1 bộ giáo dục và đào tạo Trờng Đại học Vinh ---------***--------- trần thị thu huyền tách và xác định hàm lợng cloramphenicol trong mẫu thức ăn nuôi tôm Chuyên ngành: hoá vô cơ Mã số : 60. 44. 25 Luận văn thạc sĩ hoá học Ngồi hớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hoa Du vinh - 2008 2 Mục lục Trang Lời cảm ơn . Danh mục các ký hiệu và chữ cái viết tắt .2 Đặt vấn đề 3 Chng 1. Tổng quan .6 1.1. Phơng pháp sc ký lng cao áp 6 1.1.1.Nguyên lý .6 1.1.2.Các dạng sắc ký lỏng hiệu năng cao 7 1.1.3.Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao .8 1.2.Cloramphenicol .11 1.2.1. Cu to v tính ch t 11 1.2.2. iu ch v ng dng 15 1.2.3. Tác động của Cloramphenicol đối với con ngời và thủy sản nuôi .16 1.2.4. Cloramphenicol trong thc phm .17 1.2.5. Các phng pháp phân tích Cloramphenicol 18 Chng 2. K thut thc nghim .26 2.1. Hoá cht, thit b, dng c thí nghim 26 2.2. K thut sc ký lng cao áp vi thit b HPLC 27 2.3. K thut chun b mu .28 Chng 3. Kt qu v th o lun 31 3.1. Các thí nghiệm nh tính ca Cloramphenicol 31 3.2. Tách v xác nh hàm lợng Cloramphenicol trên thit b HPLC 31 3.2.1. nh hng ca tc dòng .31 3.2.2. nh hng ca th nh ph n dung dch pha ng .32 3.2.3. nh hng ca nhit ct tách .32 3.2.4. nh hng ca phng pháp x lý mu 33 3.2.5. Kt qu xác nh Cloramphenicol trong mu thc n nuôi tôm 33 Chơng 4: Kết luận và đề xuất 37 Tài liệu tham khảo 38 Phụ lục .42 3 danh mục Các ký hiệu và chữ cái viết tắt CAP :Cloramphenicol CAP-TMS :cloramphenicoltrimetylsilyl CODEX : Uỷ ban tiêu chuẩn hoá thực phẩm quốc tế FDA : Food and Drug Administrantion( Cục quản lý Thực phẩm và Dợc phẩm Mỹ). GC: Sắc ký khí GC-MS: Sắc ký khí khối phổ HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao HSTH: Hiệu suất thu hồi HSTHTB: Hiệu suất thu hồi trung bình KTSVQN:Kỹ thuật sóng vuông quét nhanh LOD: Giới hạn phát hiện LOQ: Giới hạn định lợng / giới hạn xác định MeOH: Metanol MS: Sắc ký khối phổ MSTFA: N-metyl-N(trimetyl silyl) trifluoro axetamit tt/tt: thể tích/thể tích kl/tt: khối lợng/thể tích 4 đặt vấn đề Trớc đòi hỏi ngày càng cao về lơng thực và thực phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu dùng của con ngời trên thế giới ngày một gia tăng, con ngời đứng trớc một thử thách lớn là phải bằng mọi cách tăng năng suất, sản lợng cây trồng và vật nuôi nhng vẫn giữ đợc môi trờng trong sạch, cân bằng sinh thái. Để đạt đợc mục đích trên, con ngời phải tăng cờng áp dụng các tiến bộ khoa học kĩ thuật vào sản xuất nh tạo ra giống cây trồng cho năng suất cao, ngắn ngày, chống chịu đợc sâu bệnh; tạo ra giống vật nuôi có sức đề kháng cao, phát triển nhanh. Việc sử dụng thuốc kháng sinh cho thủy sản đợc coi là một vũ khí có hiệu quả cao của con ngời trong việc phòng chống dịch hại bảo vệ vật nuôi trớc sự phát triển nhanh chóng của nhiều loại bệnh nguy hiểm với tốc độ lây lan nghiêm trọng. Bên cạnh u điểm là bảo vệ vật nuôi trớc sự tấn công của dịch bệnh, kháng