1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Cơng trình hồn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGÔ THỊ MINH PHƯƠNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN THỊ XÔ NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN NẤM MEN (SACCHAROMYCES CEREVISIAE), NẤM MỐC (ASPERGILLUS NIGER) VÀ VI KHUẨN (ACETOBACTER XYLINUM) Phản biện 1: TS Đặng Minh Nhật Phản biện 2: PGS.TS Lê Thị Liên Thanh Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Mã số: 60.54.02 Luận văn ñã ñược bảo vệ Hội ñồng chấm Luận văn nghiệp thạc sĩ kỹ thuật họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 23 tháng năm 2011 TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thơng tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng Đà Nẵng – Năm 2011 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Chủng nấm men bánh mì Saccharomyces cerevisiae tác nhân quan trọng trình làm nở bột nhào sản xuất bánh mì, vi khuẩn Acetobacter xylinum tác nhân lên men ñể tạo sản phẩm thạch dừa nấm mốc Aspergillus niger nguồn quan trọng ñể sinh tổng hợp số loại enzym amylase, protease, pectinase… Chính vai trị to lớn chúng nên ñã ñặt vấn ñề phải bảo quản chủng giống Trong trình bảo quản vi sinh vật, hai mục tiêu đặt đảm bảo khả sống sót ổn định đặc tính di truyền chúng Việc bảo quản chủng giống vi sinh vật phổ biến phương pháp bảo quản lạnh 40C môi trường với hàm lượng cao hợp chất nitơ cacbon Với phương pháp số điều kiện sau số chủng hình thành bào tử chúng lại làm biến dị chủng giống Tại Viện Công nghệ sinh học Công nghệ Thực phẩm TP.HCM Hà Nội người ta giữ giống phương pháp cấy truyền, bảo quản dầu parafin, lạnh sâu đơng khơ Muốn có chủng giống phải mua với giá đắt Vì “Nghiên cứu phương pháp bảo quản nấm men (Saccharomyces cerevisiae), nấm mốc (Aspergillus niger) vi khuẩn (Acetobacter xylinum)” việc làm cần thiết MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Phâp lập, hoạt hóa chủng vi sinh vật - Kiểm tra hiệu phương pháp bảo quản lạnh sâu, đơng khơ sấy chân khơng cho chủng giống vi sinh vật - Ứng dụng cụ thể chủng vi sinh vật vừa sưu tầm ñược PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae, vi khuẩn Acetobacter xylinum, nấm mốc Aspergillus niger - Nghiên cứu phương pháp: Lạnh sâu, đơng khơ sấy chân khơng điều kiện có khơng có chất bảo vệ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp vật lý, phương pháp hóa sinh, phương pháp vi sinh Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI - Tìm điều kiện kĩ thuật thích hợp để bảo quản chủng giống nấm men, nấm mốc, vi khuẩn - Đưa phương pháp thích hợp để bảo quản chủng giống nấm men, nấm mốc, vi khuẩn Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Kéo dài thời gian bảo quản tránh thối hóa giống tạp nhiễm chủng giống phịng thí nghiệm CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN Luận văn gồm 86 trang, phần mục lục, danh mục chữ viết tắt, danh mục bảng hình vẽ, mở đầu, kết luận kiến nghị, tài liệu tham khảo, phụ lục cịn có chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu, 25 trang Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu, gồm trang Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận, gồm 43 trang 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM MEN BÁNH MÌ 1.1.