BÀI GIẢI CHƯƠNG 4: ENZYME 1. Vị ngọt của bắp mới đóng gói là nhờ vào hàm lượng đường cao trong thành phần của nó. Bắp được lưu giữ lâu ngày sẽ không còn ngọt nữa vì khoảng 50% lượng đường tự do đã bị chuyển hóa thành tinh bột chỉ sau một ngày đóng gói. Để bảo quản tính ngọt của bắp tươi, những trái bắp đã bóc vỏ được nhúng vào nước sôi trong vài phút sau đó làm mát trong nước lạnh. Bắp qua quá trình này có thể giữ ở nhiệt độ lạnh và vị ngọt của nó. Cơ sở sinh hóa của tiến trình này là gì? Trong hạt bắp có hệ enzyme tổng hợp tinh bột từ các đơn phân là glucose. Trong những ngày đầu sau khi đóng gói hạt, các enzyme trên sẽ chuyển đổi glucose thành tinh bột nên làm giảm độ ngọt của bắp. Để bảo quản độ ngọt nói trên, trước khi đóng gói, người ta nhúng hạt bắp vào nước sôi trong 3 phút để bất hoạt các enzyme nói trên (enzyme bị biến tính bởi nhiệt độ), làm cho quá trình biến glucose thành tinh bột dừng lại. Hạt bắp giữ được vị ngọt. 2. Urease đẩy mạnh tốc độ thủy phân ure ở pH 8.0 và nhiệt 20 o C lên đến 10 14 lần. Một lượng urea cho sẵn có thể bị thủy phân hoàn toàn bởi một lượng urease cho sẵn trong 5,0 phút ở 20 o C và pH 8.0, vậy cần bao nhiêu thời gian để lượng urea này bị thủy phân ở cùng điều kiện trên khi không bổ sung enzyme urease? Giả sử rằng cả hai phản ứng này diễn ra trong điều kiện vô trùng, tức là vi khuẩn không thể “tấn công” vào lượng ure đó. Tốc độ thủy phân ure ở pH 8.0 và nhiệt độ 20 o C của urease nhanh hơn bình thường 10 14 lần. Do đó, lượng ure bị enzyme phân hủy hoàn toàn ở điều kiện trên trong 5 phút thì sẽ phân hủy một cách tự nhiên trong thời gian là: 5 × 10 14 phút Thời gian trên tương đương với số năm là: 9 14 105.9 3652460 105 ×≈ ×× × năm 3. Khi dung dịch enzyme bị gia nhiệt, dung dịch enzyme sẽ bị mất hoạt tính xúc tác dần dần theo thời gian do bị biến tính. Một dung dịch hexokinase ủ ở 45 o C mất 50% hoạt tính trong 12 phút. Nhưng khi ủ với cùng điều kiện và sự có mặt với nồng độ lớn một trong các cơ chất của nó thì chỉ mất 3% hoạt tính trong 12 phút. Giải thích tại sao sự biến tính bởi nhiệt độ của hexokinase lại bị chậm lại khi có mặt của cơ chất của chính nó. Khi enzyme bị gia nhiệt, nhiệt độ sẽ phá vỡ các tương tác yếu (tương tác kỵ nước, tương tác Van der Walls) cũng như các liên kết (liên kết disulfide) giữa các thành phần trong phân tử protein-enzyme dẫn đến sự thay đổi cấu trúc, điện tích và enzyme bị mất hoạt tính. Khi gắn với cơ chất thì enzyme ít bị mất hoạt tính bởi nhiệt độ hơn dạng tự do. Vì: 1 - Cần một năng lượng lớn hơn để bẽ gãy các liên kết giữa các thành phần trong phân tử protein-enzyme cũng như giữa enzyme và cơ chất. - Cơ chất liên kết vào tâm hoạt động của enzyme, đã bảo vệ các thành phần trong tâm hoạt động khỏi tác động của nhiệt độ. - Khi liên kết với cơ chất, enzyme sẽ thay đổi cấu hình, thay đổi điện tích . . . dẫn tới có cấu trúc ổn định hơn so với enzyme tự do. 4. Enzyme lactate dehydrogenase ở cơ, xúc tác phản ứng NADH và NAD + (lần lượt là dạng khử và oxi hóa) của coenzyme NAD. Chỉ có dung dịch NADH mới hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 340nm, NAD + không hấp thu ở bước sóng này. Tính chất này dùng để xác định nồng độ NADH trong dung dịch bằng việc xác định khả năng hấp thụ quang phổ ở bước sóng trên của dung dịch. Hãy cho biết những tính chất nào của NADH có thể dùng để xây dựng một phép định lượng cho lactate dehydrogenase? Trả lời: tính của NADH có thể dùng để xây dựng một phép định lượng cho lactate dehydrogenase là hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 