Bộ giáo dục và đào tạo Trờng đại học vinh Nguyễn Thị Thu Loan sử dụng kỹ thuật hóa sinh và sinh học phân tử góp phần phân loại các giống bởi trồng tại nghệ an và hà tĩnh Chuyên ngành: Thực vật học Mã số: 60 42 20 Luận văn thạc sĩ sinh học Ngời hớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Văn Mùi Vinh - 2006 1 Những từ viết tắt ADN Axit Deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism = Đa hình độ dài các mảnh đợc khuyếch đại ARN Axit ribonucleic bp Cặp bazơ nitơ dNTPs Deoxyribonucleozit 5 Triphotphat ISSR Inter - Simple Sequence Repeat IRAP Inter - Restrotransposon Amplified Polymorphism Kb Kilo bazơ M Marker = thang ADN chuẩn PCR Polymerase Chain Reaction =Phản ứng chuỗi trùng hợp RAPD Random Amplified polymorphism DNA =Đa hình các đoạn ADN đợc nhân bản ngẫu nhiên RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism = Đa hình các mảnh cắt giới hạn RNaza Ribonucleaza TE Tris - Ethylenediaminetetraaxetate Tm Melting Temperatures = Nhiệt độ nóng chảy UPGMA Unweighted pairgroup method analysis SSR Simple Sequence Repeat 2 Mục lục Trang Mở đầu . Chơng 1. Tổng quan tài liệu . 1.1. Giới thiệu chung về chi Citrus và cây bởi 1.1.1. Phân loại . 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố 1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bởi . 1.1.3.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ trên thế giới . 1.1.3.2. Tình hình sản xuất và tiêu thu trong nớc . 1.1.4. Đặc điểm chung và giá trị của cây bởi . 1.1.4.1. Đặc điểm thực vật của bởi . 1.1.4.2. Giá trị cây bởi 1.1.5. Lợc sử nghiên cứu chi Citrus 1.1.5.1. Tình hình nghiên cứu chi Citrus trên thế giới 1.1.5.2. Tình hình nghiên cứu chi Citrus ở Việt Nam 1.2. Kỹ thuật PCR- RAPD 1.2.1. Kỹ thuật PCR . 1.2.1.1. Lịch sử của phơng pháp . 1.2.1.2. Nguyên tắc của phơng pháp 1.2.1.3. Thành phần phản ứng PCR 1.2.1.4. ứng dụng của phản ứng PCR . 1.2.2. Kỹ thuật RAPD . 1.2.2.1. Nguyên lý của kỹ thuật RAPD 1.2.2.2. Các ứng dụng kỹ thuật RAPD . Chơng 2. Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu . 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu . 2.1.1. Nguyên liệu thực vật . 2.1.2. Thiết bị và hoá chất sử dụng . 3 2.2. Phơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phơng pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật . 2.2.2. Phơng pháp phân tích các chỉ tiêu sinh hoá 2.2.3. Phơng pháp phân tích sinh học phân tử 2.2.3.1. Phơng pháp tách chiết và làm sạch ADN từ lá bởi 2.2.3.2. Phơng pháp xác định hàm lợng và độ tinh sạch ADN 2.2.3.3. Phơng pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR- RAPD 2.2.2.4. Phơng pháp điện di trên gel agaroza và gel polyacrylamit . 2.2.3.5. Phơng pháp phân tích số liệu . Chơng 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Đặc điểm hình thái các giống bởi nghiên cứu . 3.1.1. Đặc điểm hình thái của giống bởi Phúc Trạch . 3.1.2. Đặc điểm hình thái của giống bởi Đờng . 3.1.3. Đặc điểm hình thái của giống bởi Đào . 3.1.4. Đặc điểm hình thái của giống bởi Chua 3.1.5. Đặc điểm hình thái của giống bởi Chộng . 3.1.6. Đặc điểm hình thái của giống bởi Trắng 3.1.7. Đặc điểm hình thái của giống bởi Oi 3.1.8. Đặc điểm hình thái của giống bởi Sơn 3.2. Đặc điểm sinh hóa của các giống bởi nghiên cứu . 3.2.1. Hàm lợng chất hữu cơ trong quả 3.2.2. Phân tích hợp chất flavonoit bằng sắc ký lớp mỏng . 3.3. Kết quả phân tích các chỉ tiêu phân tử . 3.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá 8 giống bởi 3.3.2. Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD 3.3.2.1. Số phân đoạn ADN xuất hiện 3.3.2.2. Phân tích sự đa hình ADN của sản phẩm RAPD trên điện di đồ . 3.3.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa các giống bởi nghiên cứu . Kết luận và kiến nghị 4 Tài liệu tham khảo Phụ Lục . Lời cảm ơn Luận văn đợc hoàn thành tại phòng Sinh lý - Sinh hoá, Khoa Sinh học, tr- ờng Đại học Vinh và phòng Công nghệ Enzym - Protein, Trung tâm sinh học phân tử và công nghệ tế bào, khoa Sinh học, trờng Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN. Để hoàn thành luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Văn Mùi, ngời đã tận hớng dẫn và tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Sinh học, trờng Đại học Vinh, các thầy cô giáo khoa Sinh học, trờng Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN đã chỉ bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập. Qua đây, em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đối với các thầy cô giáo khoa Đào tạo Sau đại học, các cô chú là cán bộ phòng Thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ trong thời gian qua. Cuối cùng, xin dành cho gia đình và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Vinh, ngày 20 tháng 12 năm 2006 Học viên Nguyễn Thị Thu Loan 5 Mở đầu Nghệ An và Hà Tĩnh là khu vực có điều kiện khí hậu, đất đai thuận lợi cho các loài của chi Citrus phát triển, đây đợc xem là nơi có nhiều giống cam quýt nổi tiếng mà sản phẩm của chúng đợc bán rộng rãi trên thị trờng trong nớc và thị trờng thế giới. Điều tra các giống bởi thuộc chi Citrus, chúng tôi nhận thấy rằng ở Nghệ An và Hà Tĩnh có sự đa dạng cao về thành phần các giống bởi địa phơng. Một số giống đợc biết đến từ lâu nh bởi Phúc Trạch, bởi Đờng Hơng Sơn vì có chất lợng quả tốt, bên cạnh đó còn nhiều giống khác đợc ngời dân gọi bằng các tên khác nhau, cha có sự thống nhất về mặt phân loại. Dù là giống nổi tiếng hay cha đợc biết đến thì các giống bởi trồng ở hai tỉnh này đều cho năng suất cao, chất l- ợng tốt, đáp ứng đợc nhu cầu của ngời tiêu dùng. Vì vậy từ đời này qua đời khác, các cây bởi ngon đều đợc chiết cành để gây giống mới. Là một trong ba đối tợng cây ăn quả chính (chuối, dứa, và cây có múi) nh- ng ở Việt Nam việc nghiên cứu về bởi, đặc biệt là nghiên cứu về mặt phân loại hiện nay vẫn cha đợc tiến hành rộng khắp. Bởi lại có sự đa dạng về giống và ít có sự khác biệt giữa các giống trong loài nên việc phân loại chúng gặp rất nhiều khó khăn, kết quả phân loại hầu nh mới chỉ đạt đợc ở mức độ hình thái và giải phẫu, cha phản ánh hết đợc mối quan hệ xa gần của chúng về mặt họ hàng. Vì vậy sử dụng các kỹ thuật sinh học hiện đại, đặc biệt là kỹ thuật hóa sinh và sinh học phân tử hỗ trợ cho phân loại đạt hiệu quả cao và chính xác hơn, bổ sung cho phơng pháp phân loại bằng hình thái, là một việc làm quan trọng và cần thiết. Có rất nhiều phơng pháp phân loại học phân tử dùng trong phân tích tính đa hình hệ gen nh phơng pháp RFLP, AFLP, SSR Tuy nhiên các phơng pháp 6 này đều phức tạp, yêu cầu thông tin về trình tự nghiên cứu và đòi hỏi một lợng lớn ADN của hệ gen nên chỉ có kỹ thuật RAPD (Random Amplyfied Polymorphism DNA) là đợc sử dụng phổ biến, đây là kỹ thuật đơn giản, dễ làm, ít tốn kém, nó dựa trên nguyên tắc phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) với các mồi ADN không đặc thù để nhân bản các đoạn ADN một cách ngẫu nhiên. Bằng kỹ thuật này, Viện công nghệ sinh học Việt Nam đã đánh giá tính đa hình của nhiều giống bởi, phân loại chúng, xây dựng đợc cây phát sinh chủng loại và tìm đợc các dạng tổ tiên [32]. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã lựa chọn kỹ thuật RAPD. Xuất phát từ một thực tế là nhiều giống bởi trồng ở Nghệ An và Hà Tĩnh về mặt hình thái khó phân biệt nhau nhng đợc ngời dân địa phơng gọi bằng các tên gọi khác nhau, song liệu chúng có phải là các giống khác nhau hay không thì cho đến nay vẫn cha đợc làm sáng tỏ. Vì vậy tiến hành nghiên cứu để tìm một lời giải đáp cho vấn đề này là một việc làm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Với những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Sử dụng kỹ thuật hóa sinh và sinh học phân tử góp phần phân loại các giống bởi trồng tại Nghệ An và Hà Tĩnh. Đề tài thực hiện với mục tiêu là: nghiên cứu đặc điểm sinh hóa và di truyền của các giống bởi nhằm đánh giá mối quan hệ họ hàng giữa chúng, thông qua đó cung cấp thêm các dẫn liệu làm cơ sở cho việc phân loại, đồng thời góp phần đánh giá đa dạng sinh học, định hớng khoa học cho việc bảo tồn và khai thác hợp lí nguồn tài nguyên thực vật ở nớc ta. 7 Chơng 1. Tổng quan tài liệu 1.1. Giới thiệu chung về chi Citrus và cây bởi 1.1.1. Phân loại Cây bởi có tên khoa học là Citrus maxima (J. Burmal) Merrill thuộc chi Citrus, họ phụ Aurantioideae, họ Cam Rutaceae, bộ Cam Rutales. Họ Cam là họ lớn nhất, có khoảng 150 chi với khoảng 1600 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt, chỉ có một số ít ở vùng ôn đới, đặc biệt có nhiều ở Nam Phi và Australia [24]. 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố Trong các loại cây ăn quả nhiệt đới và á nhiệt đới, chi Citrus có địa bàn phân bố rộng, chúng có mặt ở hầu hết các lục địa, thích nghi rộng với nhiều điều kiện đất đai, ngay cả ở đất rất nghèo dinh dỡng hay đất ủng. Bởi là loài phân bố rộng nhất trong các loài Citrus, bởi đợc trồng nhiều ở Nam á và trên khắp lãnh thổ Malaixia, đặc biệt mọc hoang trên bờ sông Fiji và Tonga. Cây bởi cũng có mặt ở Trung Quốc gần 100 năm trớc công nguyên, vùng trồng bởi nhiều nhất là Nam Trung Quốc thuộc các tỉnh Jiangsu, Jiangxi và Fujian. Đặc biệt ở Thái Lan ngời ta thấy trên bờ sông Thachin có nhiều loài thuộc chi Citrus, trong đó có bởi. Bởi cũng đợc trồng nhiều ở Đài Loan, phía Nam Nhật Bản, Bănglades, Việt Nam, Indonesia, New Guinea, Tahiti, California và Israel [56]. Theo Cassin (1984), khu phân bố các loài trong chi Citrus nói chung, bởi nói riêng nằm trong phạm vi từ 40 vĩ độ Nam đến 40 vĩ độ Bắc, nhng tập trung nhiều nhất là ở Châu á, vùng xung quanh Địa Trung Hải, Trung Mĩ, phía Nam Châu Phi và Châu Mĩ, Châu úc (theo Nguyễn Nghĩa Thìn,[30]). ở Châu Âu, các nớc trồng cam, bởi có tiếng nh Pháp, ý, Tây Ban Nha với diện tích hàng chục 8 vạn hecta. Còn ở Châu Mĩ, nơi có số lợng cam đứng đầu thế giới thì có các vùng trồng cam, bởi lớn nh California, Florida, Colombia, Arizon. Riêng ở Châu á, b- ởi đợc trồng ở Xiri, ấn Độ, Trung Quốc, Malaixia, Nhật Bản và cả Việt Nam. Đặc biệt ở Trung Quốc và ấn Độ đợc xem là trung tâm phát sinh của nhiều giống bởi nổi tiếng. Bởi thích nghi với đất phù sa cổ ven sông nên ở Việt Nam vùng trồng bởi lớn nhất là vùng ven sông nh sông Hồng, sông Thái Bình, sông Ngàn Sâu, sông Ngàn Phố. Còn theo Tanaka và Engler thì trung tâm phát sinh chính của các loài trong chi Citrus là ở ấn Độ và Mianma. Tác giả đã vạch ra đờng ranh giới vùng xuất xứ của các giống thuộc chi Citrus từ phía Đông ấn Độ (chân núi Himalaya) qua Australia, miền Nam Trung Quốc và Nhật Bản (theo Hoàng Ngọc Thuận, [34]). Mặc dù có nhiều giả thuyết khác nhau về nguồn gốc dã sinh của bởi nhng hầu hết đều thống nhất rằng cây bởi bắt nguồn từ các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam Châu á, kể cả lục địa, bán đảo và quần đảo. Ngoài tìm ra đợc nơi xuất xứ của bởi, các nhà nghiên cứu còn tìm đợc nguồn gốc của quýt ở Nam á, trên quần đảo Malaixia và một số nơi ở Nhật Bản; còn cam thì bắt nguồn từ biên giới Việt Nam - Trung Quốc, từ ấn Độ, Mianma. Ngày nay ngoài những nơi nằm trong giả thuyết về nguồn gốc phát sinh, các loài Citrus đợc phân bố rộng rãi khắp những nơi có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt, quá trình trồng trọt và lai tạo đã làm cho những loài ban đầu biến đổi, dẫn đến sự đa dạng và phong phú về thành phần loài trong chi Citrus nh hiện nay. 1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bởi 1.1.3.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ trên thế giới So với các loài cây ăn quả khác, cam quýt đợc trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, chúng chiếm tỉ trọng cao cả về số lợng và nhu cầu tiêu dùng. Theo dự báo của tổ chức lơng thực thế giới (FAO), vào năm 1994 tổng sản l- ợng cam quýt trên thế giới đạt 80 triệu tấn (chiếm 20% sản lợng các loại quả) 9 trong đó cam chanh 58,373 triệu tấn, quýt 7,636 triệu tấn và ít nhất là chanh và bởi. Đến năm 2000, sản lợng quả có múi lên tới 85 triệu tấn, nhu cầu tiêu thụ trên thị trờng vào khoảng 80 triệu tấn, tăng trởng hàng năm là 2,65%. Cũng theo thông báo của tổ chức này, diện tích trồng cây có múi ngày càng đợc mở rộng. Vào năm 1990 trên thế giới có 2 triệu ha đất trồng cam quýt, đến năm 2000 diện tích này tăng lên gần 3,5 triệu ha. Khu vực đứng đầu về diện tích và sản lợng cam quýt là Châu Mỹ và Châu á, từ đây cam quýt đợc xuất khẩu sang nhiều nớc khác [34]. 1.1.3.2. Tình hình sản xuất và tiêu thu trong nớc Nhân dân ta có tập quán trồng cam quýt lâu đời. Với 53 tỉnh thành trong cả n- ớc nơi đâu cũng có mặt của các loài cây ăn quả có múi này, song tuỳ thuộc vào điều kiện khí hậu đất đai mà cam quýt đợc trồng tập trung hay phân tán nhiều hoặc ít. Ba vùng trồng cây ăn quả có múi trên diện tích lớn ở nớc ta là: vùng đồng bằng sông Cửu Long, vùng khu bốn cũ và vùng trung du miền núi phía Bắc. Riêng ở đồng bằng sông Cửu Long, theo tài liệu của tổng cục thống kê (1995) thì năm 1993 diện tích cam quýt lên tới 15.944 ha, chiếm 57,86% diện tích cam quýt cả n- ớc và sản lợng đạt 124,548 tấn, chiếm 76,04% sản lợng cam quýt cả nớc. Các tỉnh trồng nhiều cam quýt nhất của vùng này là Tiền Giang, Bến Tre, Vĩnh Long, Cần Thơ, Đồng Tháp, năng suất bình quân của cam đạt 105 tạ/ha, chanh đạt 88 tạ/ha, quýt 87 tạ/ha, bởi 74 tạ/ha. ở vùng khu bốn cũ, nơi tập trung cam quýt lớn nhất là Phủ Quỳ - Nghệ An với diện tích cam quýt là 1.600 ha, ngoài ra còn một số vùng rải rác sản xuất cam, bởi nh Hơng Sơn, Hơng Khê (Hà Tĩnh), cam quýt ở đây cho mẫu mã đẹp và chất lợng tốt nên hấp dẫn đợc ngời tiêu dùng. Vùng núi phía Bắc gồm các tỉnh Tuyên Quang, Hà Giang, Yên Bái, Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Bắc Thái là nơi sản xuất nhiều cam quýt, riêng diện tích trồng cam quýt ở Bắc Giang đã lên 1.000 ha [36]. Bởi có mặt trong tập đoàn cây ăn quả nổi tiếng này, các vùng sản xuất bởi chính ở nớc ta là Bến Tre, Đồng Nai, Bình Dơng, Huế, Phú Thọ, Hà Tĩnh và Hà Nội với các giống bởi quý nh bởi Phúc Trạch, bởi Thanh Trà, bởi Đoan 10 . và đào tạo Trờng đại học vinh Nguyễn Thị Thu Loan sử dụng kỹ thuật hóa sinh và sinh học phân tử góp phần phân loại các giống bởi trồng tại nghệ an và hà. học và thực tiễn. Với những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Sử dụng kỹ thuật hóa sinh và sinh học phân tử góp phần phân loại các giống bởi trồng