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo nấm men bánh mì Men bánh mì thuộc giống Saccharomyces, loài cerevisiae lớp Ascomycetes, ngành nấm Là tế bào hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ từ - đến 10 - 14µm, sinh sản cách tạo chồi tạo 1.2.1.2 Sinh sản nấm mốc Nấm mốc vi sinh vật có nhiều kiểu sinh sản khác nhau: Sinh sản dinh dưỡng, sinh sản vơ tính, sinh sản hữu tính 1.2.2 Giới thiệu Aspergillus niger 1.2.2.1 Đặc điểm hình thái Aspergillus niger Khi phát triển sợi nấm màu trắng, sau sẫm lại bào tử khơng hồn tồn đen Bào tử chúng có màu đen tuyền Từ 1.1.2 Thành phần hóa học tế bào nấm men sợi ñầu tiên chúng phân nhánh tạo - nhánh sợi nhỏ Thành phần hóa học tế bào nấm men khác tùy điều kiện mơi trường ni Nấm men ép có chứa 70 - 75% nước 25 - 30% 1.2.2.2 Đặc điểm sinh hóa Nấm sợi có khả tạo nhiều enzym khác như: lại chất khô amylase, invertase, maltase, protease, pectinase, cellullase, … 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình sinh trưởng phát 1.2.2.3 Vai trị Aspergillus niger cơng nghệ thực phẩm triển nấm men bánh mì 1.3 GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM 1.1.3.1 Nhiệt ñộ 1.3.1 Cấu tạo chung vi khuẩn 1.1.3.2 Độ pH môi trường 1.3.1.1 Thành tế bào 1.1.3.3 Ảnh hưởng chất hóa học 1.3.1.2 Màng sinh chất 1.1.3.4 Ảnh hưởng nồng ñộ rỉ ñường 1.3.1.3 Tế bào chất 1.1.3.5 Ảnh hưởng cường độ khơng khí khuấy trộn lên tốc 1.3.1.4 Nhân tế bào vi khuẩn ñộ tăng trưởng nấm men 1.3.1.5 Bao nhầy 1.1.4 Yêu cầu chất lượng nấm men bánh mì 1.3.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae dùng cho sản xuất bánh mì Giới thiệu vi khuẩn Acetobacter xylinum Chủng A xylinum có nguồn từ Philippin A.xylinum thuộc phải ñảm bảo lực nở bột < 45 phút nhóm vi khuẩn acetic Acetobater xylinum trực khuẩn không di 1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM MỐC ASPERGILLUS ñộng, tạo thành váng nhăn dày NIGER 1.3.2.1 Đặc điểm hình thái Acetobacter xylinum 1.2.1 Giới thiệu nấm mốc 1.2.1.1 Cấu tạo nấm mốc Dựa vào cấu tạo chúng người ta chia nấm mốc làm hai loại: Loại nấm mốc có vách ngăn, loại nấm mốc khơng có vách ngăn Theo hệ thống phân loại nhà khoa học Bergey A.xylinum thuộc lớp Schizommycetes, Pseudomonadales, họ Pseudomonadieae, loại vi khuẩn dài khoảng 2µm, đứng riêng lẽ xếp thành chuỗi 6 1.3.2.2 Đặc ñiểm sinh lý, sinh hóa Acetobacter xylinum Acetobacter xylinum vi khuẩn gram âm, vi khuẩn hiếu khí 1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BẢO QUẢN CÁC CHỦNG NẤM MEN BÁNH MÌ SACCHAROMYCES CEREVISIAE, A xylinum sinh trưởng pH < 5, nhiệt ñộ 28 - 32 C tích ASPERGILLUS NIGER VÀ ACETOBACTER XYLINUM lũy 4,5% axit acetic Một tế bào A.xylinum có khả polyme hóa 1.5.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 200 000 phân tử glucose/giây tạo thành β 1,4-glucan sau ñược Theo nghiên cứu năm 2010 Stefan Toegel cộng sự: tiết vào môi trường xung quanh tạo thành dạng sợi Với chủng M anisopliae sử dụng saccarose, fructose, maltose, 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI KHUẨN, glucose làm chất bảo vệ có hiệu cả, đảm bảo tỉ lệ sống sót NẤM MEN VÀ NẤM MỐC sau đơng khơ từ 25 – 45% Cịn với chủng B brongniartii có 1.4.1 Mục đích q trình bảo quản giống thể dùng glucose, saccarose, lactose, maltose, fructose, sữa gầy làm Giữ giống phải đảm bảo mục đích tối thiểu giống khơng lẫn khơng bị thối hố 1.4.2 Những phương pháp bảo quản giống vi sinh vật chất bảo vệ sau đơng khơ điều kiện có chất bảo vệ tỉ lệ sống sót mẫu nấm mốc ñạt 50 – 85% Theo nghiên cứu M Abadias cộng năm 2001, 1.4.2.1 Cấy chuyền định kì đơng khơ nấm men Candida sake phải lạnh sâu nhiệt độ -200C 1.4.2.2 Giữ giống lớp dầu khoáng Khi sử dụng chất bảo vệ, tỉ lệ sống sót cao glutamat với 1.4.2.3 Phương pháp lạnh sâu 19,6%, tiếp galactose với 16,6%, loại ñường saccarose, Phương pháp lạnh sâu dựa sở: Sự phát triển vi sinh vật bị ức chế nhiệt ñộ lạnh sâu, ñây phương pháp ñang ñược sử dụng rộng rãi ñế giữ giống vi sinh vật 1.4.2.4 Phương pháp sấy chân không lactose với 11 12%, tinh bột ñạt 11,9%, glycerol