đưa đ u que c y vào mi ng ng nghi m ( v n gi g n ng n l a ), nhúng vào dung d ch canh c y, l y vòng que c y L y que c y ra, hơ nhanh mi ng ng nghi m nút bông, đ y nút bơng l i Ph t canh khu n vịng que c y vào m t lam, gi a vòng tròn,dàn đ u xung quanh Trư ng h p 2: m u nuôi c y th ch dinh dư ng, nh gi t dung d ch NaCl 9‰ lên gi a vòng tròn (m t lam Thao tác gi ng trư ng h p 1, dùng c nh vòng tròn c a đ u que c y đ t nh lên khu n l c vi khu n, r i đ t vào gi t NaCl 9‰ lam, dàn m ng đ u 2/ C đ nh m u: M c đích gi t ch t vi khu n làm cho vi khu n bám ch t vào lame C đ nh m u b ng cách đ khô t nhiên Chú ý: N u c đ nh không t t vi khu n s trơi q trình nhu m Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh Khi c đ nh m u, ch hơ nhanh ch không đ t ng n l a Không đư c ch m vào thành đưa đ u que c y vào kh i ng nghi m vi khu n Hình 1: Sơ đ th t ph t kính B/ CÁC PHƯƠNG PHÁP NHU M 1/ Phương pháp nhu m gram ( Christian Gram ): Dùng phân bi t vi khu n gram dương gram âm Ø Nguyên t c: Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh Nhu m Gram, phương pháp nhu m thông thư ng nh t phịng thí nghi m vi sinh Phương pháp nhu m Gram cho phép xác đ nh đư c hình d ng, cách s p x p phân bi t vi khu n thu c lo i Gram[+] hay Gram[-] Do s khác bi t v c u trúc vách t bào nên trình nhu m Gram, vi khu n Gram [+] s gi đư c ph c h p tím Gentian-iode khơng b t y màu b i alcool, vi khu n Gram [-] không gi đư c ph c h p màu này, v y k t qu sau nhu m vi khu n Gram [+] v n gi đư c màu tím c a gentian, cịn vi khu n Gram [-] ăn màu h ng c a ph m màu safranin hay fuchsin Ø Thao tác: - Đ t tiêu b n ph t kính c đ nh m u lên th y tinh ch U, thau nh a - Đ t mi ng gi y l c lên vịng ph t kính - Nh dd Crystal violet th m t h t gi y l c Đ t – phút ( n u vi khu n l y t canh l ng đ phút, l y t th ch dinh dư ng đ phút ) R a nư c, th m khô - T y c n 96o t 15 – 30 giây ( t canh l ng t y 15 giây, t th ch dinh dư ng t y 30 giây ) R a nư c, th m khô T y c n b ng cách đ nghiêng tiêu b n, cho c n ch y t t phi n kính Quan sát mép mép dư i cho đ n gi t c n v a m t màu tím - Đ t mi ng gi y l c lên v t khu n, nh dung d ch Fuschin ki m loãng (ho c Safranin O), đ phút R a nư c, th m khơ - Quan sát b ng v t kính d u, đ phóng đ i 1.000 l n Vi khu n Gr+ b t màu tím Crystal violet, vi khu n Gr– b t màu h ng Fuschin ( Safranin O) 10 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh - ng mao qu n khuyên c y khu n: đ l y ch t ngo i ti t l ng bên ngồi - Que bơng: dùng l y b nh ph m l t nhiên, nh t v Ø D ng c đ ng b nh ph m - Chai có n p v n: đ ng đàm, nư c d dày, m nh mô, phân - ng nghi m có n p v n: đ ng b nh ph m l ng - H p petri - Chai l n: đ ng nư c ti u tìm tr c khu n lao CÁCH G I B NH PH M 2.1 Ngo i tr máu, ph i cho vào chai hay ng môi trư ng c y máu sau l y 2.2 Các b nh ph m khác nên cho vào chai môi trư ng chuyên ch Cary Blair v i que t m b nh ph m 2.3 N u c n ch xa nên hàn n p chai môi trư ng chuyên ch b ng parafin cho vào h p có l p, chèn bơng c n th n cho kh i v (phi u th nghi m chèn vào l p c a h p) 2.4 Ph i g i b nh ph m đ n phịng thí nghi m vịng 24h 66 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh BÀI 2: PHÂN TÍCH B NH PH M- CÁC M U M VÀ CH T D CH Ch đ nh - T t c trư ng h p có m , ch t d ch như: - M áp xe - V t thương nhi m trùng, bao g m v t loét, c t, l , m h u ph u, loét n m lâu - Các m ch lươn - Các m ch d n t xoang hay h ch b ch huy t - Các d ch ti t d ch màng ph i, kh p, màng b ng - Các m u n o m xương gi i ph u Các lo i b nh ph m cách l y M áp xe, d ch màng ph i, màng b ng, kh p: l y b ng phương pháp vô trùng làm ti u ph u, sau sát trùng vùng da