ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM Số phách TIỂU LUẬN KẾT THÚC HỌC PHẦN TÊN ĐỀ TÀI: PCR LÀ GÌ ? TRÌNH BÀY ỨNG DỤNG CỦA PCR TRONG CHUẨN CHUẨN ĐOÁN BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THỦY SẢN Ngành học: Nôi trồng thủy sản Tên học phần: Bệnh học thủy sản Giảng viên giảng dạy: Trần Nam Hà HỌ VÀ TÊN SV: TRƯƠNG THỊ BỒNG MÃ SINH VIÊN: 18L3081009 NHÓM HỌC PHẦN: NHÓM THỪA THIÊN HUẾ, NĂM 2021 Số phách I ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành Nuôi trồng thủy sản Việt Nam ngày phát triển, trở thành ngành kinh tế mũi nhọn quốc gia, không mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước mà cịn góp phần đáng kể vào thành công công tác xóa đói giảm nghèo, bảo đảm an ninh lương thực, làm thay đổi đời sống dân cư vùng miền núi ven biển Tuy nhiên, năm gần đây, dịch bệnh ô nhiễm môi trường trở thành thách thức lớn ngành Nuôi trồng thủy sản Thiệt hại dịch bệnh gây lớn.Những tác nhân gây bệnh động vật thủy sản bệnh vi khuẩn,virus,nấm,ký sinh gây chiếm tỷ lệ lớn Điều cản trở việc phát triển công nghiệp sản xuất giống thủy sản nuôi thương phẩm Một nuôi trồng thủy sản phát triển mức cơng nghiệp, kỹ thuật quản lý chuẩn đoán dịch bệnh trở thành bí quan trọng để đảm bảo thành cơng vụ nuôi Cho đến nay, phương thức phòng bệnh ứng dụng chưa mang lại hiệu cao Việc chuẩn đoán bệnh cho hình thức quan trọng nuôi trồng thủy sản Nhằm phát bệnh sớm để phịng điều trị.Có nhiều phương pháp chuẩn đốn bệnh khác nhau,tuy nhiên PCR ln phương pháp tối ưu hiệu nhất.Việc ứng dụng PCR chuẩn đoán bệnh động vật thủy sản ngày phát triển ưa chuộng.Nó góp phần hạn chế dịch bệnh nuôi trồng thủy sản phát triển kinh tế,thúc đẩy ngành thủy sản phát triển bền vững Vì vậy, đề tài tiểu luận sau giúp tìm hiểu,mơ tả thêm kỹ thuật PCR ứng dụng chuẩn đốn bện động vật thủy sản II NỘI DUNG 2.1 Thế PCR ? 2.1.1 Các khái niệm PCR PCR sử dụng phổ biến công cụ thiếu nghiên cứu ADN thuộc lĩnh vực sinh học, y học, tội phạm học, xác định huyết thống, phục vụ nhiều mục đích khác nhau, phát bệnh di truyền, nhận dạng tội phạm, nghiên cứu bệnh nhiễm trùng PCR phương pháp khuếch đại nhanh nhạy có chọn lọc mơt trình tự DNA/RNA định từ mạch khuôn axit nucleic PCR viết tắt tiếng anh từ Polymerase chain reaction có nghĩa phản ứng tổng hợp DNA nhân tạo dựa vào tính đặc hiệu cặp mồi chuyên biệt cho đoạn DNA đích chu kỳ nhiệt PCR kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử Kary Mullis phát minh vào năm 1983, đến hoàn thiện qua nhiều cải tiến tự động hố hồn tồn nhằm khuyếch đại (tạo nhiều sao) đoạn DNA mà không cần sử dụng sinh vật sống Định nghĩa kỹ thuật PCR từ lâu người ni tơm biết đến, hiểu đơn giản kĩ thuật PCR (polymerase chain reaction) phương pháp tổng hợp DNA dựa mạch khn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA Primer đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với