ñạt 0,3%, dùng sữa gầy + saccarose tỉ lệ sống sót tăng lên 37% Năm 2009, R Sidari A Caridi nghiên cứu khả sống sót chủng nấm men rượu sau trình bảo quản lạnh sâu - Nguyên tắc phương pháp dùng nhiệt sấy khô nguyên 200C có chất bảo vệ glycerol cho thấy rằng: Khi tính khả liệu kết hợp sử dụng bơm chân khơng để hút khí hút ẩm sống sót log (CFU/ml) chủng F15, với số lượng tế bào ban nguyên liệu ñến ñộ ẩm theo yêu cầu ñầu 9,59 Sau tháng bảo quản, số lượng tế bào 5,11 1.4.2.5 Phương pháp đơng khơ 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước Ngun tắc phương pháp làm thăng hoa phần nước có Trong đề tài “Nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ sinh học trong mơi trường nhũ hố vi sinh vật điều kiện chân khơng xử lí mơi trường ni tôm công nghiệp suất cao” năm 2004, 1.4.2.6 Một số phương pháp bảo quản khác Tác giả khảo sát q trình sấy thiết bị sấy tầng sơi rút kết luận: Nhiệt ñộ sấy 45 - 500C cho sản phẩm có hàm ẩm khoảng 8% tỷ lệ tế bào sống sót sau sấy cao (ñạt 66,67 - 69,44%) 8 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.3.2 Xác ñịnh hoạt lực làm nở nấm men bánh mì 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ DỤNG CỤ 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu - Vi khuẩn Acetobacter xylinum, nấm men bánh mì Saccharomyces cerevisiae Chuẩn bị bột nhào với 1% nấm men dạng paste Cho khối bột nhào (khoảng 30 - 50g) vào cốc có chia vạch ml Đọc xác thể Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc Aspergillus niger tích ban đầu sau 30 phút tiến hành đo thể tích khối bột nhào 2.1.2 Hóa chất thiết bị lần Tính thời gian mà khối bột nhào đạt thể tích lớn Thời - Các hóa chất: Sử dụng hóa chất chủ yếu sản xuất Trung Quốc - Máy, thiết bị: Sử dụng thiết bị phổ biến 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU gian ngắn, hoạt lực làm nở bánh cao 2.2.3.3 Xác định khả tạo khối đơng thạch dừa Acetobacter xylinum Lấy 10ml nước dừa già, bổ sung 1g ñường saccarose, 0,05g 2.2.1 Phương pháp vi sinh (NH4)2HPO4, 0,08ml axit acetic 40% băng Dùng axit acetic ñể 2.2.1.1 Phương pháp phân lập hoạt hóa giống vi sinh vật điều chỉnh pH mơi trường đến pH = Thanh trùng môi trường Nấm men bánh mì Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc cách đun sơi nhẹ thời gian 15 – 20 phút Để nguội cấy vi Aspergillus niger phân lập hoạt hóa môi trường PDA, vi khuẩn Acetobacter xylinum vào với tỉ lệ giống 10%, ñể lên men khuẩn Acetobacter xylinum hoạt hóa mơi trường HS nhiệt độ 300C giữ ngày Sau xử lí mẫu tiến hành cân 2.2.2.2 Phát chọn khuẩn lạc ñặc trưng ñể biết khối lượng 2.2.1.3 Xác ñịnh gián tiếp số lượng tế bào cách ñếm số lượng 2.2.4 Phương pháp bảo quản vi sinh vật khuẩn lạc phát triển môi trường thạch 2.2.4.1 Phương pháp lạnh sâu Số lượng tế bào xác ñịnh theo phương pháp tính Trộn dịch tế bào với chất bảo vệ với nồng độ thích hợp Sau CFU/ml ñưa vào lạnh sâu nhiệt ñộ -200C 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 2.2.4.2 Phương pháp sấy chân khơng 2.2.2.1 Xác định hoạt tính amylase Aspergillus niger Ngun tắc: Xác định lượng enzym phân giải hồn tồn lượng bột xác định dựa theo phản ứng màu với iốt 2.2.3 Phương pháp vật lý 2.2.3.1 Đánh giá sinh trưởng phát triển vi sinh vật Sử dụng phương pháp ño mật ñộ quang OD Trộn dịch tế bào với chất bảo vệ ñưa vào sấy chân không nhiệt ñộ 400C 2.2.4.3 Phương pháp đơng khơ Chuẩn bị dịch tế bào lạnh sâu -200C, sau mẫu đưa vào ñông khô 400C 10 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 HOẠT HÓA, PHÂN LẬP CÁC CHỦNG GIỐNG VI SINH VẬT NGHIÊN CỨU 11 Bào tử chúng có màu đen tuyền 3.1.3 Hoạt hóa chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum Chủng