BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH NGÔ THỊ OANH NGHI£N CøU Kü THUËT NH¢N SINH KHèI Vµ Sö DôNG NÊM Isaria tenuipes PHßNG TRõ S¢U KHOANG h¹i c©y trång TRONG §IÒU KIÖN THùC NGHIÖM CHUYÊN NGÀNH: TRỒNG TRỌT MÃ SỐ: 60.62.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. TRẦN NGỌC LÂN VINH - 2011 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, các số liệu được thu thập qua các thí nghiệm do bản thân tiến hành và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan các thí nghiệm để thu thập số liệu trong luận văn đã được chính bản thân tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ Phòng thí nghiệm Công nghệ Nấm ký sinh côn trùng, Khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh, với sự đồng ý và hướng dẫn của PGS.TS. Trần Ngọc Lân là giáo viên hướng dẫn, các thầy cô giáo là kĩ thuật viên phụ trách phòng thí nghiệm. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Vinh, tháng 12 năm 2011 Tác giả Ngô Thị Oanh i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình công tác, học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Chuyên ngành Trồng trọt, tôi đã luôn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía thầy cô, đồng nghiệp, người thân, bạn bè, các nhà khoa học. Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới PGS. TS.Trần Ngọc Lân, người đã dẫn dắt, định hướng cho tôi từ những bước đầu làm nghiên cứu khoa học, rất tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn tôi suốt thời gian làm đề tài cũng như trong quá trình học tập. Thầy luôn động viên, khuyến khích và mang đến cho tôi niềm say mê nghiên cứu khoa học. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo là các kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã hướng dẫn, giúp đỡ về chuyên môn và tạo điều kiện về cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm cùng tập thể cán bộ trong Khoa Nông Lâm Ngư, Ban lãnh đạo Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện cho tôi trong công tác, học tập và nghiên cứu đề tài. Xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, các đề tài KH & CN đã hỗ trở kinh phí và phương pháp nghiên cứu cho tôi để thực hiện đề tài: (1) Đề tài Nghị định thư giữa Trường Đại học Vinh (Việt Nam) và BIOTEC (Thái Lan): “Hợp tác nghiên cứu xác định một số loài nấm ký sinh trên côn trùng và tuyển chọn một số loài nấm đặc hữu có hoạt chất sinh học làm dược liệu”, Mã số: 04/2009/HĐ-NĐT Và tôi xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt tới người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ, hỗ trở tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Vinh, tháng 12 năm 2011 Tác giả Ngô Thị Oanh ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung Bt Bào tử CT Công thức C. Cordyceps CV% Độ biến thiên của mẫu ĐTHT Đông trùng - Hạ thảo EPF Entomopathogenic fungi EPF Entomology Pathogenic Fungi I. Isaria LSD Phương sai mẫu M Giá trị trung bình PDA Potato Dextrose Agar iii MỤC LỤC Trang VINH - 2011 .2 LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN .ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT .iii DANH MỤC CÁC BẢNG .vi MỞ ĐẦU .1 1. Lý do chọn đề tài .1 2. Mục tiêu nghiên cứu 3 3. Ý nghĩa của đề tài 3 Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Nấm ký sinh côn trùng .4 1.1.1. Khái niệm 4 1.1.2. Chu trình sống và lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 5 1.2. Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới .9 1.2.1. Nghiên cứu các hoạt chất sinh học có trong nấm ký sinh côn trùng .9 1.2.2. Nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trong kiểm soát và phòng trừ sâu hại .13 1.2.3. Tình hình nghiên cứu về nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng 15 1.3.2. Nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ sâu hại .21 1.3.3. Nghiên cứu về kỹ thuật nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng 23 Chương II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1. Nội dung nghiên cứu 24 2.2. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu .24 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 24 2.2.2. Vật liệu nghiên cứu 24 2.3. Thời gian và địa điểm .24 2.4. Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu sinh trưởng nấm trên môi trường PDA .25 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân sinh khối nấm Isaria tenuipes 27 2.4.3. Phương pháp đánh giá hiệu lực chế phẩm nấm Isaria tenuipes phòng trừ nhộng sâu khoang hại cây trồng trong phòng thí nghiệm .30 2.5. Phương pháp xử lý số liệu 31 Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .32 3.1. Sự phát triển của Isaria tenuipes trên môi trường PDA 32 iv 3.1.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Isaria tenuipes trên môi trường PDA .32 3.1.2. Ảnh hưởng của thể tích môi trường PDA tới sự sinh trưởng theo chiều ngang khuẩn lạc Isaria tenuipes .34 3.1.5. Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng tới sự phát triển theo chiều ngang của Isaria tenuipes 40 3.1.6. Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng tới sự phát sinh bào tử nấm Isaria tenuipes 42 3.2. Sinh trưởng của Isaria tenuipes trên môi trường lỏng 43 3.2.1. Sinh trưởng của nấm Isaria tenuipes trên bề mặt môi trường lỏng .44 3.2.2. Ảnh hưởng của môi trường lỏng tới quá trình tạo sinh khối nấm Isaria tenuipes 45 3.2.3. Ảnh hưởng của môi trường lỏng tới sự hình thành bào tử của nấm Isaria tenuipes 48 3.2.4. Đánh giá sinh trưởng và phát triển của nấm Isaria tenuipes trên môi trường lỏng được lựa chọn 50 3.3. Sinh trưởng và phát triển nấm I. tenuipes trên môi trường rắn 51 3.3.1. Sinh trưởng của Isaria tenuipes trên bề mặt môi trường rắn .51 3.3.2. Khả năng phát sinh bào tử nấm I. tenuipes trên các môi trường rắn .54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .61 TÀI LIỆU THAM KHẢO .63 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC BẢNG Hình 1.1. Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 5 Hình 1.2. Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng .8 Hình 2.1. Mô tả các bước cấy nấm trên môi trường PDA .26 Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng của Isaria tenuipes trên PDA .32 Hình 3.1. Sự sinh trưởng và phát triển Isaria tenuipes trên môi trường PDA .33 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thể tích môi trường PDA tới sự sinh trưởng theo chiều ngang khuẩn lạc nấm I. tenuipes 34 Hình 3.2. Ảnh hưởng của thể tích môi trường tới sự sinh trưởng theo chiều ngang khuẩn lạc nấm I. tenuipes 35 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thể tích môi trường PDA tới chiều cao nấm I.tenuipes .37 Hình 3.3. Ảnh hưởng của thể tích môi trường tới chiều cao khuẩn lạc I. tenuipes 37 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thể tích môi trường PDA tới sự phát sinh bào tử nấm I. tenuipes .38 Hình 3.4. Ảnh hưởng của thể tích môi trường PDA tới sự phát sinh bào tử nấm I. tenuipes .39 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng tới sự phát triển theo chiều ngang của khuẩn lạc I. tenuipes .41 Hình 3.5. Ảnh hưởng của dinh dưỡng tới đường kính khuẩn lạc I. tenuipes. .41 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng tới sự phát sinh bào tử 43 Hình 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng tới sự phát sinh bào tử 43 Bảng 3.7. Sinh trưởng của I. tenuipes trên bề mặt môi trường lỏng .44 Hình 3.7. Sinh trưởng của nấm I. tenuipes trên bề mặt môi trường lỏng 45 Bảng 3.8. Khả năng tạo sinh khối của nấm I. tenuipes trên các môi trường lỏng .45 Hình 3.8. Khả năng tạo sinh khối của nấm I. tenuipes trên các môi trường lỏng .46 Hình 3.9. Sinh khối của nấm I. tenuipes trên môi trường lỏng .47 Bảng 3.9. Khả năng phát sinh bào tử nấm I. tenuipes trên các môi trường lỏng .48 Hình 3.10. Khả năng phát sinh bào tử nấm I. tenuipes trên các môi trường lỏng .49 Bảng 3.10. Mối quan hệ giữa sinh khối nấm I. tenuipes và thể tích môi trường còn lại theo thời gian theo dõi 50 Bảng 3.11. Sinh trưởng của nấm I. tenuipes trên môi trường rắn .53 vi Hình 3.11. Sinh trưởng của nấm I. tenuipes trên môi trường rắn 53 Bảng 3.12. Khả năng phát sinh bào tử của nấm I. tenuipes trên môi trường rắn .55 Hình 3.12. Khả năng phát sinh bào tử của nấm I. tenuipes trên môi trường rắn 56 Bảng 3.13. Hiệu lực phòng trừ trên nhộng sâu khoang của nấm Isaria tenuipes ở các nồng độ bào tử khác nhau 56 Hình 3.13. Hiệu lực phòng trừ trên nhộng sâu khoang của nấm Isaria tenuipes ở các nồng độ bào tử khác nhau 57 Bảng 3.14. Diễn biến số lượng nhộng sâu khoang mọc nấm Isaria tenuipes theo thời gian xử lý 58 Hình 3.14. Diễn biến số lượng nhộng sâu khoang mọc nấm Isaria tenuipes theo thời gian xử lý 59 vii MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Isaria tenuipes là giai đoạn vô tính của nấm Codyceps takaomontana. Các nghiên cứu đã cho thấy, Isaria tenuipes là một nấm ký sinh côn trùng có nhiều hoạt chất sinh học có giá trị cao. Các hoạt chất sinh học có giá trị dược lý rất lớn, được ứng dụng trong y - dược để chữa bệnh và làm thực phẩm chức năng nhằm nâng cao sức khỏe cho con người. Đặc biệt, các bệnh về ung thư - một trong những căn bệnh nan y của con loài người hiện nay. Do đó, nhu cầu về sử dụng nấm Isaria tenuipes trên thị trường là rất lớn. Các sản phẩm sản xuất từ Isaria tenuipes rất đa dạng về chủng loại, từ dạng thực phẩm chức năng cho đến thuốc viên nang. Ngoài ra, nấm Isaria tenuipes còn được coi là tác nhân kiểm soát sinh học. Trong tự nhiên, từ các mẫu nấm Isaria tenuipes thu thập được cho thấy chúng thường ký sinh trên giai đoạn nhộng của nhiều loại côn trùng thuộc bộ cánh vảy (Lepidopera) và chúng được xác định là nguồn gây bệnh phổ biến cho các côn trùng thuộc bộ này. Các chế phẩm từ nấm Isaria tenuipes được ứng dụng để phòng trừ trên các đối tượng sâu hại cây trồng như: Các loài sâu thuộc bộ cánh vảy, rệp trắng hại rau. Kết quả cho thấy, chế phẩm hiệu lực phòng trừ đạt hiệu quả cao đối với sâu hại, không gây ảnh hưởng xấu đến sinh thái môi trường như thảm thực vật, các loài sinh vật khác và con người. Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã và đang nhân nuôi thành công nấm Isaria tenuipes trong điều kiện nhân tạo ở quy mô thủ công và công nghiệp nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu cho sản xuất thuốc trong y - dược và làm thực phẩm chức năng. Trong đó, Trung Quốc là nước có quy mô sản xuất lớn nhất. Việt Nam có vị trí địa lý nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có nguồn nấm ký sinh côn trùng có tính đa dạng sinh học rất lớn. Trên các địa điểm thu thập mẫu nấm ký sinh côn trùng ở các vùng sinh thái khác nhau như vườn Quốc gia Pù Mát, Pù Huống (Trần Ngọc Lân, 2008), Vườn Quốc gia 1