mạch đoạn DNA khuôn nhờ hoạt động DNA polymerase đoạn primer kéo dài để hình thành mạch Kỹ thuật PCR hình thành dựa đặc tính DNA polymerase, đoạn DNA nằm hai primer khuếch đại thành số lượng lớn đến mức thấy sau nhuộm ethidium bromide thu nhận đoạn DNA cho mục đích khác thao tác gel Như vậy, để khuếch đại trình tự DNA xác định, cần phải có thơng tin tối thiểu trình tự DNA, đặc biệt trình tự base hai đầu đoạn DNA đủ để tạo primer bổ sung chuyên biệt 2.1.2 Nguyên tắc PCR Tất ADN polymerase hoạt động tổng hợp mạch ADN từ mạch khuôn cần diện mồi chuyên biệt (một mồi xuôi mồi ngược so với chiều phiên mã gen) Mồi đoạn ADN ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn, ADN polymerase nối dài mồi để hình thành mạch Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu trình tự ADN đoạn ADN nằm hai mồi tồng hợp Hai mồi gồm mồi xuôi mồi ngược theo chiều phiên mã gen 2.1.3 Thành phần PCR • Mạch khn (template) • Mồi (Primers) • dNTPs: dATP, dCTP, dGTP and dTTP • Thermostable DNA polymerase (enzym chịu nhiệt xúc tác trình tổng hợp DNA) • PCR buffer (dung dịch PCR): có chứa Mg 2+ cần cho hoạt động men DNA polymerase 2.2 Ứng dụng PCR chuẩn đoán bệnh động vật thủy sản 2.2.1 Quy trình chuẩn đốn bệnh chung Gồm 20 đến 30 chu kỳ, lặp lại nối tiếp - Mỗi chu kỳ gồm bước + Bước 1: Biến tính (denaturation) Giai đoạn thực nhiệt độ cao nhiệt độ nóng chảy phân tử (94 – 95oC) vòng 30 – 60 giây, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn Hai mạch đơn đóng vai trị mạch khn cho tổng hợp hai mạch bổ sung Bước gọi biến tính, phá vỡ cầu nối hydrogen nối sợi DNA Trước chu kỳ 1, DNA thường biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA mồi phân tách hồn tồn cịn dạng sợi đơn Thời gian: 1-2 phút + Bước 2: Bắt cặp mồi (hybridization) Sau sợi DNA tách ra, nhiệt độ hạ thấp xuống để mồi gắn vào sợi DNA đơn Bước gọi gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn phụ thuộc vào đoạn mồi thường thấp nhiệt độ biến tính 50 °C (45-60 °C) Sử dụng sai nhiệt độ giai đoạn dẫn đến việc đoạn mồi khơng gắn hồn toàn vào DNA mẫu, hay gắn cách tùy tiện Thời gian: 1-2 phút Đây giai đoạn định nên tính đặc hiệu sản phẩm PCR + Bước 3: Kéo dài (extension) Nhiệt độ tăng lên đến 72oC, để DNA polymerase hoạt động kéo dài mạch Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào hoạt động dọc theo sợi DNA Bước gọi kéo dài Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời gian bước phụ thuộc vào DNA-polymerase chiều dài DNA cần khuếch đại Như quy tắc …, 1000bp/ phút - Như vậy, qua chu kỳ nhiệt, DNA đích nhân lên thành chu kỳ lặp lặp lại liên tục từ 30 đến 40 chu kỳ từ DNA đích nhân thành 230 đến 240 sao, tức hàng tỷ 2.2.2 Các dạng PCR thường ứng dụng • PCR bước (one steo PCR): thao tác • PCR bước (PCR tổ-Nested PCR): sử dụng hai cặp mồi • PCR phức (Multiplex PCR): khuếch đại đồng thời hai