vi khuẩn A xylinum hoạt hóa mơi trường HS từ 3.1.1 Phân lập chủng nấm men bánh mì Saccharomyces chủng gốc mua Viện Công nghệ sinh học TP.HCM Kết ñược cerevisiae từ bánh men ướt trình bày hình 3.2 Chủng nấm men bánh mì S cerevisiae phân lập từ bánh men ướt Kết phân lập ñược trình bày hình 3.1 Hình 3.3 Vi khuẩn A xylinum hoạt hóa Nhận xét: Khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter xylinum có màu Hình 3.1 Nấm men S cerevisiae phân lập ñược Đặc ñiểm khuẩn lạc: Chủng nấm men có khuẩn lạc màu trắng đục, khuẩn lạc trịn, to, kích thước nhỏ khuẩn lạc nấm men bánh mì nhiều trắng sữa, trịn, to, bề mặt trơn bóng 3.2 QUAN SÁT ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CÁC CHỦNG VI 3.1.2 Hoạt hóa chủng nấm mốc Aspergillus niger SINH VẬT NGHIÊN CỨU Hình thái chủng chụp qua kính hiển vi trình Chủng nấm mốc A niger hoạt hóa mơi trường PDA từ chủng gốc có phịng thí nghiệm khoa Hóa, trường Đại học bày hình 3.4, 3.5 3.6 Bách khoa Đà Nẵng Kết trình bày hình 3.2 Hình 3.2 Nấm mốc A niger hoạt hóa Đặc điểm khuẩn lạc: Khuẩn lạc có màu ñen Khi phát triển, sợi nấm màu trắng, sau sẫm lại khơng hồn tồn đen Hình 3.4 Hình thái S cerevisiae Hình 3.5 Hình thái A niger Hình 3.6 Hình thái A.xylinum Từ kết quan sát được, chúng tơi thấy nấm men có dạng hình ovan hình trịn, chủng nấm mốc có dạng hình sợi, sợi nấm có màu nâu bóng, cịn bào tử có dạng bơng trịn có màu nâu 12 13 đen có gai, vi khuẩn có dạng hình que dài, đứng riêng rẽ Khoảng thời gian thích hợp để lấy mẫu mang bảo quản 3.3 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT sau 48 – 90 nuôi cấy mơi trường thạch đĩa Petri TRIỂN CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT NGHIÊN CỨU môi trường dịch thể PDA 3.3.1 Khả sinh trưởng phát triển chủng nấm men 3.3.3 Khả sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn Saccharomyces cerevisiae Acetobacter xylinum Đo máy so màu UV – Vis bước sóng 600nm, chúng tơi xây dựng đồ thị biểu diễn sinh trưởng phát triển Kết giá trị OD trung bình qua lần đo chủng vi khuẩn A xylinum chúng tơi biểu diễn ñồ thị hình 3.9 4.0 Saccharomyces cerevisiae ñồ thị hình 3.7 Nhận xét: Lượng sinh 3.5 Từ kết hình 3.7 ta thấy 1.5 tốc độ sinh trưởng phát 1.0 triển nấm men ñạt cực khối ñạt ñược cao 3.0 OD (600nm) 2.5 sau 120 nuôi cấy 2.0 số ODmax = 2,89 Như 1.5 1.0 0.5 ñại sau 39 giờ, giá trị ODmax 0.0 10 20 30 40 Thời gian (giờ) 50 60 = 1,612 Vì thời điểm bảo quản 39 50 60 10 150 Thời gian (giờ) Khối lượng sinh khối khô A niger hai cách đồng thời: Đo kích thước khuẩn lạc xác ñịnh sinh khối khô phương pháp lọc cân Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn thay đổi xác ñịnh trọng lượng Kết ñường kính khuẩn lạc ño ñược biểu diễn sinh khối nấm mốc A niger 140 160 bắt đầu ni cấy 72 Thời gian (giờ) Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sinh trưởng phát triển A xylinum CHỦNG VI SINH VẬT NGHIÊN CỨU Saccharomyces cerevisiae 20 120 120 3.4.1 Khảo sát khả làm nở nấm men bánh mì 20 100 sinh trưởng phát triển 30 10 80 40 30 Đường kính khuẩn lạc 40 50 40 90 20 Chúng kiểm tra Khối lượng sinh khối khơ (mg) Đường kính khuẩn lạc (mm) 60 60 3.4 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HĨA CỦA CÁC 3.3.2 Khảo sát sinh trưởng phát triển Aspergillus niger 30 mang ñi bảo quản sau 0.0 thích hợp để lấy mẫu đem Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sinh trưởng phát triển S.cerevisiae chúng tơi lấy mẫu 0.5 đồ thị hình 3.8 Chuẩn bị mẫu mục 2.2.3.2, kết trình bày hình 3.10 100 Thể tích khối bột (ml) OD - 600nm 2.0 80 60 40 20 0 30 60 90 Thời gian (phút) 120 150 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn hoạt lực làm nở khối