bên ngồi ch khơ, ch c kim hút l y m hay ch t d ch Cho m hay ch t d ch vào l l y b nh ph m vô trùng (n p v n ch t) hay tube Eppendorf biopure (tinh s ch sinh h c), hay đ nguyên ng kim hút m , r i g i đ n phịng thí nghi m đ u c u c y Có th t m m vào tăm r i cho vào môi trư ng chuyên ch Stuart-Amies (dùng c p tube đũa tăm vơ trùng/tube đũa Stuart-Amies), hay có th c y t i giư ng b nh v i chai m t th ch c y d ch không t p nhi m (xem gi i thi u chai m t th ch c y DNT d ch không t p nhi m) r i chuy n v phịng thí nghi m Các v t thương nhi m trùng: lau s ch vùng da lành chung quanh v i c n 70% Lau s ch m v t thương b ng g c vô trùng th m nư c mu i sinh lý vô trùng Dùng tăm vô trùng l y m u đ qu t l y m , ch t d p nát, hay mô (ngay dư i l p m chùi 67 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh s ch); hay l y m u cho vào l l y b nh ph m vô trùng, hay tube Eppendorf biopure r i g i đ n phịng thí nghi m đ yêu c u c y N u chưa có th g i ngay, cho tăm bơng qu t m vào môi trư ng chuyên ch Stuart-Amies (dùng c p tube đũa tăm vô trùng/tube đũa Stuart-Amies) Các n o m hay mô gi i ph u: đư c l y b ng qu t tăm hay tr c ti p cho m u vào l l y b nh ph m vô trùng, hay tube Eppendorf biopure r i g i đ n phịng thí nghi m N u chưa có th g i ngay, cho vào môi trư ng chuyên ch Stuart-Amies (dùng c p tube đũa tăm vô trùng/tube đũa Stuart-Amies) Các m ch lươn hay m ch d n: dùng tăm mãnh vô trùng lu n vào m ch lươn; hay pipette Pasteur nh a hút l y m cho vào l l y b nh ph m vô trùng, hay tube Eppendorf biopure r i g i đ n phịng thí nghi m N u chưa có th g i ngay, cho vào mơi trư ng chuyên ch Stuart-Amies (dùng c p tube đũa tăm vô trùng/tube đũa Stuart-Amies) Kh o sát đ i th - Màu: đ , vàng, xanh… - Mùi: th i, tanh, hăng… - Tính ch t: đ c, l ng, nh y, có máu… Kh o sát vi th - Nh m Gram N u k t qu nhu m Gram th y có vi khu n thu n t, có th làm kháng sinh đ tr c ti p m u b nh ph m - Nhu m kháng acid (n u có yêu c u) Nuôi c y - C y vào h p th ch phân l p: - T i thi u BA hay BA có Nalidixic acid (BANg) MC hay 68 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh EMB - N u có u ki n, c y thêm MSA hay DNA agar, BA có Gentamicin - N u nghi n m, c y thêm th ch Sabouraud - Các h p BA ph i đư c 35-37oC t m CO hay bình n n Các trư ng h p khác, khí trư ng bình thư ng - Quan sát h p th ch liên t c ngày, m t có khúm vi khu n m c, ti n hành đ nh danh làm kháng sinh đ - C y d phòng vào m t ng Thioglycollate hay BHI, đ ng th i v i h p th ch phân l p N u h p th ch phân l p khơng có vi khu n m c mà ng BHI hayThioglycollate đ c c y phân l p t ng môi trư ng n y Các vi khu n gây b nh có th phân l p đư c Ø Thư ng g p - Streptococcus pyogenes - Staphylococcus aureus Ø Ít g p - Các tr c khu n Enterobacteriaceae - Pseudomonas tr c khu n Gram (-) khơng lên men - Streptococci ( lồi khác), - Clostridium perfringens, - Bacteroides vi khu n k khí khác Ø R t hi m g p - Bacillus anthracis - M tuberculosis - M ulcerans 69 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh - Pasteurella multocida 70 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh PH N 4: PH N NG HUY T THANH H C 71 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh BÀI 1: PH N NG NGƯNG K T KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG TH I (Agglutination) Kháng nguyên thư ng vi khu n s ng (hay ch t) Khi g p kháng th tương ng, vi khu n k t l i v i thành đám, hi n tư ng ngưng k t K t qu ph n ng có th quan sát b ng m t thư ng Cơ ch ph n ng: Trong h n d ch kháng nguyên h u hình, vi khu n phân tán xa l c, ch y u l c tĩnh n Khi cho h n h p kháng nguyên ti p xúc v i kháng th , kháng th s