hay nhiều đoạn DNA mục tiêu mẫu • PCR phiên mã ngược (RT-PCR): định tính biểu hiệngen phát virút RNA • PCR thời gian thật (RealTime PCR) 2.2.3 Ứng dụng PCR chuẩn đoán bệnh động vật thủy sản 2.2.3.1 Ứng dụng PCR chẩn đốn bệnh tơm: Thời gian gần đây, tình hình dịch bệnh tơm diễn biến ngày phức tạp gây thiệt hại mặt kinh tế cho người nuôi Ứng dụng kĩ thuật PCR chẩn đốn bệnh tơm phương pháp hữu hiệu cho kết độ xác cao Tơm lồi thủy sản ni nhiều diện tích rộng mang lại giá trị kim ngạch xuất tương đối lớn cho ngành Thủy sản Việt Nam Tuy nhiên, loài dễ cảm nhiễm với bệnh nhiều loại virus,vi trùng ,vi khuẩn gây với cường độ cao Tình hình dịch bệnh diễn biến ngày phức tạp Cho đến nay, phương pháp phòng điều trị bệnh thông thường ứng dụng chưa mang lại hiệu cao Vì vậy, việc áp dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán bệnh tôm phương thức quản lý bệnh hiệu Quy trình chung chuẩn đốn PCR tác nhân virus gây bệnh tôm Mẫu tôm Chuẩn bị mẫu Tách triết DNA Tách triết ARN PCR •Ứng dụng PCR chuẩn tơm (Trần Thị Tuyết RT-PCR Đọc kết đốn bệnh đốm trắng Hoa) Phương pháp PCR ứng dụng nested-PCR.Qui trình thiết kế bao gồm hai bước với thành phần phản ứngĐiện dicác bước sau: (i) thành phần phản ứng bước (20μl): 1X PCR buffer; 1,5mM MgCl2; 200μM dNTPs mix, 10pmol mồi deca-20s9, 10pmol mồi deca-20a2, 20pmol mồi P1; 20pmol mồi P2; 1,5U Taq ADN Polymerase mẫu ADN chiết tách (1μl); (ii) thành phần phản ứng bước (20μl): 1X PCR buffer; 1,0mM MgCl2; 200μM3 dNTPs mix, 10pmol mồi deca-20s9, 10pmol mồi deca-20a2, 20pmol mồi P3; 20pmol mồi P4; 1,5U Taq ADN Polymerase sản phẩm PCR bước (1μl) Điều kiện phản ứng PCR hai bước thực điều kiện sau: nhiệt độ 94oC phút, 94oC 30 giây, 56oC 30 giây, 72oC phút, chu kỳ lặp lại 30 lần, cuối 72oC phút Bảng 1: Trình tự mồi sử dụng phản ứng PCR bước bước Tên mồi Trình tự mồi sử dụng P1 5’ -ATC-ATG-GCT-GCT-TCA-CAG-AC-3’ P2 5’ -CGC-TGG-AGA-GGA-CAA-GAC-AT-3’ P3 5’ -TCT-TCA-TCA-GAT-GCT-ACT-GC-3’ P4 5’ -TAA-CGC-TAT-CCA-GTA-TCA-CG-3’ Deca-20a2 5’ -ACT-TCC-CCC-GGA-ACC-CAA-AGA-CT- 3’ Deca-20s9 5’ -GGG-GGC-ATT-CGT-ATT-GCG-A- 3’ Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% có chứa 0,5 µg/ml ethidium bromide, dung dịch 0,5X TAE (Tris-acetate-EDTA) 90V ghi nhận với thiết bị chụp, xử lí ảnh gel (Vilber Lourmat) Căn vào thang ADN 100 bp plus (Fermentas) hay thang ADN 1kb plus (Invitrogen) để xác định trọng lượng phân tử mẫu phân tích Kết ghi nhận: (i) vạch vị trí 240bp ADN chiết tách tốt (ii) vạch vị trí 982 bp mẫu nhiễm WSSV (sản phẩm PCR bước 1) hay vạch vị trí 570 bp mẫu nhiễm WSSV (sản phẩm PCR bước 2) Kết : Kết cho thấy, sản phẩm PCR bước cho kết tốt tất khoảng nhiệt độ thử nghiệm, ngược lại sản phẩm PCR bước cho kết tốt khoảng 57,1o C;55,8oC (Hình 1) Dựa vào kết ghi nhận, nhiệt độ gắn mồi chọn 56oC Kết từ hình cho thấy, tất mẫu pha loãng cho vạch khuếch đại rõ Độ sáng