bột nhào nấm men bánh mì S cerevisiae 14 15 Dựa vào kết hình 3.10, thấy khoảng thời gian 3.5 NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN GIỐNG 30 phút ñầu tiên, tốc ñộ nở khối bột lớn 3.5.1 Nghiên cứu bảo quản giống phương pháp lạnh sâu 3.4.2 Khảo sát khả sinh enzym amylase Aspergillus 3.5.1.1 Bảo quản lạnh sâu nấm men bánh mì Saccharomyces niger cerevisiae Chúng tơi xác ñịnh hoạt lực enzym amylase Aspergillus Trộn dịch tế bào vào dung dịch bảo vệ, ñưa mẫu vào bảo quản niger phương pháp Wolthgemuth, kết ño ñược ñược biểu nhiệt ñộ -200C kiểm tra ñịnh kì sau thời gian bảo quản 10 ngày, diễn hình 3.11 1,5 tháng 3,5 tháng Kết biểu diễn hình 3.12 hình Từ ñồ thị biểu diễn hoạt 300 3.13 lực enzym amylase A 250 200 1.00E+10 S ố lư ợ n g tế b o , C F U /m l Hoạt độ enzym, ĐV/g 350 niger chúng tơi thấy rằng, 150 hoạt lực enzym tăng 100 50 dần ngày ñầu, 0 1.00E+08 1.00E+06 1.00E+04 1.00E+02 1.00E+00 ñến ngày thứ Lactose Thời gian (ngày) hoạt lực enzym amylase Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn hoạt chúng lại giảm xuống lực enzym amylase A niger 3.4.3 Xác định khả tạo khối đơng thạch dừa vi khuẩn Acetobacter xylinum 3.1 Hình 3.12 Hình ảnh nấm men sau bảo quản lạnh sâu Glucose Glycerol Saccarose Sữa gầy Khơng có chất bảo vệ Số lượng tế bào ban ñầu Số lượng tế bào sau lạnh sâu 10 ngày Số lượng tế bào sau thời gian bảo quản 1,5 tháng Số lượng tế bào sau thời gian bảo quản 3,5 tháng Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn khả sống sót nấm men lạnh sâu Nhận xét: Sau thời gian bảo quản lạnh sâu, khuẩn lạc mọc Chuẩn bị mẫu mục 2.2.3.3 Kết biểu diễn bảng đĩa thạch có đặc ñiểm hình thái giống hệt hình thái chủng nấm Bảng 3.1 Khả tạo thạch dừa vi khuẩn A xylinum men trước bảo quản Sau 3,5 tháng bảo quản nấm men Thời gian, Khối lượng khối đơng sống sót mức tương đối cao, hầu hết 104 – 105 CFU/ml Điều ngày thu ñược, g chứng tỏ áp dụng phương pháp lạnh sâu ñể bảo quản nấm 1,7 2,2 2,3 2,4 Nhận xét: Sau ngày lên men khối đơng tạo thành lớn, từ ngày thứ trở ñi khối lượng tiếp tục tăng chậm trước men Kết cho thấy sữa gầy 10% với glycerol 15% phương pháp bảo quản tốt thời gian dài Sau 3,5 tháng bảo quản với chất bảo vệ sữa gầy tỉ lệ sống sót nấm men 2.105 CFU/ml đạt 0,1% glycerol 2,5.105 CFU/ml ñạt 0,125% Sữa gầy ảnh hưởng đến hàm lượng axit béo màng tế bào, làm thay đổi tính lưu màng canxi góp phần ổn định 17 16 enzym tế bào trì khả sống sót cho nấm men tốt Số lượng tế bào, CFU/ml 1.00E+10 Còn glycerol thấm vào bên tế bào bảo vệ ñược tốt 3.5.1.2 Bảo quản lạnh sâu nấm mốc 1.00E+08 1.00E+06 1.00E+04 1.00E+02 1.00E+00 Chuẩn bị mẫu nấm men Sau 3,5 tháng lạnh sâu, quan sát Lactose hình thành khuẩn lạc mặt thạch hình 3.14 Kiểm tra khả Số lượng tế bào, CFU/ml 1.00E+10 1.00E+08 1.00E+04 Hình 3.16 Hình ảnh vi khuẩn sau 3,5 tháng bảo quản lạnh sâu 1.00E+02 1.00E+00 Lactose Glucose Glycerol Glycerol Saccarose Sữa gầy Khơng có chất bảo vệ Số lượng tế bào sau lạnh sâu 10 ngày Số lượng tế bào sau thời gian bảo quản 3,5 tháng Hình 3.16 Hình ảnh vi khuẩn Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn khả sống sót nấm mốc ñược biểu diễn hình 3.15 1.00E+06 Glucose Số lượng tế bào ban ñầu Số lượng tế bào sau thời gian bảo quản 1,5 tháng Saccarose Sữa gầy Số lượng tế bào ban đầu Khơng có chất bảo vệ Số lượng tế bào sau lạnh sâu 10 ngày Số lượng tế bào sau thời gian bảo quản 1,5 tháng Số lượng tế bào sau thời gian bảo quản 3,5 tháng Hình 3.14 Hình ảnh nấm Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn khả mốc sau bảo quản lạnh sâu sống sót nấm mốc lạnh sâu sau bảo quản lạnh sâu sống sót vi khuẩn sấy chân khơng Phương pháp lạnh sâu thích