Lời cảm ơn Trong quá trình thực hiện đề tài này, tôi đã nhận đợc sự giúp đỡ quý báu, sự chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, gia đình, bạn bè. Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Nguyễn D- ơng Tuệ, ngời thầy đã luôn tận tình hớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu hoàn thành đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Di truyền - Vi sinh - Phơng pháp giảng dạy, các giáo viên phụ trách, các kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng nh sự hớng dẫn, giúp dỡ và đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn hỗ trợ thiết thực cho tôi cả về tinh thần, vật chất và công sức để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài. Trong quá trình thực hiện đề tài, do thời gian và kinh nghiệm còn hạn chế nên đề tài không tránh khỏi những thiếu sót về nội dung và hình thức, rất mong nhận đợc sự góp ý của các thầy, cô giáo, bạn bè để đề tài đ- ợc hoàn thiện hơn. Vinh, tháng 5 năm 2011 Sinh viên Mai Thị Phơng 1 Mở đầu 1. Lý do chọn đề tài Amylaza là enzim xúc tác thuỷ phân tinh bột và các polyose tơng tự nh dextrin, glicogen .(Windish và Mhatre, 1965). Nhóm enzim này ngày càng đợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp bánh mì, thực phẩm, dệt và giấy .(Pandey và cộng sự, 2000) chiếm khoảng 25% nguồn enzim trên thị tr- ờng, enzim amylaza gần nh đã thay thế cho công nghiệp thuỷ phân tinh bột bằng phơng pháp hoá học (Pandey và cộng sự, 2000). Trong hệ enzim này, - amylaza là enzim xúc tác sự thuỷ phân liên kết - 1,4 - glucozit nội mạch, sản phẩm thuỷ phân tinh bột chủ yếu là các dextrin phân tử thấp không cho phản ứng màu với iôt và một ít maltose. Đây là nhóm enzim tơng đối bền vững với các tác dụng của nhiệt, đặc biệt - amylaza của vi khuẩn có tính bền nhiệt cao, chúng có thể giữ đợc hoạt tính ở 70 - 90 o C [12]. Nhờ đặc tính này mà - amylaza của vi khuẩn đợc dùng dịch hoá tinh bột, làm giảm độ nhớt của dịch hồ, đợc dùng trong sản xuất đờng mật ngô và sôcôla, trong sản xuất bia, sản xuất dextrin với dịch đờng để sản xuất thức ăn giành cho ngời già và trẻ nhỏ, dùng để sản xuất nớc quả và đợc sử dụng rộng rãi trong y học. Trong công nghệ đờng hóa tinh bột thay malt để sản xuất rợu, bia, mạch nha, bánh kẹo Qua nhiều công trình nghiên cứu, nhiều chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp amylaza có ý nghĩa trong công nghiệp đã đợc tuyển chọn nh Bacillus subtilis, Bacillus licheni formis, Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus oryzae [12]. Theo mô tả trong khoá phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis là một loài thuộc chi Bacillus thuộc họ Bacillacaea. Bacillus subtilis là trực khuẩn gram dơng có kích thớc (2 - 3) * (0,7 - 0,8) micromet, nội bào 2 tử ở trung tâm có kích thớc 1,5 - 1,8 * 0,8 micromet, ở điều kiện 100 o C bào tử của Bacillus subtilis chịu đợc 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hoá chất và tia bức xạ. Bacillus gồm nhiều chủng nh: subtilis I - 168, DB 110,trong đó các chủng Bacillus subtilis đợc sử dụng nhiều nhất vì đã đợc nghiên cứu tơng đối đầy đủ về đặc tính sinh lý, sinh hoá và di truyền với toàn bộ genome đã đợc xác định. So với E.coli, Bacillus subtilis là vi khuẩn gram dơng sinh bào tử không gây bệnh và không chứa độc tố. Tuy nhiên chúng có nhợc điểm là: Plasmit tái tổ hợp chứa ADN ngoại lai và thiếu bền vững nên việc biểu hiện trên Bacillus subtilis th- ờng yêu cầu tái tổ hợp vào NST. Do đó, để khảo sát đặc tính một enzim mới ngời ta thờng lựa chọn biểu hiện trên E.coli trớc sau đó khi sản xuất prôtêin l- ợng lớn thì chuyển sang hệ thống biểu hiện của Bacillus subtilis. Sử dụng amylaza của Bacillus subtilis là cần thiết vì: - Vi khuẩn sinh trởng, phân bào nhanh (20 - 60 phút/thế hệ) chứng tỏ khả năng tổng hợp enzim rất lớn. - Có thể nuôi cấy và thu nhận enzim ở bất kể thời điểm nào. - Enzim có hoạt tính mạnh