g n vào kháng nguyên t o nên đám ngưng k t l n c n Th c hành đ c k t qu : Nh phi n kính (g ch men) m t gi t nư c mu i sinh lý, tr n vi khu n vào đ đ i ch ng (B) Bên đ i ch ng m t h n d ch tr ng đ c đ u Nh c nh bên, m t gi t kháng huy t đ nh ngưng k t, tr n vi khu n (A) Ph n ng ngưng k t dương (+): sau phút, có ngưng k t thành nh ng h t nh , l n c n Ph n ng ngưng k t âm (–): h n d ch v n đ c đ u 72 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh gi t Kháng huy t đa giá O + vòng vi khu n Salmonella (A) (B) (+) (–) gi t nư c mu i sinh lý + vi khu n Salmonella Hình: K t qu ph n ng ngưng k t 73 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh BÀI 2: PH N NG NGƯNG K T H NG C U HA (Hemagglutination test) PH N NG NGĂN TR NGƯNG K T H NG C U HI (Hemagglutination Inhibition test) I/ PH N NG NGƯNG K T H NG C U HA (Hemagglutination test) Nguyên lý: M t s virus có kh k t dính m t h ng c u, t o c u n i làm k t t h ng c u, có th th y b ng m t thư ng ho c qua kính lúp Đây phương pháp quan tr ng đ ch ng minh kh ngưng t h ng c u c a virus thành ph n c a chúng nuôi c y t bào phơi gà, giúp ta đ nh tính đ nh lư ng đư c virus Th c hành: Ø Pha h ng c u gà 1%: L y 10ml máu gà cho vào bình tam giác có 3,5 ml dung d ch Natri citrat 3,8% đ ch ng đơng máu Ly tâm 1.500 vịng/ phút cho h ng c u l ng xu ng, hút b huy t tương, b ch c u ti u c u đi, cho NaCl 9‰ vô khu n vào r a h ng c u Ti p t c ly tâm, hút b ph n nư c (r a ly tâm l n) Gi l i ph n h ng c u, pha h ng c u 1% NaCl 9‰ vô khu n Ø Chu n b nư c tr ng ch a virus: L y não gà nghi ng m c b nh Newcastle nghi n thành huy n d ch 1/10 v i NaCl 9‰, kh t p khu n b ng kháng sinh 74 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh r i c y vào xoang ni u mô c a phôi gà p t 10 – 11 ngày, p ti p 38 oC – 39oC, sau – ngày phôi ch t (tùy đ c l c c a m m b nh), l y phôi cho vào t l nh t 0oC – oC gi đ m ch máu co l i, hút l y nư c tr ng Ø Th ph n ng: Dùng vĩ nh a ho c ng nghi m s ch L y pipette hút vào ng th nh t 0,9 ml NaCl 9‰, ng t – m i ng 0,5 ml NaCl 9‰ Dùng pipette hút vào ng th nh t 0,1 ml nư c tr ng nuôi virus, tr n đ u Hút 0,5 ml t 0,5 ml t ng sang ng 2, tr n đ u L i hút ng sang ng 3, c th cho đ n ng th Hút 0,5 ml ng th b V y hi u giá pha loãng nư c tr ng t ng th đ n 8: 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280 Cho h ng c u gà 1% vào t t c ng, m i ng 0,5 ml, l c đ u Đ yên t – 10 phút, đ c k t qu - Ph n ng âm tính: ng th ch có 0,5 ml NaCl 9‰ 0,5 ml h ng c u gà 1% Do h ng c u gà b l ng xu ng đáy thành m t c c máu tròn đ , ph n d ch Đó hi n tư ng h ng c u đóng nút - Ph n ng dương tính: h ng c u ngưng k t thành nh ng m ng h ng tr i đ u ph n đáy ng nghi m, có nh ng v t r n n t Hi u giá ngưng k t đ c ng có đ pha lỗng l n nh t mà v n có hi n tư ng ngưng k t 75 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh Đơn v Đ i ch ng NaCl 9‰ ml 0,9 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Nư c tr ng ml 0,1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 có KN B 0,5 ml t [C] pha ng 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 loãng KN ml H ng c u 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 gà 1% L c đ u, đ yên t 15 – 20 phút, đ c k t qu Quan sát hi n tư ng K t qu (+) Hi u giá (+) (+) (+) (+) n= (+) (+) (–) (–) 1/160 kháng nguyên II PH N NG NGĂN TR NGƯNG K T H NG C U HI (Hemagglutination Inhibition test) Nguyên lý: M t s virus có kh ngưng k t h ng c u, kháng huy t (antiserum) tương ng có kh làm m t hi n tư ng Ph n ng HI dùng phát hi n chu n đ kháng th (đ nh tính đ nh lư ng) có kháng huy t 76 (–) Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh Th