hợp với vi khuẩn so với nấm men, nấm mốc Tỉ lệ sống sót vi khuẩn cao bảo quản với glycerol ñạt 0,5% tương ứng với số lượng tế bào 4.106 CFU/ml so với số lượng tế bào ban đầu 8.108 CFU/ml Chúng tơi kiểm tra lại đặc tính sinh học chủng sau 3,5 tháng lạnh sâu Kết trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Đặc tính sinh học chủng vi sinh vật sau thời gian bảo quản phương pháp lạnh sâu Nhận xét: Hình thái khuẩn lạc nấm mốc giống hệt hình thái chủng nấm mốc trước bảo quản đường kính khuẩn lạc lại nhỏ so với ban ñầu Khi lạnh sâu nấm mốc nên sử dụng dung dịch chất bảo vệ Thời Hoạt lực làm nở Hoạt lực Khả tạo gian khối bột nhào amylase khối ñông khảo sát S.cerevisiae A.niger A.xylinum Hoạt % so Khối % so % so ñộ với lượng với Thể tích, với ban enzym, ban thạch, ban ml đầu ĐV/g ñầu g ñầu 88 100 133 100 2,4 100 80 90,9 113 85 2,1 87,5 lactose, sữa gầy glycerol Khi lạnh sâu với chất bảo vệ glycerol, loại đường khuẩn lạc nấm mốc sau hoạt hóa lại có đường kính to so với mẫu có chất bảo vệ khác Tỉ lệ sống sót nấm mốc sau 3,5 tháng bảo quản với chất bảo vệ glycerol 0,01% 3.5.1.3 Bảo quản lạnh sâu vi khuẩn Chuẩn bị mẫu kiểm tra tương tự nấm men, kết kiểm tra ñược biểu diễn hình 3.16 hình 3.17 Trước lạnh sâu Sau 3,5 tháng Hoạt lực chủng bị giảm giảm khơng đáng kể, 19 Số lư ợng tế bà o , C FU /m l 18 tất mẫu ñều ñạt 85% so với ban ñầu 3.5.2 Nghiên cứu bảo quản giống phương pháp sấy chân không 3.5.2.1 Bảo quản nấm men 1.00E+10 1.00E+08 1.00E+06 1.00E+04 1.00E+02 1.00E+00 Saccarose Trộn dịch tế bào với chất bảo vệ ñưa vào sấy 40 C Sau sấy, mẫu ñược bảo quản 40C trước hoạt hoá trở lại Kết kiểm tra biểu diễn hình 3.18 hình 3.19 Số lượ ng tế bào, C F U /m l Số lượng tế bào ban ñầu Số lượng tế bào sau thời gian bảo quản tháng Hình 3.20 Hình ảnh Sữa gầy Tinh bột Khơng chất bảo vệ Số lượng tế bào sau sấy chân không ngày Số lượng tế bào sau thời gian bảo quản tháng Hình 3.21 Đồ thị biểu diễn khả nấm mốc sau bảo quản sống sót nấm mốc sấy chân không sấy chân không Các khuẩn lạc nấm mốc mọc đĩa thạch có hình thái 1.00E+10 1.00E+08 1.00E+06 1.00E+04 giống hệt hình thái ban đầu Sau hoạt hóa lại đường kính 1.00E+02 khuẩn lạc khơng lớn ban đầu Điều chứng tỏ nấm mốc hút 1.00E+00 Saccarose Hình 3.18 Hình ảnh nấm men sau bảo quản sấy chân không Saccarose + Saccarose + Saccarose + gelatin pepton cao nấm men Saccarose + Saccarose + Saccarose + gelatin pepton cao nấm men Số lượng tế bào ban ñầu Số lượng tế bào sau thời gian bảo quản tháng Sữa gầy Tinh bột Không chất bảo vệ Số lượng tế bào sau sấy chân không ngày Số lượng tế bào sau thời gian bảo quản tháng nước lại q trình sinh trưởng nấm mốc bị trễ Sau thời gian tháng bảo quản chúng tơi nhận thấy mẫu tinh Hình 3.19 Đồ thị biểu diễn khả bột giữ khả sống sót cao 2.106 CFU/ml đạt 0,2% sống sót nấm men sấy chân khơng Bởi mẫu tinh bột sau sấy xong độ ẩm cao so với Sau sấy chân không, nấm men có tỉ lệ sống sót cao bị mẫu khác khơng làm chết nhiều tế bào đảo bảm giảm nhiều q trình bảo quản Khi sấy sử dụng chất bảo vệ hiệu việc bảo quản Cịn mẫu khơng chất bảo vệ tỉ lệ sống sót tinh bột sữa gầy hỗn hợp saccarose + cao nấm men 105 CFU/ml đạt 0,01% saccarose + gelatin số lượng tế bào trì cao thời 3.5.2.3 Bảo quản vi khuẩn Acetobacter xylinum gian bảo quản tháng, tỉ lệ sống sót sau tháng bảo quản đạt 0,15 – Chuẩn bị mẫu tiến hành bước bảo quản giống phần sấy 0,23% chân không nấm men Hình ảnh vi khuẩn sau hoạt hóa lại 3.5.2.2 Bảo quản nấm mốc Aspergillus niger biếu diễn hình 3.22 Chúng tơi tiến hành hoạt hóa xác ñịnh lại số Chuẩn bị mẫu tiến hành bước bảo quản giống phần sấy chân không nấm men Chúng tơi tiến hành hoạt hóa xác định