hơn enzim ở động vật, thực vật. - Thay thế malt (phải nhập nội từ ngoài vào) tốn kém. - Có thể điều khiển và tối u hóa công nghệ đờng hóa. Đặc biệt vi khuẩn này hiện nay đợc sử dụng nhiều trên thị trờng ở Mỹ, Pháp, Đức và tại thành phố Hồ Chí Minh - Việt Nam cũng có hãng liên doanh với Mỹ sản xuất sinh khối vi khuẩn phục vụ công nghệ lên men, xử lý môi trờng. Vì vậy chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu đề tài: Tìm hiểu hoạt tính enzim amilaza ở vi khuẩnBacillus subtilis để hiểu rõ hơn về nó cũng nh các ứng dụng trong đời sống. 2. Mục tiêu của đề tài 3 Do thấy đợc vai trò quan trọng của enzim amilaza ở Bacillus subtilis nên tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm: - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn. - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hởng đến sự sinh trởng của vi khuẩn. - Thử nghiệm khả năng biến đổi của enzim lên cơ chất. - Tìm các điều kiện tối thích cho sự hoạt động của enzim từ đó sản xuất sinh khối ứng dụng vào thực tiễn. - Rèn luyện cho bản thân một số kỹ năng làm thí nghiệm đồng thời làm quen với phơng pháp nghiên cứu khoa học. 3. Nhiệm vụ của đề tài Để đạt đợc mục tiêu trên, nhiệm vụ của đề tài này gồm: - Thu thập xử lý và bảo quản mẫu. - Pha chế môi trờng nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis thuần khiết. -Làm các thí nghiệm về ảnh hởng của một số yếu tố môi trờng đến hoạt tính enzim từ đó tìm ra điều kiện tối u để sử dụng có hiệu quả nhất. -Khả dĩ ứng dụng enzim trong thực tiễn đời sống. Chơng I Tổng quan tài liệu 1.1. Giới thiệu chung về enzim 1.1.1. Định nghĩa 4 Enzim là hợp chất tự nhiên có khả năng xúc tác trong các phản ứng sinh hóa. Enzim có hoạt tính xúc tác sinh học. Các enzim xúc tác cho hơn 400 phản ứng hoá học khác nhau, đảm bảo cho các quá trình chuyển hoá các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ cao nhịp nhàng, cân đối theo những chiều hớng xác định. Nhờ enzim mà đảm bảo cho sự trao đổi thờng xuyên của cơ thể sống hoặc tạo ra nhiều sản phẩm trong công nghệ. Enzim có bản chất là protein và ARN vì từ năm 2000, Cech. T và năm 2005 Lilley D đã cho thấy một số phân tử ARN cũng có khả năng xúc tác. Đó chính là enzim Ribozyme xúc tác chuyển pro. ARN thành mARN. Enzim vi sinh vật Ngời ta có thể thu nhận enzim từ các nguồn khác nhau nh từ động vật, thực vật, vi sinh vật. Tuy nhiên so với enzim động vật, thực vật thì enzim vi sinh vật là nguồn enzim phong phú nhất, nó có ở hầu hết các loài vi sinh vật nh nấm mốc, vi khuẩn và một số loài nấm men. Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzim ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính nh sau: - Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật. - Chu kỳ sinh trởng của vi sinh vật ngắn 6 - 100 giờ nên có thể thu hoạch nhiều lần trong năm đặc biệt ở vi khuẩn thời gian thế hệ ngắn nên khả năng tổng hợp enzim rất lớn. - Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzim dễ dàng theo hớng có lợi (định hớng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi). - Giá thành tơng đối thấp vì môi trờng nuôi cấy tơng đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất. Tuy nhiên trong một số trờng hợp cần lu ý khả năng sinh độc tố nên phải phân lập chủng thích hợp. 5 Để sản xuất chế phẩm enzim, ngời ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hớng có lợi nhất , chỉ tổng hợp u thế một loại enzim nhất định cần thiết nào đó. Vai trò của enzim vi sinh vật Enzim có ở động vật, thực vật, vi sinh vật nhng ở vi sinh vật u thế hơn. Nó sinh sản, phân bào rất nhanh, đặc biệt ở vi khuẩn E.coli chỉ 20 60 phút một thế hệ. Đáng chú ý là vi khuẩn có cả enzim nội bào và ngoại bào nên đợc ứng dụng nhiều trong công nghệ - Enzim ngoại bào: Là những chất hoạt động ở bên ngoài tế bào. Hầu hết những chất có khối lợng phân tử lớn không thể xuyên qua màng tế bào bởi vậy những thực phẩm, khoáng