Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học mở Hà Nội BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Tách chiết hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học một số đối tượng thuộc họ Na (Annonaceae) và họ Sim (Myrtaceae) Người hướng dẫn : PGS.TS. Lê Mai Hương Sinh viên thực hiện : Hà Văn Thịnh Lớp : 06-01 Hà Nội-2010 Sinh viên: Hà Văn Thịnh Khoa công nghệ sinh học - K13 1 Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này tôi xin gửi tới lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS Lê Mai Hương, NCS Trần Thị Như Hằng, ThS Trần Thị Hồng Hà, CN Hoàng Kim Chi, KS Nguyễn Đình Luyện cùng các anh chị trong phòng sinh học thực nghiệm - Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi trong 4 năm học vừa qua. Tôi xin chân thành cám ơn sự giúp đỡ của gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi hoàn thành bài luận văn này. Xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2010 Sinh viên Hà Văn Thịnh DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT CS% Cell survival (% sống sót) Sinh viên: Hà Văn Thịnh Khoa công nghệ sinh học - K13 2 Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học mở Hà Nội SC% Scavenging capacity DMSO Dimetyl sulfoxit DPPH 1,1-dipheny 1-2-picrylhydrazyl EDTA Ethylenediaminetetra acetic axit IC 50 Inhibitory concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%) MeOH Metanol MIC Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU …………………………………… .2 1.1. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ THỰC VẬT ……………………………………… .2 Sinh viên: Hà Văn Thịnh Khoa công nghệ sinh học - K13 3 Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học mở Hà Nội 1.2. HỌ NA (ANONACEAE) …………………………………………… 5 1.2.1. Đặc điểm thực vật họ Na (Annonaceae) ……………………… 5 1.2.2. Sơ lược tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của họ Na … .6 1.2.2.1. Những nghiên cứu trên thế giới ……………………… 6 1.2.2.2. Những nghiên cứu trong nước …………………………11 1.3. HỌ SIM (MYRTACEAE) ……………………………………………16 1.3.1. Đặc điểm thực vật của họ Sim (Myrtaceae) ………………… .16 1.3.2. Sơ lược tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của họ Sim… 17 1.3.2.1. Những nghiên cứu trên thế giới ……………………….17 1.3.2.2. Những nghiên cứu ở trong nước …………………… .19 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 23 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU …………………………………… . 23 2.1.1. Mẫu cây …………………………………………………… 23 2.1.2. Các chủng vi sinh vật kiểm định 23 2.1.3. Dòng tế bào . 23 2.2. NGUYÊN LIỆU . 24 2.2.1. Hoá chất, dụng cụ . 24 2.2.2. Thiết bị . 24 2.2.3. Môi trường . 25 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu và tách chiết sơ bộ . 26 2.3.2. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học 27 2.3.2.1. Phương pháp thử hoạt tính kháng VSVKĐ 27 2.3.2.2. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào . 28 2.3.2.3. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hoá . 31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 33 Sinh viên: Hà Văn Thịnh Khoa công nghệ sinh học - K13 4 Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học mở Hà Nội 3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC SƠ BỘ CÁC DỊCH CHIẾT TỪ CÁC MẪU THỰC VẬT HỌ NA VÀ HỌ SIM 33 3.1.1. Kết quả tách chiết hóa học các mẫu thực vật từ họ Na và họ Sim 33 3.1.2. Hoạt tính kháng VSVKĐ của các dịch chiết …………………… 34 3.1.3. Hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết ……………………. 36 3.1.4. Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết …………………… 37 3.2. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT PHÂN ĐOẠN VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT METANOL CỦA MẪU THỰC VẬT SV01 ………………………………………………… . 39 3.2.1. Kết quả chiết phân đoạn dịch chiết metanol cửa mẫu SV01…….39 3.2.2. Hoạt tính kháng VSVKĐ các phân đoạn dịch chiết metanol mẫu SV01 ……………………………………………. 41 3.2.3. Hoạt tính gây độc tế bào các phân đoạn dịch chiết metanol mẫu SV01 ……………………………………… ……. 42 3.2.4. Hoạt tính chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết metanol mẫu SV1 ……………………………………………… 43 KẾT LUẬN ………………………………………………………………… 45 PHỤ LỤC ………………………………………………………………… . 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………………… 47 MỞ ĐẦU Nguồn tài nguyên thực vật có chứa các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học ở Việt Nam rất đa dạng và phong phú. Đây là nguồn dược liệu quý đầy tiềm năng và triển vọng mang lại giá trị kinh tế xã hội rất lớn lao. Sinh viên: Hà Văn Thịnh Khoa công nghệ sinh học - K13 5 Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học mở Hà Nội Ngày nay với sự phát triển của các ngành công nghệ sinh học, hoá học các hợp chất thiên nhiên và dược học…. hàng chục ngàn hoạt chất có trong cây cỏ đã được phát hiện, được nghiên cứu và chế biến làm thuốc chữa bệnh. Họ Na và họ Sim đều là những loài thực vật quí và có khả năng sinh tổng hợp và tích luỹ các chất có hoạt tính sinh học cao. Đã có các nghiên cứu khác nhau về hoạt tính sinh học của các hợp chất từ hai họ này nhưng các nghiên cứu trước đây vẫn chỉ là từng đối tượng cụ thể và rời rạc mà chưa có nghiên cứu tổng thể. Để góp phần hoàn thiện bức tranh về các chất có hoạt tính sinh học từ hai họ này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách chiết hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học một số đối tượng thuộc họ Na (Annonaceae) và họ Sim (Myrtaceae)” với mục đích:  Điều tra, đánh giá sơ bộ hoạt tính sinh học các hợp chất từ các loài thực vật thuộc họ Na và họ Sim.  Đề xuất các biện pháp khai thác, sử dụng và bảo tồn nguồn gen cây bản địa, đặc biệt là những loài quí hiếm và có giá trị dược liệu kinh tế cao. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ THỰC VẬT Trong hàng loạt các hợp chất hữu cơ được sinh tổng hợp, chuyển hoá và tích luỹ trong cơ thể thực vật, ta thường gặp một số hợp chất có những tác dụng Sinh viên: Hà Văn Thịnh Khoa công nghệ sinh học - K13 6 Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học mở Hà Nội rất đặc biệt. Đó là những hợp chất có tác dụng chữa bệnh (như kháng virus, kháng khuẩn, chông viêm, gây độc tế bào, kích thích hoặt ức chế hoạt động của các mô, các tế bào sống…) và chúng thường được gọi là những “hợp chất có hoạt tính sinh học” hoặc là những “hoạt chất”. [1] Những hoạt chất thường gặp ở thực vật gồm: xơ thực vật, các acid hữu cơ, dầu béo, tinh dầu, các chất nhựa, các hợp chất glucosid, các ancaloid, các vitamin và các chất kháng sinh. Do tính ưu việt về nhiều mặt của các hoạt chất tự nhiên từ thực vật nên trên thế giới đã và đang nghiên cứu trước hết là các nước phát triển đang quay trở lại nghiên cứu và ứng dụng các hoạt chất thiên nhiênvtừ thực vật, tạo ra các dược phẩm có nguồn gốc từ thực vật. [1] Hiện nay hầu hết các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất có nguồn gốc thực vật được ứng dụng trong phòng ngừa và điều trị một số bệnh của người và động vật tập trung vào các hướng: + Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư + Ức chế sự nhân lên của các vi khuẩn, virus gây bệnh và khả năng kháng viêm + Các hợp chất có khả năng tham gia vào các quá trình sinh hóa hạn chế một số loại bệnh như tiểu đường, ngộ độc hóa chất .v.v + Các hợp chất chống oxy hóa, hạn chế sự sản sinh các gốc tự do, hạn chế đột biến gene Nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất có hoạt tính phòng và trị bệnh, làm các chất dẫn đường cho việc tổng hợp các chất mới có hoạt tính tương tự hoặc mạnh hơn hoạt tính của các hợp chất tự nhiên kết quả là các dược phẩm mới ra đời. [29] Theo đánh giá của tổ chức Y Tế thế giới (WHO) thì có tới 80% dân số thế giới sử dụng cây thuốc cho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu và đặc biệt tỉ lệ này Sinh viên: Hà Văn Thịnh Khoa công nghệ sinh học - K13 7 Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học mở Hà Nội rất cao đối với các nước nghèo và các nước đang phát triển chủ yếu ở các vùng nông thôn. Theo các tài liệu thống kê thì có tới 50% các loại thuốc đã và đang được sử dụng làm thuốc trên thế giới có nguồn gốc thực vật. Rất nhiều biệt dược ở các nước công nghiệp đều phải nhập nguyên liệu từ các nước nhiệt đới. [6] Nhiều hoạt chất từ cây cỏ đã và đang được ứng dụng làm thuốc và được sản xuất ở nhiều nước như reserpin từ cây Ba gạc (Rawlfia serprantina), vinblastin từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus), quinin từ cây Canh ki na (Cinchona spp), diosgenin từ cây Củ mài (Dioscorea deltoidea Wall. Ex Knth)… Gần đây nhiều hoạt chất sinh học có tác dụng chữa trị các loại bệnh hiểm nghèo (chống ung thư, chống HIV, tăng hệ miễn dịch của cơ thể…) đã được phát hiện từ thực vật như: taxol, 10-deacetyl baccatin từ các loại thông đỏ (Taxus spp), Cepharanthin từ Bình vôi hoa đầu (Stephania cepharantha Hayata), baicalin từ cây Thuẫn baican (Scutellaria baicalensis