vạch ADN giảm dần theo độ pha lỗng hàm lượng ADN khn Qua kết cịn cho thấy, với nồng độ ADN khn nồng độ ADN pha loãng mức độ khác mẫu nhiễm vừa (++) cho kết tốt Vạch giếng thứ 6, mẫu có nồng độ pha loãng tương ứng với hàm lượng ADN 10 pg/μl cho kết PCR tốt, điều chứng tỏ khả phát mẫu qui trình cao, phát mẫu có hàm lượng ADN thấp (10 pg/μl) chí thấp nữ Qui trình nested-PCR phát triển phù hợp với điều kiện thực tế với thay đổi thành phần hóa chất tham gia phản ứng chu kỳ nhiệt phản ứng Kết ghi nhận khả sử dụng tốt qui trình PCR việc phát WSSV từ nhiều đối tượng cảm nhiễm khác (tôm giống, tôm thịt, cua, giun nhiều tơ, ốc mượn hồn mực), với độ nhaỵ khoảng 10pg/phản ứng thời gian khuếch đại ngắn Ngồi cịn số bệnh phổ biến Tôm ứng dụng PCR để chuẩn đốn • Bệnh hoại tử tơm (IMNV) sử dụng phương pháp Realtime RTPCR • Bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm (AHPND/EMS) sử dụng phương pháp PCR • Bệnh vi bào tử trùng tơm (EHP) • Hội chứng Taura tôm (TSV) sử dụng phương pháp Realtime RT-PCR • Bệnh đầu vàng tơm (YHV) sử dụng phương pháp Realtime RT-PCR • Bệnh hoại tử vỏ quan tạo máu (IHHNV) sử dụng phương pháp Realtime PCR • Bệnh Phát sáng tơm (Vibrio harveyi) • Bệnh vi khuẩn gây hoại tử gan tụy (NHPB) 2.2.3.2 Ứng dụng PCR chuẩn đoán bệnh cá Ngày ,bệnh cá số vấn đề quan tâm người ni thủy sản.Tình trạng bệnh virus,vi khuẩn,ký sinh trùng,nấm….gây số lồi cá ni ngày gia tăng,tuy nhiên việc phát chuẩn đoán bệnh theo truyền thống không đme lại hiệu quả.Hiện phương pháp PCR thình hành,được nhiều người dụng cho việc chuẩn đốn bệnh cho động vật thủy sản.Chính ứng dụng PCR chuẩn đoan bệnh cá giải pháp hữu hiệu.Phương pháp PCR ứng dụng để chuẩn đoán nhiều loại bệnh nhiều tác nhân gây ra.Một số kẻ đên ứng dụng PCR để chuẩn đoán bênh VNN cá • Ứng dụng PCR chuẩn đốn bệnh hoại tử thần kinh (VNN) loài cá biển phương pháp Realtime RT-PCR Quy trình chung ứng dụng quy trình PCR chuẩn đốn bệnh VNN cá biển Trong tiến trình phản ứng RT-PCR Phản ứng khuếch đại thực máy luân nhiệt theo phương pháp RT PCR bước, sử dụng cặp mồi khuếch đại đoạn gen vùng T4 mã hoá protein vỏ chủng SSJNNV R3: 5'-CGA-GTC-AAC-ACG-GGT-GAA-GA-3' F2: 5'-CGT-GTC-AGT-CAT-GTG-TCG-CT-3' Đọc kết Sau điện di xong, đọc kết bàn đọc UV, đọc kết với tia UV bước sóng 302 nm Đối chiếu vạch sáng mẫu với vạch sáng từ thang ADN, mẫu kiểm chứng dương tính mẫu kiểm chứng âm tính để đưa kết luận Giếng Vạch 427 bp Kết Thang ADN Các vạch sáng rõ ràng Điện di tốt Mẫu kiểm chứng âm tính Khơng Khơng ngoại nhiễm Mẫu kiểm chứng dương tính Mẫu thử Có Có Khơng Có Khơng Bi ngoại nhiễm Hỗn hợp phản ứng RT-PCR tốt Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng enzym hỏng Dương tính với VNN Âm tính với VNN Kết mẫu thử dương tính khi: Xuất vạch sáng có kích thước kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 427 bp, thang ADN phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm khơng có vạch sáng Kết mẫu thử âm tính khơng có vạch sáng kích thước 427 bp Khơng có vạch sáng mẫu đối chứng âm tính, có vạch sáng mẫu đối chứng dương tính Thang ADN phân vạch rõ ràng Ngồi cịn số bệnh đươc ứng dụng PCR chuẩn đoán bệnh như: Bệnh xuất huyết mùa xuânở cá chép (SVCV) sử dụng phương pháp PCR RT-PCR Bệnh Koi Herpesvirus(KHV) gây bệnh cá chép sử dụng phương pháp PCR RealtimePCR Phát vi khuẩnEdwardsiella ictaluri gâybệnh gan thận mủ cá phương pháp nuôi cấy phân lập sử dụng phương pháp PCR Realtime PCR Bệnh nhiễm trùng xuấthuyết (VHS) cá sử dụng phương pháp PCR RealtimeRT-PCR Bệnh hoại tử quan tạomáu (EHN) cá sử dụng phương pháp PCR Ngồi ứng dụng chuẩn đốn bệnh tơm cá, PCR cịn ứng dụng chuẩn đốn bệnh động vật thân mềm hai mảnh vỏ loài nhuyễn thể.Hiện có nhiều nghiên cứu ứng dụng PCR trng chuẩn đoán bệnh động vật thủy sản 2.3 Ưu nhược điểm việc ứng dụng PCR chuẩn đoán bệnh Ưu điểm Kết thu nhanh, sau làm xét nghiệm đến có kết khơng q Có khả phát nhiều bệnh mà phương pháp lâm sàng không phát Xác định đột biến gen,… Nhược điểm Chi phí mua máy xét nghiệm PCR khơng thấp Các xét nghiệm PCR khó thực chuẩn mực phịng thí nghiệm lâm sàng Người thực kỹ thuật PCR cần phải có trình độ chun mơn cao Phương pháp PCR thơng thường không hoạt động với đoạn DNA lớn kb (kết tốt với đoạn DNA 1.5 kb) Sự ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại lần thao tác trước Các sai sót gây taq polymerase (khoảng 10.000 nucleotic enzym gắn sai nucleotic) III KẾT LUẬN Thời gian gần đây, tình hình dịch bệnh động vật thủy sản diễn biến ngày phức tạp gây thiệt hại mặt kinh tế cho người nuôi Ứng dụng kĩ thuật PCR chẩn đoán bệnh động vật thủy sản cịn gặp khó khăn nhiều mặt phương pháp hữu hiệu cho kết độ xác cao.Chính cần khuyến khích phát triển mở rộng,tìm hiểu học hỏi thứ ưu việc việc ứng dụng PCR chuẩn đoán bệnh động vật thủy sản nước để hoàn thiện hơn,khắc phục khó khăn tai ta việc áp dụng IV TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Giáo trình bệnh học thủy sản, Nhà xuất đại học Huế,2018 2.Bùi Quang Tề Giáo trình bệnh học thủy sản phần 2.Xuất 2006 Đặng Thị Hoàng Oanh Đặng Thụy Mai Thuy, 2009 “Nghiên cứu ứng dụng qui trình PCR chẩn đoán vi khuẩn Edwardsiella ictaluri thận cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” Bênh học thủy sản –Quy trình chẩn đốn-Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh cá biển Danh mục phép thử chẩn đốn bệnh thủy sản-Phịng thử nghiệm ngành Nông nghiệp PTNN ,Chi cục thú y Vùng Vi ,trung tâm chuẩn đoán xét nghiệm bệnh động vật Trần Thị Tuyết Hoa Tạp chí Khoa học 2011:17a 1-8Trường Đại học Cần Thơ “Quy trình Nested-PCR phát virus gây bệnh Đốm Trắng (WSSV )và nội chuẩn giáp xác mười chân nhiều đối tượng cảm nhiễm” DTHOanh “Nguyên lý ứng dụng phương pháp PCR phát chẩn đoán bệnh động vật thủy sản”