340nm Cụ thể là: mỗi mole NADH bị mất đi tương đương với 1 mole cơ chất bị chuyển hóa. NADH mất đi thì độ hấp thụ quang ở bước sóng 340 nm giảm. o Như vậy xây dựng đồ thị giữa độ giảm của mất độ quang theo thời gian ta sẽ xác định được vận tốc phản ứng của lactate dehydrogenase là V μmol/phút hoặc Vo. o Thay đổi [S] theo chiều tăng dần ta sẽ xác định được các giá trị Vo khác nhau và do vậy dựng được đồ thị của phương trình Lineweaver-Burk để xác định Vmax và Km Nồng độ enzyme Vận tốc phản ứng cực đại E1 V 1 E2 V 2 … … 2 En V n - Vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ enzyme và vận tốc phản ứng cực đại, ví dụ: - Dựa vào vận tốc phản ứng cực đại (khi [S]>>>K m ), quy chiếu từ đồ thị ra giá trị nồng độ enzyme tương ứng. 5. Mặc dù phương pháp đồ thị có thể dùng để xác định V max và K m của một phản ứng xúc tác enzyme một cách đúng đắn. Thỉnh thoảng những phép định lượng này có thể được ước lượng một cách nhanh chóng bởi việc đánh giá các giá trị V 0 khi gia tăng nồng độ cơ chất [S]. Hãy ước lượng giá trị V max và K m của phản ứng xúc tác enzyme với những dữ liệu cho dưới đây: [S] (M) V 0 (μmol/phút) 2.5*10 -6 28 4.0*10 -6 40 1*10 -5 70 2*10 -5 95 4*10 -5 112 1*10 -4 128 2*10 -3 139 1*10 -2 140 - Theo phương trình Michaelis-Menten, khi [S]>>>K m thì V 0 = V max . Bằng thực nghiệm có thể nhận thấy khi tăng [S] đến một giá trị nào đó thì vận tốc V o đạt giá trị ngưỡng. Dù thêm tăng nồng độ cơ chất cao hơn, giá trị V o lúc này không còn tăng thêm nữa, V o =V max . Vậy nên V max ≈ 140, khi [S] =1*10 -2 (M) - K m = [S] khi V o =1/2V max . Do đó tại V o = 70, K m =[S]=1*10 -5 (M) 3 6. Những kết quả thí nghiệm dưới đây được tuyển chọn từ những nghiên cứu về hoạt tính xúc tác của các peptidase đường ruột với cơ chất là glycylglycine: Glycylglycine + H 2 O → 2 glycine [S] (mM) Sản phẩm (μmol/phút) 1.5 0.21 2.0 0.24 3.0 0.28 4.0 0.33 8.0 0.40 16.0 0.45 Dựa vào phép phân tích đồ thị hãy xác định V max và K m cho sự chuẩn bị của enzyme và cơ chất. Nghịch đảo giá trị [S] và vận tốc phản ứng V o : 1/[S] mM -1 1/V o ( µ mol -1 .phút -1 ) 0.6667 4.7619 0.5000 4.1667 0.3333 3.5714 0.2500 3.0303 0.1250 2.5000 0.0625 2.2222 Vẽ dồ thị phương trình Lineweaver-Burk (nghịch đảo phương trình Michaelis- Menten) 4 Theo phương trình ta có: - Điểm giao đồ thị: 1/V max =1,9978  V max = 0,5 µmol/phút - Hệ số góc = K m /V max = 0,004  K m =4.2663 x 0,5= 2.135 mM 7. Trung tâm hoạt động của lysozyme chứa hai amino acid cần thiết cho khả năng xúc tác là: Glu 35 và Asp 52 . Giá trị pK a của nhóm carboxyl tại các amino acid trên trong chuỗi lần lượt là 5.9 và 4.5. Ở pH tối ưu pH 5.2, trạng thái ion của hai amino acid trên như thế nào (ion hóa hay bị khử ion hóa)? Trạng thái ion hóa giải thích như thế nào về hoạt tính liên quan đến pH của lysozyme được cho ở hình bên? pH 5.2 là pH tối ưu của enzym, tại đó: 5 - nhóm carboxyl của Glu35 ở trạng thái bị proton hóa (thêm 1 proton H + ) (COOH ) vì Glu có pK a là 5.9. - nhóm carboxyl của Asp ở trạng thái bị khử proton hóa (mất proton H + ) (COO - ) vì có pK a là 4.5. - Ở pH mà carboxyl của Glu35 không quá proton hóa và Asp52 không quá khử hóa thì đó là pH nằm giữa 2 giá trị pKa = (4,5 +5,9)/2= 5.2 đó là pH tối ưu của enzym (chỉ đúng trong trường hợp enzym chỉ có 2 residues này là xúc tác) 6 . BÀI GIẢI CHƯƠNG 4: ENZYME 1. Vị ngọt của bắp mới đóng gói là nhờ vào hàm lượng đường. phần trong phân tử protein -enzyme dẫn đến sự thay đổi cấu trúc, điện tích và enzyme bị mất hoạt tính. Khi gắn với cơ chất thì enzyme ít bị mất hoạt tính