Georgi); các diterpen nhóm ent- labdan, diterpen glucosid, dehydroandrographolip succinic acid monoester và các dẫn suất từ loài Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata), và các hợp chất AC- glycosylated favonoid, alternanthin, triterpen,α- spinasterol, β-spinasterol…Từ một vài loài trong chi Rau dệu (Alternanthera spp), các chất nhóm curcumin từ chi Nghệ (Curcuma L), hợp chất trichosanthin từ loài Qua lâu (Trichosanthes kirilowii Maxim), protein bất hoạt ribosom (Ribosome-inactivating protein), momordin I hoặc MAP30, 1 protein chống virut từ cây Mớp Đắng (Momordica charantia L) và rất nhiều hợp chất tự nhiên khác có chứa ở nhiều loài thực vật. [1] Các hoạt chất trong giới thực vật đã và đang là vẫn đề hấp dẫn, thu hút sự quan tâm đầu tư của các nước công nghiệp phát triển vào việc điều tra, nghiên cứu, khai thác, phát triển, sản xuất chế biến kinh doanh. Những năm gần đây, các cơ quan khoa học của Mỹ, và một số cơ quan nghiên cứu ứng dụng của nhiều nước Châu Á đã tiến hành chương trình nghiên Sinh viên: Hà Văn Thịnh Khoa công nghệ sinh học - K13 8 Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học mở Hà Nội cứu sàng lọc sinh học với 9.741 loài thực vật phân bố tại Đông Nam Á. Từ đó xác định được 2000 loài thực vật thuộc chừng 200 họ chứa các hoạt chất kháng ung thư. Các nghiên cứu trên cũng đã thực hiện thử nghiệm hoạt tính kháng HIV của khoảng 3000 mẫu thuộc khoảng 700 loài thực vật có trong khu vực Đông Nam Á. Đa dạng sinh học nói chung và đa dạng nguồn tài nguyên thực vật chứa các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học nói riêng là tiềm năng to lớn của các nước nhiệt đới cũng như của vùng Đông Nam Á. Song hầu hết các nước có nguồn tài nguyên thực vật phong phú lại là các nước nghèo và kém phát triển hoặc đang phát triển. Các nước công nghiệp, các nước giàu tuy ít nguồn gen nhưng lại có lợi thế về công nghệ và tài chính. Do đó đẻ bảo tồn và sử dụng bền vững đa dạng sinh học, bảo vệ lợi ích quốc gia, lợi ích của các cộng đồng dân tộc có nguồn tài nguyên, nhiều quốc gia đã và đang quan tâm đến việc ban hành “ Pháp luật về tiếp cận và chia sẻ lợi ích nguồn gen sinh vật”. thiết tưởng đây cũng là vấn đề cần thiết phải được đặt ra đối với đất nước ta trong giai đoạn hiện nay cũng như về lâu dài. [1] 1.2. HỌ NA (ANONACEAE) 1.2.1. Đặc điểm thực vật họ Na (Annonaceae) Họ Na Phân loại khoa học Sinh viên: Hà Văn Thịnh Khoa công nghệ sinh học - K13 9 Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học mở Hà Nội Na (Annona squamosa) Giới (regnum): Plantae (không phân hạng): Angiospermae (không phân hạng) Magnoliidae Bộ (ordo): Magnoliales Họ (familia): Annonaceae Họ Na (Annonaceae) còn được gọi là họ Mãng cầu, là một họ thực vật có hoa bao gồm các loại cây thân gỗ, cây bụi hay dây leo. Theo A. L. Takhtajan (1987) thì họ Na ở trên thế giới gồm có khoảng 2.300 đến 2.500 loài trong 120 - 130 chi, đây là họ lớn nhất của bộ Mộc lan (Magnoliales) Họ này sinh trưởng chủ yếu ở vùng nhiệt đới, và chỉ có một ít loài sinh sống ở vùng ôn đới. Khoảng 900 loài ở Trung và Nam Mỹ, 450 loài ở châu Phi, và các loài khác ở châu Á. Các loài thuộc họ Annonaceae có lá đơn, mọc so le (mọc cách), có cuống lá và mép lá nhẵn. Lá mọc thành hai hàng dọc theo thân cây. Vết sẹo nơi đính lá thường nhìn thấy rõ các mạch dẫn. Cành thường ở dạng zíc zắc. Chúng không có các lá bẹ. Hoa đối xứng xuyên tâm (hoa đều) và thường là lưỡng tính. Ở phần lớn các loài thì 3 đài hoa nối với nhau ở gốc hoa. Có 6 cánh hoa có màu nâu hay vàng, nhiều nhị hoa mọc thành hình xoắn ốc cũng như nhiều nhụy hoa, mỗi nhụy có bầu nhụy dạng một ngăn chứa một hoặc nhiều tiểu noãn. Hoa đôi khi mọc trực tiếp trên các cành lớn hoặc trên thân cây. Quả là nang, bế quả hay đa quả [26]. Trong Hệ thực vật Việt Nam, Nguyễn Tiến Bân (2000, 2003) đã nghiên cứu phân loại, mô tả và ghi nhận họ Na (Annonaceae) gồm có 29 chi với 179 loài, 3 phân loài và 20 thứ (varieties). Trong số đó có tới 55 loài, phân loài và thứ là đặc hữu [3]. Sinh viên: Hà Văn Thịnh Khoa công nghệ sinh học - K13 10 . chiết hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học một số đối tượng thuộc họ Na (Annonaceae) và họ Sim (Myrtaceae) Người hướng dẫn : PGS.TS. Lê Mai Hương Sinh. hoạt tính sinh học từ hai họ này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: Tách chiết hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học một số đối tượng thuộc họ