lại số lượng tế bào vi khuẩn sau sấy chân khơng theo thời gian bảo quản thu ñược kết hình 3.20 ñồ thị hình 3.21 lượng tế bào vi khuẩn sau sấy chân khơng theo thời gian bảo quản thu ñược kết hình 3.22 Từ kết hình 3.22, chúng tơi nhận thấy tỏ khả sống sót vi khuẩn sau q trình sấy chân khơng cao so hẳn so với q trình sấy chân khơng nấm men, nấm mốc Mẫu sấy có chất bảo vệ tinh bột ñảm bảo sống cao với tỉ lệ sống sót tính 21 20 Số lượng tế bào,CFU/ml 1.00E+10 1.00E+08 Trong nấm mốc bị giảm hoạt lực nhiều nhất, cịn 53,1% so 1.00E+06 với ban ñầu 1.00E+04 3.5.3 Nghiên cứu bảo quản giống phương pháp đơng khơ 1.00E+02 3.5.3.1 Bảo quản nấm men 1.00E+00 Saccarose Hình 3.22 Hình ảnh Số lượng tế bào sau thời gian bảo quản tháng vi khuẩn sau bảo quản Số lượng tế bào sau thời gian bảo quản tháng Hình 3.23 Đồ thị biểu diễn khả sấy chân khơng sống sót vi khuẩn sấy chân không Dịch huyền phù tế bào ñược trộn với dịch bảo vệ sau ñó ñược làm lạnh sâu -200C Sau ñó mẫu ñược sấy ñông khô 400C Sau sấy, mẫu ñược bảo quản 40C trước hoạt hoá 1.00E+10 S ố lư ợ n g tế b o , C F U /m l Saccarose + Saccarose + Sữa gầy Tinh bột Không chất pepton cao nấm men bảo vệ Số lượng tế bào ban ñầu Số lượng tế bào sau sấy chân không ngày 15%, sau thời gian bảo quản tháng tỉ lệ sống sót 10% sau tháng bảo quản tỉ lệ sống sót 1,25% Tiến hành kiểm tra hoạt lực chủng vi sinh vật nghiên cứu thu kết trình bày bảng 3.3 1.00E+08 1.00E+06 1.00E+04 1.00E+02 1.00E+00 Saccarose Bảng 3.3 Đặc tính sinh học chủng vi sinh vật sau thời gian Hình 3.24 Hình ảnh bảo quản phương pháp sấy chân không nấm men sau bảo quản Thời Hoạt lực làm nở Hoạt lực Khả tạo gian khối bột nhào amylase thạch dừa khảo sát S.cerevisiae A.niger A.xylinum Trước sấy Sau tháng Hoạt % so Khối % so % so độ với lượng với Thể tích, với ban enzym ban thạch ban ml ñầu , ĐV/g ñầu dừa , g ñầu 88 100 133 100 2,4 100 Lactose Saccarose + Saccarose + Saccarose + gelatin cao nấm men pepton Số lượng tế bào ban ñầu Số lượng tế bào sau bảo quản tháng Tinh bột Sữa gầy Không chất bảo vệ Số lượng tế bào sau ñông khô Số lượng tế bào sau bảo quản 2,5 tháng Hình 3.25 Đồ thị biểu diễn khả sống sót nấm men sau đơng khơ đơng khơ Trong tất chất bảo vệ sau q trình đơng khơ, sữa gầy cho kết tốt protein sữa gầy hình thành lớp bảo vệ thành tế bào canxi sữa làm tăng sống sót sau làm lạnh đơng khơ, ổn định pH tạo sản phẩm đơng khơ có cấu trúc xốp làm cho việc bù nước dễ dàng Khi đơng khơ nấm men với mẫu chất bảo vệ sữa gầy với tỉ lệ sống sót tính 2,96%, sau tháng bảo quản tỉ lệ sống sót cịn lại mẫu 0,89% 3.5.3.2 Bảo quản nấm mốc Aspergillus niger 75 85,2 70,7 53,1 1,8 75 Hoạt tính sinh học chủng vi sinh vật nghiên cứu bị giảm ñi nhiều sau tháng bảo quản phương pháp sấy chân khơng Chuẩn bị mẫu đơng khơ nấm men Kết quan sát khuẩn lạc kiểm tra khả sống sót nấm mốc sau đơng khơ biểu diễn hình 3.26 hình 3.27 22 23 hai chủng nấm men nấm mốc nhiều lại giảm ñi nhanh S ố lư ợ n g tế b o , C F U /m l 1.00E+10 so với nấm men, nấm mốc sau tháng bảo quản Và sau 2,5 1.00E+08 tháng bảo quản tỉ lệ sống sót vi khuẩn giảm khơng đáng kể so 1.00E+06 với sau tháng 1.00E+04 Kiểm tra hoạt tính chủng vi sinh vật bảo quản 1.00E+02 1.00E+00 Saccarose Hình 3.26 Hình ảnh Lactose Saccarose + Saccarose + Saccarose + gelatin cao nấm men pepton Số lượng tế bào ban ñầu Số lượng tế bào sau tháng đơng khơ nấm mốc sau bảo quản đơng khơ Tinh bột Sữa gầy Không chất bảo vệ Số lượng tế bào sau ñông khô Số lượng tế bào sau 2,5 tháng ñông khơ đơng khơ, chúng tơi thu kết trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Đặc tính sinh học chủng vi sinh vật sau thời gian bảo quản phương pháp đơng khơ Hình 