c hành: Ø L y huy t gà b nh: L y máu tim ho c đ ng m ch c c a gà b nh cho vào bình tam giác vô khu n, đ t l nh 4oC/30 – 60 phút Nghiêng bình tam giác, dùng bơm + kim tiêm hút d ch h ng trên, cho vào ng nghi m vô khu n Ø Pha kháng nguyên hi u giá (n – 2): Gi s hi u giá đ c đư c ⇒ ph n ng HA là: n = 1/160 (n – 2) = 1/40 Dùng pipette 1ml, hút 0,1ml nư c tr ng ch a virus ( ng g c) ph n ng HA, cho vào ng nghi m nh , vô khu n L y pipette 5ml, hút v a đ 3,9ml nư c NaCl 9‰, b sung vào ng nghi m Ta đư c 4ml d ch kháng nguyên hi u giá (n – 2) = 1/40 Ø Th ph n ng: Dùng vĩ nh a ho c 10 ng nghi m s ch L y pipette hút vào ng đ u, m i ng 0,25ml NaCl 9‰, ng th 10: 0,5ml NaCl 9‰ Dùng pipette hút vào ng th nh t 0,25ml huy t gà b nh, tr n đ u Hút 0,25ml t 0,25ml t ng sang ng 2, tr n đ u L i hút ng sang ng 3, c th cho đ n ng th Hút 0,25ml ng th b V y hi u giá pha loãng huy t t ng th đ n 8: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256 Dùng pipette hút kháng nguyên chu n đ (n – 2) = 1/40 cho vào ng th đ n 9, m i ng 0,25ml L c đ u, đ yên t – 10 phút, đ KN k t h p v i KT (n u tương ng) Cho h ng c u gà 1% vào t t c ng, m i ng 0,5 ml, l c đ u Đ yên t – 10 phút 77 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh Đ c k t qu : ng th 9: đ i ch ng (–), có KN h ng c u, KN k t h p v i HC t o hi n tư ng ngưng k t ng th 10: đ i ch ng (+), ch có h ng c u, h ng c u đóng nút (t c b ngăn tr ngưng k t) - Ph n ng dương tính: nh ng ng nghi m có hi n tư ng đóng nút h ng c u Hi u giá kháng th đ pha loãng huy t cao nh t mà v n có kh ngăn tr ngưng k t HC - Ph n ng âm tính: nh ng ng nghi m có hi n tư ng ngưng k t Đơn v 10 Đ i Đ i ch ng ch ng âm NaCl dương ml 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5 ml 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0 9‰ Huy t gà b nh B 0,25 ml t [C] pha 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 ng 0 0,25 loãng HT KN ml 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 78 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh chu n đ (n2) Tr n đ u, đ yên t – 10 phút, đ KN k t h p KT (n u có) H ng ml 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 c u gà 1% Tr n đ u, đ yên t 15 – 20 phút, đ KN th a (sau ph n ng k t h p KN – KT), s ngưng k t HC Quan sát hi n tư ng K t (+) (+) (+) (–) (–) (–) (–) (–) (–) (+) qu Hi u 1/8 giá kháng th 79 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh TÀI LI U THAM KH O B môn xét nghi m (2002), Vi sinh y h c ĐH Y Dư c TPHCM B môn vi sinh (2001), Th c t p vi sinh mi n d ch ĐH Y Dư c TPHCM B môn vi sinh (2002), Vi khu n h c ĐH Y Dư c TPHCM B môn vi sinh (2001), Th c t p vi sinh mi n d ch ĐH Y Dư c TPHCM Nguy n H u Chí (2001), Các b nh nhi m trùng đư ng tiêu hóa thư ng g p NXB Y h c Phan H u Nghĩa, Tô Minh Châu (2000), Th c hành Vi sinh mi n d ch Trư ng ĐH M Bán Công Tp HCM Lê Đình Ti m c ng s (1972), K thu t xét nghi m.NXB Y h c Ph m Hùng Vân (2002), Các k thu t xét nghi m vi sinh lâm sang ĐH Y Dư c TPHCM http://www.austin.cc.tx.us/microbugz 80 ... c t p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh BÀI 2: K - Kháng sinh đ THU T KHÁNG SINH Đ phương pháp tìm đ nh y c m c a vi khu n v i lo i kháng sinh - Th nghi m kháng sinh đ... p vi sinh gây b nh - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Dương Nh t Linh BÀI 2: K THU T Đ NH DANH PH Y KHU N T I PH Y KHU N T VIBRIO CHOLERAE NƠI CƯ TRÚ VÀ TÍNH GÂY B NH Ø Dịng Vibrio g m có lo i ho i sinh, ... nghi m IMVIC: h c 4.6 Th nghi m Urea: h c 4.7 Th th c t p vi sinh s th c t p vi sinh s th c t p vi sinh s nghi m lên men lo i đư ng Mannitol, Succrose, Arabinose: h c th c t p vi sinh s 4.8