chất thô sơ nh polisaccharic, lipid và protein cần làm thoái hóa thành những phân tử có trọng lợng phân tử thấp tr- ớc khi chúng chuyển vào tế bào. Vì những phản ứng liên quan với nhau, enzim ngoại bào chủ yếu là enzim thủy phân khử những khoáng chất có khối lợng phân tử cao vào những khối xây dựng của chúng bằng cách tạo những khối phân tử ngậm nớc. Điều này giúp phóng thích những phân tử nhỏ hơn, có thể đợc vận chuyển vào tế bào và tiêu hóa. - Enzim nội bào: bên trrong tế bào và chịu trách nhiệm chính tổng hợp những điều kiện tất yếu về chất nguyên sinh và tạo năng lợng tế bào từ sự tiêu hóa khoáng chất. Khả năng những chất dinh dỡng thấm qua màng tế bào chỉ ra sự có mặt của nhiều nội tế bào có khả năng biến đổi những chất hóa học thành những khoáng chất cơ bản. Sự biến đổi này cần thiết cho sự tồn tại lâu dài và chức năng của tế bào và nó là nền tảng cho các chuyển hóa của tế bào. Nh một kết quả của quá trình chuyển hóa, sản phẩm của quá trình chuyển hóa đợc hình thành và đào thải khỏi tế bào vào môi trờng. Sự phân tích những sản phẩm cuối cùng không chỉ giúp cho sự xác định hệ thống enzim của loài mà còn định danh, phân tách và phân loại vi khuẩn. 6 Chọn vi khuẩn Bacillus subtilis là loại đang đợc chú ý đặc biệt để sản xuất enzim 1.1.2. Đặc tính xúc tác của enzim: Enzim có các đặc tính chung nh sau: + Enzim đợc tạo ra trong tế bào vi sinh vật: quá trình tổng hợp enzim rất phức tạp và đợc kiểm soát chặt chẽ. + Enzim tham gia phản ứng cả khi ở trong tế bào sống và cả khi tách ra khỏi cơ thể sống. + Enzim tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hoà. Vì trong quá trình sống của tế bào, enzim đợc tổng hợp và hoạt động trong điều kiện nhiệt độ của tế bào và nhiệt độ cơ thể. Nhiệt độ của tế bào và nhiệt độ cơ thể thờng thấp (khoảng 30-40 0 C) + Enzim có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lợng dự trữ trong các hợp chất hoá học. Quá trình này đợc thực hiện theo chuỗi phản ứng đợc xúc tác bởi 1 loại enzim, cuối cùng tạo thành CO 2 , H 2 O, một số chất khác và giải phóng năng lợng. Trong một chuỗi phản ứng, sản phẩm của phản ứng trớc là cơ chất cho phản ứng sau + Enzim có thể thực hiện một phản ứng. Các phản ứng này xảy ra ngoài tế bào. + Phản ứng enzim là phản ứng tiêu hao năng lợng rất ít. Trong khi đó các phản ứng hoá học đợc xúc tác bởi các chất xúc tác hoá học đòi hỏi năng lợng rất lớn. + Enzim chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen quyết định tổng hợp ra một loại enzim, mỗi một enzim quyết định một phản ứng sinh hoá. Gen quyết định bản chất sinh học và bản chất hoá học của enzim. 7 + Enzim có thể hoà tan trong nớc, trong dung dịch muối loãng nhng không tan trong các dung môi không phân cực. Dung dịch enzim có tính chất của dung dịch keo a nớc. Khi hoà tan enzim vào nớc, các phân tử lỡng cực n- ớc sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzim tạo thành lớp vỏ hidrat. Lợng nớc hidrat khá lớn và có vai trò quan trọng trong các phản ứng sinh hoá. + Enzim dễ bị kết tủa bởi các yếu tố vật lý và các yếu tố hoá học vốn làm kết tủa protein. + Apoenzim quyết định tính đặc hiệu cao của enzim và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzim. + Coenzim quyết định kiểu phản ứng mà enzim xúc tác, trực tiếp tham gia trong phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzim đối với các yếu tố gây biến tính. Từ đó ta thấy xúc tác enzim u thế hơn so với xúc tác hóa học. 1.1.3. Các nhân tố ảnh hởng tới hoạt tính enzim + Nhiệt độ: tốc độ của phản ứng enzim chịu ảnh hởng của nhiệt độ, mỗi enzim có một nhiệt độ tối u tại nhiệt độ này enzim có hoạt tính cao nhất. Ví dụ: đa số các enzim ở tế bào của cơ thể ngời hoạt động tối u ở khoảng nhiệt độ nhng enzim của vi khuẩn suối nớc nóng lại hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ cao. Khi cha đạt đến nhiệt độ tối u của enzim thì sự gia tăng nhiệt độ sẽ làm tăng tốc độ phản ứng của enzim,tuy nhiên khi đã qua nhiệt độ tối u của enzim thì sự gia tăng nhiệt độ sẽ làm giảm tốc độ phản ứng và có thể enzim bị mất hoàn toàn hoạt tính. + Độ pH: mỗi enzim có pH tối u riêng. Đa số enzim có pH tối u từ 6 - 8, có enzim hoạt động tối u trong môi trờng axit nh pepsin hoạt động tối u ở pH = 2. + Nồng độ cơ chất: Với một lợng enzim xác định nếu tăng dần lợng cơ chất trong dung dịch thì thoạt đầu hoạt tính của enzim tăng dần nhng đến một 8 lúc nào đó thì sự gia tăng về nồng độ cơ chất cũng không làm tăng hoạt tính của enzim. Đó là vì tất cả các trung tâm hoạt động của enzim đã đợc bão hoà bởi cơ chất. + Nồng độ enzim: với một lợng cơ chất xác định nồng độ enzim càng cao thì tốc độ xẩy ra phản ứng càng nhanh. Tế bào có thể điều hoà tốc độ chuyển hoá vật chất bằng việc tăng giảm nồng độ enzim trong tế bào. + Chất hoạt hóa và ức chế: Hoạt tính enzim có thể thay đổi dới tác dụng của các chất hoạt hóa và ức chế. Và do đó ta có thể sử dụng các chất hoạt hóa hay ức chế để điều khiển phản ứng enzim. Nguyên nhân của hiện t- ợng này có dính líu tới trung tâm hoạt động của enzim và cấu trúc phân tử (nhất là cấu trúc bậc 3) của protein - enzim. 1.1.4. Vai trò của enzim trong quá trình chuyển hoá vật chất Nhờ enzim mà các quá trình sinh hoá trong cơ thể sống xảy ra rất nhanh với tốc độ lớn trong điều kiện sinh lý bình thờng. Khi có enzim xúc tác, tốc độ của một phản ứng có thể tăng hàng triệu lần. Nếu tế bào không có các enzim thì các hoạt động sống không thể duy trì đợc vì tốc độ của các phản ứng sinh hoá xảy ra quá chậm. Tế bào có thể tự điều chỉnh quá trình chuyển hoá vật chất để thích ứng với môi trờng bằng cách điều chỉnh hoạt tính của các loại enzim. Một trong các cách điều chỉnh hoạt tính của enzim khá hiệu quả và nhanh chóng là sử dụng các chất ức chế hoặc hoạt hoá enzim. Các chất ức chế đặc hiệu khi liên kết với enzim sẽ làm biến đổi cấu hình của enzim làm cho enzim không thể liên kết đợc với cơ chất, ngợc lại các chất hoạt hoá khi liên kết với enzim sẽ làm tăng hoạt tính của enzim. ức chế ngợc là kiểu điều hoà trong đó sản phẩm của con đờng chuyển hoá quay lại tác động nh một chất ức chế, làm bất hoạt enzim xúc tác cho phản ứng ở đầu của con đờng chuyển hoá. Khi một enzim nào đó trong tế bào không đợc tổng hợp hoặc bị bất hoạt thì không những sản phẩm không đợc tạo thành mà cơ chất của enzim 9 đó cũng sẽ bị tích luỹ lại gây độc cho tế bào hoặc có thể đợc chuyển hoá theo con đờng phụ thành các chất độc gây nên các triệu chứng bệnh lý. Các bệnh nh vậy ở ngời đợc gọi là bệnh rối loạn chuyển hoá. 1.1.5. Cơ chế tác dụng của enzim Bản chất của các phản ứng enzim khi có sự tham gia xúc tác của các enzim, các cơ chất sẽ đợc hoạt hoá mạnh, làm thay đổi tính chất hoá học của cơ chất kết quả sau phản ứng tạo ra sản phẩm của phản ứng. Dới tác dụng của enzim cơ chất không chỉ thay đổi cấu trúc hoá học mà còn thay đổi tính chất hoá học. Quá trình xúc tác enzim xảy ra theo 3 giai đoạn : + Giai đoạn 1 : Enzim kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzim-cơ chất. Phức hệ này thờng không bền. Phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi ít năng lợng. + Giai đoạn 2 : Khi cơ chất tạo phức với enzim sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết. Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm. + Giai đoạn 3 : Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng đợc tạo thành và tách ra khỏi enzim. Sơ đồ tổng kết quá trình xúc tác của enzim : E + S < => ES < => E + P 1.1.6. Tính đặc hiệu của enzim: 10 . khối vi khuẩn phục vụ công nghệ lên men, xử lý môi trờng. Vì vậy chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu đề tài: Tìm hiểu hoạt tính enzim amilaza ở vi khuẩnBacillus. nhiệt độ này enzim có hoạt tính cao nhất. Ví dụ: đa số các enzim ở tế bào của cơ thể ngời hoạt động tối u ở khoảng nhiệt độ nhng enzim của vi khuẩn suối