3.27 Đồ thị biểu diễn khả sống sót nấm mốc sau đơng khơ Nhận xét: Tỉ lệ sống sót nấm mốc sau đơng khơ cao Thời gian khảo sát Hoạt lực làm nở Hoạt lực Khả tạo khối bột nhào amylase thạch dừa S.cerevisiae A.niger A.xylinum so với nấm men, khả sống sót nấm men cao 2,96% Hoạt % so Khối % so % so ñộ với lượng với Thể tích, với ban enzym ban thạch ban ml ñầu , ĐV/g ñầu dừa, g ñầu 88 100 133 100 2,4 100 84 95.4 121 91,1 2,2 91,6 nấm mốc 9% chất bảo vệ thích hợp sữa gầy 3.5.3.3 Bảo quản vi khuẩn Acetobacter xylinum Hình ảnh vi khuẩn sau thời gian bảo quản đơng khơ biểu diễn hình 3.28 khả sống sót vi khuẩn ñược biểu diễn ñồ thị 3.29 S ố lư ợ n g tế b o , C F U /m l tháng 1.00E+08 2,5 Chúng nhận thấy phương pháp đơng khơ làm giảm hoạt 1.00E+06 1.00E+04 lực vi sinh vật, hoạt lực ba chủng nghiên cứu ñều ñạt 1.00E+02 90% so với ban ñầu 1.00E+00 Saccarose vi khuẩn sau bảo quản đơng khơ Sau 1.00E+10 Hình 3.28 Hình ảnh Trước Lactose Saccarose + Saccarose + Saccarose + gelatin cao nấm men pepton Số lượng tế bào ban ñầu Số lượng tế bào sau tháng đơng khơ Tinh bột Sữa gầy Không chất bảo vệ Số lượng tế bào sau đơng khơ Số lượng tế bào sau 2,5 tháng đơng khơ Hình 3.29 Đồ thị biểu diễn khả đơng khơ sống sót vi khuẩn sau đơng khơ Nhận xét: Tỉ lệ sống sót vi khuẩn sau đơng khơ cao 3.6 ỨNG DỤNG Chúng tiến hành lên men tạo sản phẩm thạch dừa từ vi khuẩn A.xylinum thu sau q trình bảo quản đơng khơ theo quy trình hình 3.30 thu ñược sản phẩm hình 3.31 25 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Nước dừa * KẾT LUẬN Từ kết thu q trình nghiên cứu chúng tơi Lọc Nước đường DAP Trộn đưa số kết luận sau: Phương pháp lạnh sâu: Phương pháp tốt sử dụng chất bảo vệ glycerol 15% Khả sống sót vi khuẩn cao so với Đun sôi 15 nấm men, nấm mốc đạt tỉ lệ sống sót 0,5% sau 3,5 tháng bảo quản Đặc tính sinh học chủng nghiên cứu bị giảm, ñạt 85% so Để nguội Cho axit axetic Cấy với hoạt lực ban ñầu Phương pháp sấy chân không: Chất bảo vệ tốt tinh bột Nhìn chung phương cho khả sống sót cao so với phương pháp lạnh sâu Nhưng sau tháng bảo quản, hoạt lực chủng vi sinh vật bị giảm ñi nhiều Lên men Phương pháp đơng khơ: Chất bảo vệ tốt sữa gầy 10% Tỉ lệ sống sót chủng nghiên cứu cao ba phương pháp Thạch dừa Hoạt lực chủng vi sinh vật ñều ñạt 90% so với ban ñầu Vì ñể bảo quản chủng vi sinh vật nghiên cứu, phương pháp tốt đơng khơ ñảm bảo tỉ lệ sống sót chủng vi Hình 3.30 Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất thạch dừa sinh vật cao giữ ñược gần nguyên vẹn đặc tính sinh học ban đầu, tiếp đến phương pháp lạnh sâu cuối sấy chân không Lên men tạo sản phẩm thạch dừa từ chủng vi khuẩn A.xylinum * KIẾN NGHỊ Tiếp tục khảo sát khả sống sót đặc tính sinh hóa chủd ng vi sinh vật nghiên cứu thời gian bảo quản dài để Hình 3.31 Hình ảnh sản phẩm thạch dừa tìm thời gian bảo quản tối đa Khảo sát ba phương pháp bảo quản lạnh sâu, sấy chân không ñông khô với nhiều chủng vi sinh vật khác Tạo chế phẩm vi sinh vật tiện lợi lưu hành ñược thị trường  ... hợp để bảo quản chủng giống nấm men, nấm mốc, vi khuẩn - Đưa phương pháp thích hợp để bảo quản chủng giống nấm men, nấm mốc, vi khuẩn Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Kéo dài thời gian bảo quản tránh... giống phương pháp cấy truyền, bảo quản dầu parafin, lạnh sâu đơng khơ Muốn có chủng giống phải mua với giá đắt Vì ? ?Nghiên cứu phương pháp bảo quản nấm men (Saccharomyces cerevisiae), nấm mốc (Aspergillus. .. Aspergillus niger - Nghiên cứu phương pháp: Lạnh sâu, đơng khơ sấy chân khơng điều kiện có khơng có chất bảo vệ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp vật lý, phương pháp hóa sinh, phương pháp vi sinh Ý NGHĨA