sinh còn gây ra nhiều tác động khác nh gây ô nhiễm môi trờng, gây độc cho ngời và sinh vật xung quanh hồ nuôi, làm tăng chi phí sản xuất, và nhất là để lại tồn d trong thủy hải sản gây ảnh hởng đến chất lợng sản phẩm cũng nh sức khỏe của ngời tiêu dùng. Tác động tiêu cực của thuốc kháng sinh càng trở nên nghiêm trọng nếu con ngời sử dụng không đúng yêu cầu kĩ thuật hay quá lạm dụng thuốc kháng sinh. An toàn thực phẩm đóng vai trò quan trọng trong chiến lợc bảo vệ sức khỏe con khỏe. Việc dảm bảo vệ sinh, an toàn thực phẩm không những làm giảm bệnh tật, tăng cờng sức lao động mà còn góp phần phát triển kinh tế, văn hóa xã hội, giữ uy tín thơng hiệu sản phẩm hàng hóa xuất khẩu, uy tín quốc gia, thể hiện sự quan tâm của chính phủ đối với ngời dân. Thực phẩm an toàn là những thực phẩm không chứa tồn d hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, với các loại hóa chất đợc phép sử dụng thì lợng tồn d không đợc vợt quá mức cho phép, không chứa nấm mốc, mầm bệnh, vi sinh vật, kim loại nặng gây ảnh hởng đến sức khỏe con ngời. 5 Tồn d hóa chất, kháng sinh trong thực phẩm đã gây ra nhiều hậu quả xấu cho sức khỏe con ngời, môi trờng sinh thái, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Theo tống kê của bộ y tế, từ năm 1997 đến 2000, riêng các vụ ngộ độc thực phẩm phải đi cấp cứu là 1391 vụ, gây ngộ độc cấp tính 25.509 ngời trong đó 217 ngời chết. Năm 2001 đã xảy ra 227 vụ ngộ độc thực phẩm (có 30 vụ ngộ độc hàng loạt, bình quân trên 30 ngời/vụ) với tổng số 3814 ngời bị ngộ độc trong đó 63 ngời tử vong. Các vụ ngộ độc do hóa chất nguyên nhân chủ yếu là do hóa chất bảo vệ thực vật, thuốc chuột trong rau còn d và kháng sinh tồn d trong thủy hải sản. Tôm là một loại vật nuôi có giá trị kinh tế cao và có giá trị xuất khẩu lớn nhng d lợng kháng sinh có trong tôm là một yếu tố hạn chế giá trị của lọai thủy sản này.Vấn đề d lợng kháng sinh đã ảnh hởng đến uy tín và chất lợng của tôm xuất khẩu Việt Nam làm giảm thị phần xuất khẩu tôm Việt Nam sang thị trờng các nớc nhất là các thị trờng khó tính va có sự kiểm định nghiêm ngặt nh Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản. Đã có những lô hàng xuất khẩu bị trả về do tồn d kháng sinh cao hơn mức cho phép. Hiện nay Việt Nam cha có chơng trình quốc gia kiểm soát d lợng kháng sinh trên thủy sản nuôi, trong khi đó nhiều nớc trong khu vực và trên thế giới đều đang áp dụng thành công chơng trình này. Cloramphenicol là một loại kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng và khả năng phân tán tốt vào mô cơ thể. Cloramphenicol bị lạm dụng cho vào thức ăn gia súc, thức ăn thủy sản, thuốc thú y. Cloramphenicol đi vào cơ thể con ngời bằng con đờng ăn uống. Việc sử dụng kháng sinh này bị giới hạn vì tiềm năng gây thiếu máu bất sản. Chơng trình kiểm soát d lợng hóa chất độc hại trong thủy sản nuôi khuyến cáo cloramphenicol ảnh hởng đến hệ thống miễn dịch và ngộ độc, gây ung th. Vì thế FDA,CODEX khuyến nghị cloramphenicol không đựơc phép tồn d trong thực phẩm. 6 Tồn d cloramphenicol trong tôm có nguyên nhân chủ yếu từ nguồn thức ăn nuôi tôm đặc biệt là thức ăn của tôm con chứa lợng cloramphenicol tơng đối lớn do tôm con là đối tợng dễ bị nhiễm bệnh. Việc xác định hàm lợng cloramphenicol trong mẫu thức ăn thủy sản cụ thể là thức ăn nuôi tôm đóng vai trò quan trong việc kiểm soát d lợng kháng sinh này trong thực phẩm nhất là thực phẩm xuất khẩu. Với lý do trên tôi chọn đề tài luận văn là: Nghiên cứu xác định hàm lợng cloramphenicol trong mẫu thức ăn nuôi tôm . Nội dung chính của luận văn này nhằm giải quyết các nhiệm vụ sau: -Nghiên cứu các tính chất hoá học, vật lý và phơng pháp định tính cloramphenicol. -Nghiên cứu quy trình chiết pha rắn để làm sạch và làm giàu cloramphenicol trong mẫu thức ăn nuôi tôm. -Nghiên cứu quy trình định lợng cloramphenicol bằng phơng pháp HPLC. 7 chơng 1: tổng quan 1.1 Phơng pháp sắc ký lỏnG 1.1.1 Nguyên lý: Sắc kí lỏng hiệu năng cao là một phơng pháp phân tích dựa trên nguyên tắc Hoá lí (hấp thụ và nhả hấp thụ liên tục chất hấp thụ) và dựa vào sự hỗ trợ của các thiết bị dựa trên nguyên tắc quang điện để phát hiện ra nồng độ của chất phân tích. Hiện tại, ở Việt Nam, tính tới thời điểm này HPLC là một phơng pháp phân tích phổ biến của các phòng thí nghiệm hoá, phòng thí nghiệm hoá cho các chuyên ngành dợc phẩm và mỹ phẩm. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph- HLPC) phát triển rất nhanh từ những năm 1960. Việc sử dụng các chất nhồi có kích thớc nhỏ (5-10àm) làm cho hiệu quả tách của phơng pháp này tốt hơn so với phơng pháp lỏng cổ điển. Có thể nói một cách đơn giản HPLC là một sắc ký cột (column chromatograph) đi kèm với một máy dò tìm (detector) nhạy để có thể pháp hiện đợc các chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký. Với những tiến bộ kĩ thuật về cột, máy dò tìm (detector) đã chuyển sắc ký cột thành phơng pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao. Loại này cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao lên khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lu lợng vài mililit/phút qua cột tách. Lợng mẫu phân tích bằng HPLC chỉ cần khoảng 20àl. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có khả năng tách các hợp chất đặc thù nh: - Các hợp chất cao phân tử và ion thuộc các đối tợng nghiên cứu y học, sinh học 8 Các hợp chất tự nhiên không bền. Các hợp chất kém bền nhiệt, các chất dễ nổ. Các hợp chất trên gồm có: nucleotit, axit amin, đờng, polisacarit, sắc tố thực vật, axit hữu cơ, lipit không phân cực và phân cực, chất màu, dợc phẩm, chất hoạt động bề mặt, vitamin, kháng sinh, Điều khác biệt giữa HPLC và GC là trong phơng pháp HPLC, mẫu chỉ cần làm hoà tan mà không cần làm bay hơi, do đó HPLC có thể phân tích đợc các chất mà không sợ gây ra sự phân hủy nhiệt trong quá trình phân tích. 1.1.2. Các dạng sắc ký lỏng hiệu năng cao: a. Dạng trao đổi ion: Pha tĩnh rắn (IEC) chứa các nhựa trao đổi ion dới dạng bột mịn thờng là các chất hữu cơ mang các nhóm hoạt động khác nhau: cation để tách các kim loại kiềm và kiềm thổ, amonium, các amin anion, để tách các anion vô cơ, phosphate hữu cơ.pha động thờng là dung dịch nớc. b. Dạng HPLC phân bố hiệu suất cao: Sử dụng các pha tĩnh và pha động có độ phân cực khác nhau. Nếu pha tĩnh không phân cực trong khi pha động phân cực thì đợc gọi là dạng sắc ký đảo pha (Reverse Phase chromatography) và dạng này có thể tách đợc các thành phần không phân cực nh các hydrocacbon có phân tử khối lớn hơn 1000, các vitamin tan trong dầu, anthraquinon, Dạng sắc ký pha thuận có thể tách các hợp chất có ancol, các amin, Gồm hai loại: sắc kí lỏng-lỏng và sắc kí pha liên kết -Sắc kí lỏng-lỏng(LLC): pha tĩnh là chất lỏng đợc bao trên bề mặt của các hạt chất mang,tức là đựơc hấp phụ trên chất mang. -Sắc kí pha liên kết(BPC): pha tĩnh đợc gắn hóa học với chất mang tạo ra liên kết siloxan nối nhóm cơ silic với silicagen. 9 c. Sắc kí hấp phụ hiệu suất cao(sắc kí lỏng-rắn LSC) Pha tĩnh là chất rắn mà trên bề mặt có chứa các nhóm hidroxyl phân cực pha động là một dung môi không phân cực. d.Sắc kí lỏng hiệu suất cao trên gel(sắc kí loại cỡ SEC) Phơng pháp này đợc ứng dụng chủ yếu cho các chất có phân tử lợng lớn. Chất nhồi cho SEC là những hạt xốp của silicagel hay các polime có kích thớc nhỏ(khoảng 10àm). Pha tĩnh là dung môi nàm trong các lỗ xốp của hạt, pha động là dung môi chảy giữa các hạt. Chỉ những phân tử nhỏ mới khuyếch tán vào lớp xốp, khi rửa giải các phân tử sẽ lần lợt ra theo cỡ từ lớn đến nhỏ. 1.1.3.Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Máy HPLC gồm có các bộ phận chính nh sau: Hệ thống cung cấp dung môi. Bơm cao áp và bộ trộn dung môi. Hệ thống đa mẫu vào cột. Cột sắc ký. Detectơ. Hệ thống ghi nhận tín hiệu và xử lí kết quả. 10 - Sơ đồ nguyên tắc của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao nh sau: 1 - Bình chứa dung môi; 2 - Bơm cao áp; 3 - Bộ bơm mẫu; 4 - Cột sắc ký; 5 - Detector; 6 - máy ghi tín hiệu. a. Hệ thống cung cấp dung môi và bơm cao áp: +Bình chứa dung môi: Bình chứa bằng thuỷ tinh, đôi khi làm bằng thép không gỉ, trong phơng pháp rửa giải thông thờng chỉ cần một bình chứa dung môi, trong phơng pháp rửa giải gradien thờng dùng 2,3,4 bình chứa các dung môi khác nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp của các loại dung môi trên trộn lẫn với nhau theo tỉ lệ đã đợc xác định. Cần loại các hạt và các khí hoà tan trong dung môi. +Hệ thống bơm: Dung môi của pha động đợc bơm cao áp hút đẩy pha động vào cột với áp suất khoảng 300 atm, lu lợng dới 4,0ml/phút. Lu lợng và áp lực bơm có ảnh h- ởng lớn đến các peak sắc ký. Bơm dùng trong phơng pháp phải tạo đợc áp suất cao khoảng 250-500 atm với lu lợng từ 0,1 đến 10ml/phút. Bơm phải trơ với dung môi và khi bơm pha