Khóa luận nghiên cứu chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katg

47 730 0
Khóa luận nghiên cứu chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katg

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Khoỏ lun tt nghip Khoa Cụng ngh sinh hc B GIO DC V O TO VIN I HC M H NI KHOA CễNG NGH SINH HC ====== & ====== KHểA LUN TT NGHIP ti: Nghiên cứu chuẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc Isoniazid bằng phơng pháp xác định đột biến trên gen KatG Giỏo viờn hng dn : TS. Nghiờm Ngc Minh Sinh viờn thc hin : Th Phng Lp : 06-05 H NI 2010 Th Phng 1 K13.0605 Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nghiêm Ngọc Minh - Trưởng phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để giúp tôi hoàn thành quyển khóa luận này. Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ phòng Công nghệ sinh học môi trường và Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đặc biệt là CN. Nguyễn Văn Bắc và KS. Cung Thị Ngọc Mai đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại phòng. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học Viện đại học Mở Hà Nội, Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường và viện. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt quyển khóa luận này. Hà Nội, ngày .tháng .năm 2010 Sinh viên Đỗ Thị Phương Đỗ Thị Phương 2 K13.0605 Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT INH RMP EMB PSA PAZ MDR EDR HRSE DNA RNA PCR IPTG X-gal TAE LB dNTPs E.coli Taq-DNA polymerase bp Kb CNSH TCYTTG CTCLQG : Isoniazid : Rifampicin : Ethambutol : Paraminosalicylic acid : Pyrazinamid : Multidrugs resistant (Kháng đa thuốc) : Exetensively drug resitant (Kháng thuốc mở rộng) : Bốn loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol. : Deoxyribonucleic acid : Ribonucleic acid : Polymerase Chain Reaction : Isopropyl-thio-β-D-galactoside : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside : Tris-Acetate-EDTA : Luria - Bertani : Deoxyribonucleotide Triphosphate : Escherichia coli : Thermus aquaticus DNA polymerase : Base pairs : Kilo base : Công nghệ sinh học : Tổ chức y tế thế giới : Chương trình chống lao quốc gia Đỗ Thị Phương 3 K13.0605 Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Nhiễm vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) là một trong những nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người. Hiện nay, bệnh lao đang trở nên nghiêm trọng hơn với đặc trưng là kháng đa thuốc. Trong các trường hợp bệnh lao kháng đa thuốc, khó khăn không chỉ là điều trị thất bại cao, dẫn đến lan truyền nhanh chóng vi khuẩn lao kháng đa thuốc mà còn chưa tìm ra được những thuốc thay thế hiệu quả và hợp lý, trong khi các thuốc chống lao thực sự có hiệu quả chỉ tập trung vào một số ít loại. Những bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc rất khó điều trị. Do đó việc phát hiện sớm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc sẽ góp phần đáng kể trong điều trị bệnh lao. Để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc, hiện nay các cơ sở trong nước chủ yếu vẫn phải dựa vào nuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ. Thời gian chuẩn đoán lao kháng thuốc cần ít nhất 4 – 6 tuần. Với thời gian dài như vậy sẽ khó khăn cho công tác điều trị, khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh toán bệnh lao. Khắc phục những nhược điểm đó, việc ứng dụng sinh học phân tử đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc. Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày, với độ nhậy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn. Đỗ Thị Phương 4 K13.0605 Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do các gen tương ứng chịu trách nhiệm. Các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid thường là do sự biến đổi ở codon thứ 315 trên gen katG (biến đổi acid amin serin thành threonin) từ đó dẫn đến chủng lao đó kháng isoniazid. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: "Nghiên cứu chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katG” Với mục tiêu nghiên cứu là: Phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu bằng phương pháp nhân đoạn và phân tích trình tự nucleotide của gen katG Và nội dung nghiên cứu gồm: - Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu. - Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli. - Tách dòng gen katG. - Giải trình tự gen katG. - Phân tích, phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu. Đề tài này được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học với sự tài trợ kinh phí của đề tài nhánh “Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình xác định nhanh các chủng vi khuẩn laolao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”, Mã số: KC.10.15/06-10-04. Đỗ Thị Phương 5 K13.0605 Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH LAO Nhiễm vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) là một trong những nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người. Hiện nay tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lao được xác định là chiếm 1/3 dân số thế giới. Có khoảng 9 triệu người mắc lao mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm. Tuy vậy tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính. vậy còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị và đang tiếp tục làm lây lan bệnh cho cộng đồng. Bệnh lao gắn liền với sự phát triển của xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay. Trên thế giới chưa bao giờ và cũng không có một quốc gia nào, khu vực hay dân tộc nào là không có người mắc lao và chết do lao. Do sự phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa trị bệnh lao đơn giản và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng chủ quan của y giới, đã làm lãng quên căn bệnh nguy hiểm này. Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển. 1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm họa của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc [27]. Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới). Theo số liệu công bố của TCYTTG (2004), ước tính trong năm 2003 có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và 2 triệu người chết do lao. Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ đều ở độ tuổi lao động, trong đó có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có tỷ lệ mắc bệnh lao cao [1]. Năm 2005, TCYTTG ước tính khu vực Đông Nam Á có 4,8 triệu bệnh nhân lao. Trong số đó số ca bệnh nhân lao mắc mới là gần 3 triệu, chiếm Đỗ Thị Phương 6 K13.0605 Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 34% toàn cầu. Số người chết bệnh lao ở Đông Nam Á là 512000 người, chiếm 1/3 toàn thế giới. Châu Phi có số bệnh nhân lao là 3,8 triệu ; số ca mới mắc là 2,5 triệu; số chết do bệnh lao là 544 000. Hai khu vực này có tình hình mắc lao nặng nề nhất thế giới. Các nghiên cứu về kinh tế cho thấy mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình khoảng 3 – 4 tháng lao động, làm giảm 20 – 30% thu nhập bình quân của gia đình. Những gia đình có người chết sớm bệnh lao có thể sẽ mất tới 15 năm thu nhập. Bệnh lao đã tác động mạnh tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội, làm lực lượng sản xuất bị giảm sút, năng suất lao động giảm. Ngoài ra việc đầu tư cho công việc chẩn đoán và điều trị cho người bệnh cũng làm tiêu tốn một lượng tiền không nhỏ của gia đình và của xã hội [11]. 1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Ở nước ta, bệnh lao còn rất phổ biến. Việt Nam đứng thứ 13 trong số 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu (TCYTTG, 2004). Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philipines về số lượng bệnh nhân lao cao lưu hành cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm. Công cuộc chống lao ở Việt Nam bắt đầu từ năm 1957 khi Viện chống lao được thành lập ở Hà Nội [11]. Trong những năm chiến tranh và thời kì hoà bình lập lại, mặc dù có những cố gắng trong công tác phòng chống lao nhưng do còn nhiều khó khăn về kinh tế và nguồn lực nên chúng ta chưa thực sự kiểm soát được bệnh lao. Đến tháng 11 năm 1994, Chương trình chống lao Quốc gia (CTCLQG) được thành lập. Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và lao/HIV. Nhà nước và Bộ Y tế Việt Nam đã quyết định đưa chương trình chống lao thành một trong những chương trình y tế quốc gia trọng điểm. Cùng với sự đầu tư phát triển các Đỗ Thị Phương 7 K13.0605 Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Chương trình y tế quốc gia nói chung, Bộ Y tế và Chính phủ đã ưu tiên đầu tư đồng bộ lực lượng rất lớn cán bộ, kinh phí và trang thiết bị cho Chương trình chống lao. Ban chỉ đạo chống lao và chính quyền địa phương các cấp đã tham gia tích cực triển khai công tác này, cùng với sự hợp tác và giúp đỡ có hiệu quả về tài chính và kỹ thuật của các tổ chức quốc tế. Năm 1996, Chương trình chống lao quốc gia (CTCLQG) với sự hỗ trợ về kỹ thuật và tài chính của Chính Phủ Hà Lan, hiệp hội chống lao hoàng gia Hà Lan, ủy ban hợp tác y tế Hà Lan - Việt Nam, CTCLQG đã hình thành và xây dựng kế hoạch phòng chống lao giai đoạn 1996 – 2000. Đến năm 1999, chiến lược DOTS (điều trị bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp) đã được bao phủ 100% số huyện trong cả nước [2]. Trong giai đoạn 1997 – 2000, CTCLQG đã phát hiện 532703 bệnh nhân lao các thể, đạt 82% số bệnh nhân ước tính và đã điều trị 260698 bệnh nhân lao phổi AFB(+) với tỷ lệ khỏi là 92 [4]. Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện cà điều trị bệnh nhân, năm1996, Việt Nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu của TCYTTG [11]. là số ít nước sớm nhất đạt được các mục tiêu phòng chống lao do TCYTTG đề ra, những kết quả đạt được có tính bền vững, nên tháng 10 năm 2003 vừa qua CTCLQG Việt Nam đã nhận được giải thưởng của hội chống lao hoàng gia Hà Lan nhân lễ kỷ niệm 100 năm ngày thành lập tổ chức này. Nhân ngày thế giới chống lao 24/3/2004, tại diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ 2 do TCYTTG tổ chức tại New Dehli, CTCLQG Việt Nam là một trong 6 nước và là nước duy nhất trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao được nhận giải thưởng của TCYTTG về thành tích đã đạt được và kết quả có tính bền vững trên 4 năm [11]. Hiện nay, nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1.5%. Ước tính với dân số 70 – 80 triệu, hàng năm ở nước ta có một số lượng lớn Đỗ Thị Phương 8 K13.0605 Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học người bị mắc lao mới. Số lượng người mắc lao mới được thể hiện qua bảng sau: Số mới mắc lao (mọi thể) 130 000 Số lao phổi BK dương tính mới 60 000 Tổng số trường hợp lao 260 000 Tổng số lao phổi BK dương tính 120 000 Đất nước ta có trình độ dân trí chưa cao, ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng, điều kiện kinh tế còn khó khăn và phát triển không đều, nhất là hiện nay đại dịch HIV/AIDS đang lan tràn khắp nơi làm cho công tác phòng chống kiểm soát bệnh lao càng gặp nhiều khó khăn. Tỷ lệ bệnh lao trong nhân dân còn cao không những trong những năm tới mà còn có thể còn trong một thời gian khá dài nữa. 1.3. Tình hình lao kháng thuốc Sau khi thuốc kháng sinh đầu tiên điều trị lao streptomycin ra đời vào 1944, vài năm sau người ta đã sớm nhận thấy hiện tượng kháng thuốc này ở vi khuẩn lao [11]. Cùng với sự ra đời của thuốc điều trị lao khác người ta cũng lần lượt nhận thấy vi khuẩn lao kháng với các thuốc đó sau một thời gian. Năm 1998, TCYTTG đã công bố kết quả khảo sát tình hình vi khuẩn lao kháng thuốc ở 35 nước và khu vực trên thế giới, theo công bố này tỷ lệ kháng thuốc tiên phát trung bình với riêng từng loại thuốc có khác nhau, cụ thể là: kháng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%, ethambutol 0,3%, streptomycin 2,5%. Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát trung bình là 9,9% trong đó kháng 1 thuốc chiếm 6,6%, kháng 2 thuốc chiếm 2,5%, kháng 3 thuốc chiếm 0,6%, 4 thuốc là 0,2%, kháng đa thuốc trung bình là 1,4% [11,28]. Tình hình kháng thuốc mắc phải với từng loại thuốc cũng khác nhau: kháng isoniazid trung bình là 6,3%, rifampicin 0,7%, Ethambutol 0,4%, streptomycin 2,6%. Tỷ lệ kháng thuốc mắc phải trung bình trên thế giới là 36% , trong đó kháng 1 loại thuốc là 12,2%, 2loại thuốc là 9,7%, 3 loại thuốc Đỗ Thị Phương 9 K13.0605 Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học là 5,4% , 4 loại thuốc là 4,4%. Lao kháng đa thuốc mắc phải có tỷ lệ trung bình là 13%. Theo báo cáo dựa trên thăm dò lớn về lao kháng thuốc toàn cầu của TCYTTG công bố ngày 26/2/2008, tỷ lệ nhiễm lao kháng thuốc hiện nay ở mức cao chưa từng có. Mỗi năm có khoảng nửa triệu ca lao kháng đa thuốc, theo ước tính của TCYTTG, chiếm khoảng 5% trong số 9 triệu ca nhiễm lao hàng năm. Cũng trong báo cáo này, lần đầu tiên lao kháng thuốc cực mạnh được đề cập, đây là một dạng gần như không chữa lành được [10] Theo TCYTTG, hiện nay bệnh lao kháng thuốc là một vấn đề toàn cầu đặc biệt nghiêm trọng, nhất là lao kháng đa thuốc. Bệnh lao kháng thuốc xuất hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặc nhiều loại thuốc chống lao. Nguyên nhân là do bệnh nhân không hợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc điều trị được quy định của chương trình chống lao. Một nguyên nhân khác hay gặp là do thầy thuốc kê đơn không đúng hoặc do không phối hợp đầy đủ các thuốc chống lao, liều lượng thuốc không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không đúng cách, điều trị không đủ thời gian…. Kết quả điều trị với bệnh nhân kháng thuốc thường không cao, nhất là đối với bệnh nhân kháng đa thuốc. Chi phí điều trị bệnh nhân kháng đa thuốc tăng lên 100 lần so với bình thường và thậm chí không điều trị được ở một số trường hợp. Vi khuẩn lao kháng đa thuốc là một thách thức lớn đe dọa công cuộc phòng chống lao trên toàn cầu, các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay đang bị vi khuẩn lao kháng lại nhất là kháng đa thuốc. Trong khi các thuốc chống lao hàng đầu chỉ có năm thuốc thì thuốc chống lao loại hai thường có độc tính cao mà giá thành lại đắt. Báo cáo của CTCLQG năm 1998 cho thấy tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao ở Việt Nam là một vấn đề đáng lo ngại. Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 32,5% đứng thứ tư trên thế giới trong khảo sát của TCYTTG. Tình hình kháng thuốc trong số 640 bệnh nhân được nghiên cứu bởi TCYTTG cụ Đỗ Thị Phương 10 K13.0605 . đoán vi lao kháng isoniazid Vi khuẩn lao kháng isoniazid được xác định theo phương pháp chẩn đoán kiểu gen. Các phương pháp chẩn đoán kiểu gen đều dựa trên. kháng isoniazid. Hình 1.3. Cơ chế kháng thuốc isoniazid của vi khuẩn lao [22] 1.3.4. Các phương pháp chẩn đoán lao kháng thuốc Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng

Ngày đăng: 23/12/2013, 15:29

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan