Trờng Đại Häc Vinh Khoa Sinh Học Góp phần hoàn tiện quy trình nhân nhanh giống hoa đồng tiền gerber gerbera c«ng nghƯ nu«i cÊy m« invitro Luận văn tốt nghiệp đại học Ngành cử nhân s ph¹m sinh häc Ngêi thùc hiện: Trần Nữ Thanh Xuân Ngời hớng dẫn: Th.S Mai Văn Chung Vinh , 2006 Lêi cảm ơn Để hoàn thành đề tài này, nỗ lực thân, xin chân thành cảm ơn bảo, giúp đỡ tận tình Thầy giáo, Th.S Mai Văn Chung, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào, ý kiến đóng góp quý báu thầy giáo, cô giáo tổ môn Sinh lý- Sinh hoá thực vật, tạo điều kiện ủng hộ khoa, cán phòng thí nghiệmNuôi cấy mô, tế bào thực vật giúp ®ì, cung cÊp t liƯu, mÉu vËt cđa nh©n d©n huyện Nghĩa Đàn LÇn tham gia nghiên cứu khoa học không tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đợc ý kiến đóng góp thầy cô bạn bè để đề tài nghiên cứu khoa học đợc hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn Tác giả Những chữ viết tắt sử dụng luận văn NCM - TB : Nuôi cấy mô - tế bào CNSH : Công nghệ sinh học IAA : Axit - indol axetic NAA : Axxit - naphtyl axetic IBA : BA/BAP : benzyl adenin(6 benzyl amino purin) GA : Gibberelin K : Kinetin MS : Murashige – Skoog 1962 Ppm : part per million(phÇn triƯu) mM : milimol Mở đầu Lý chọn đề tài Ngày nay, sử dụng hoa sinh hoạt công tác hàng ngày đà trở thành thói quan tót,tạo nên nét văn hoá thởng ngoạn, giải trí nh tiêu dùng Hoa đà trở nên quen thuộc cần thiết sống hàng ngày ngời.Để đáp ứng đợc nhu cầu tiêu thụ hoa ngày tăng, nhiều giống hoa, loại hoa mới, có giá trị thẩm mĩ, giá trị kinh tế giá trị văn hoá đợc đa vào sản xuất quy mô lớn, dùng nhiều phơng thức tạo giống khác nhau, đó, Nuôi cấy mô - tế bào thực vật invitro đợc đánh giá phơng pháp tiên tiến, u việt Trong loại hoa đợc a chuộng giới nay, Đồng tiền(gerbera) đợc coi 10 loài hoa ®Đp nhÊt, chØ xÕp sau hoa hång, lay ¬n, cóc, cẩm chớng Đồng tiền loại hoa có nhiều u điểm bật: hoa to, cánh dày, xếp nhiều tầng, màu sắc phong phú, dáng hoa đẹp, cho suất cao, nên ngày đợc ngời tiêu dùng a chuộng Song khó khăn sản xuất hoa đồng tiền nguồn giống cung cấp cho trình trồng trọt chủ yếu tách thân, sinh trởng mạnh giai đoạn đầu nhng sau sinh trởng chậm, nhanh già cỗi, suất thấp, chất lợng sản lợng hoa không cao, không ổn định Bên cạnh đó,bằng phơng pháp tách thân, số lợng giống lần tạo không nhiều,do không đủ đáp ứng nhu cầu thị trờng sản xuất.[ ] Phơng pháp nhân giống vô tính invitro đà bổ sung cho kĩ thuật tạo giống cách tách thân sản xuất hoa đồng tiền ngày đ- ợc ý phát triển kỹ thuật nhân giống vô tính invitro cho phép sản xuất giống đòng tiền khoẻ mạnh, bệnh, có đọ đồng cao va chất lợng tốt Hiện Việt Nam đà có nhiều nghiên cứu quy trình nhân giống vô tính loại hoa đa đợc công bố ứng dụng.[ ].Tuy nhiên việc tiếp tục hoàn thiện nh đề xuất quy trình kỹ thuật cho giống hoa thực cần thiết Từ sở lý luận thực tiễn đó, thực đề tài Góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống hoa đồng tiền - gerbera c«ng nghƯ nu«i cÊy m« - invitro” Mơc đích đề tài áp dụng sở khoa học công nghệ vi nhân giống để nhân nhanh giống hoa đồng tiền từ mô phân sinh đỉnh cây, nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính giống hoa đồng tiền này, Nội dung đề tài nghiên cứu tim điều kiện nuôi cấy invitro thích hợp giai đoạn xử lý mẫu, nhân chồi invitro, rễ, tạo hoàn chØnh, hn lun thÝch nghi,…tõ ®ã ®tõ ®ã ®Ị xt quy trình nhân giống hoàn thiện hoa đồng tiền CHƯƠNG I: tổng quan tài liệu 1.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô invitro[ ] 1.1.1 Tính toàn tế bào thực vật Theo Habertland, tế bào thể sinh vật mang toàn lợng thông tin di truyền cần thiết đủ sinh vật Khi gặp điều kiện thuận lợi, tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh Tính toàn tế bào mà Habertland đa sở lý luận Nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho đến ngời đà hoàn toàn chứng minh đợc khả tái sinh mọt thể thực vật từ tế bào riêng rẽ Quá trình phát sinh hình thái nuôi cấy mô tế bào thực vật invitro thực chất kết phân hoá phản phân hoá tế bào[] 1.1.2 Phân hoá phản phân hoá tế bào Tất loại tế bào thể sinh vật bắt nguồn t tế bào phôi sinh, từ tế bào phôi sinh chuyển thành tế bào mô chuyên hoá đảm nhận chức khác Đó gọi sơ phân hoá tế bào Tuy nhiên trờng hợp cần thiết diều kiện định, tế bào mô chuyên hoá lại trở dạng tế bào phôi sinh lại có khả phân chia mạnh mẽ Quá trình đợc gọi phản phân hoá tế bào.[] 1.1.3 Môi trêng nu«i cÊy [ ] M«i trêng nu«i cÊy điều kiện đặc biệt cần thiết , định đến phân hoá tế bào quan nuôi cấy Môi trờng nuôi cấy phải có đầy đủ chất dinh dỡng cần thiết cho phân chia, phân hoá tế bào nh hco trình sinh trởng bình thờng Thành phần môi trờng nuôi cấy thay đổi tuỳ đối tợng nuôi cấy, phận nuôi cấy, tuỳ thuộc giai đoạn phát triển mục đích nuôi cấy: tạo rễ, tạo mầm, tái sinh hay muốn giữ trạng thái mô sẹo Tuy nhiên tất môi trờng nuôi cấy có thành phần : _ Nguồn carbon (thờng đờng) _ Khoáng đa lợng _ Khoáng vi lợng _ Vitamin _ ChÊt ®iỊu tiÕt sinh trëng Cã thĨ bổ sung thêm số hợp chất : axit amin, EDTA, níc dõa hay dÞch chiÕt nÊm men, a Đờng Đờng nguồn cung cấp carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối mô nuôi cấy nhân tạo Các loại đờng thờng dùng saccaroze va glucoze nhng saccaroze đợc dùng phổ biến Nồng độ đờng thay đổi từ 1-6%, thông dụng 2-3 % b Các khoáng đa lợng + Nitơ : Cây sử dụng đợc dới hai dạng NH4+ NO3- với tỷ lệ tuỳ loại tuỳ giai đoạn phát triển Nitrat đợc cung cấp chủ yếu dới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 NH4NO3, (NH4)2SO4 số trờng hợp dới dạng ure Nồng độ môi trờng khoảng 3-6 mM + Lu huúnh ( S ) Lu huúnh đợc hấp thu dới dạng SO42-; SO32- SO2 thờng gây độc cho Lu huỳnh tham gia vào cấu trúc số loại axit amin tham gia vào trình khử, tổng hợp chất hữu tơng ứng, ngoàI ra, lu huỳnh điều tiết trình trao đổi chất lợng, xây dựng chất kháng sinh, vitamin, +Kali ( K ) Cung cÊp cho c©y dới dạng KNO3, KCl, KH2PO4, với nồng độ biến thiên từ 2-25 mM, trung bình khoảng 10 mM + Magie ( Mg ) Mg đợc cung cấp cho dới dạng MgSO4.7H2O, nồng độ 0,5-3 mM Trong tế bào, Mg có vai trò xúc tác cho nhiều hệ enzim quan trọng, cầu nối enzim chất, làm tăng hoạt tính enzim, Mg ảnh hởng đến trình hấp thu, đồng hoá P, O2, + S¾t ( Fe ) Trong môi trờng cổ điển, dùng Fe dới dạng FeCl2.FeCl3.6H2O; FeSO4.7H2O; Fe2(SO4)2; Fe(C4H4O), cßn hiƯn dïng Fe ë dạng EDTA, dạng Fe không bị kết tủa mà giải phóng dần môi trờng tuỳ nhu cầu cđa m« thùc vËt +Canxi ( Ca ) Đợc cung cấp cho dới dạng Ca(NO3).4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O, nồng độ 1-3,5 mM c Các khoáng vi lợng Các nguyên tố vi lợng đợc tìm thấy dới dạng phức chất hữu cơ- khoáng, phức chất tham gia vào phản ứng mà thân chất thành phần tham gia đợc Đặc biệt vai trò nguyên tố vi lợng quan trọng tham gia vào cấu trúc enzim tham gia vào tất trìng sinh tổng hợp chuyển hoá chất tế bào, nói nguyên tố vi lợng sở sống Bảng : Một số nguyên tố vi lợng thờng dùng [] Nguyên tố Dạng sử dụng Nång ®é (mM) Mn MnSO4.4H2O 15-100 B 6-100 Zn H3PO3 15-30 Cu ZnSO4.7H2O 0,04-0,08 Mo CuSO4.5H2O (NH4)6Mo7O24.4H2O 0,07-1 Co NaMoO4.2H2O 0,1-0,4 I CoCl2.6H2O 2,5-20 KI d C¸c vitamin Mặc dù tất loại mô tế bào thực vật nuôi cấy invitro có khả tổng hợp đợc hầu hết vitamin nhng thợng không đủ lợng, cần phải bổ sung thêm từ bên vào, vitamin nhóm B Bảng : Một số vitamin thờng đợc dùng môi trờng nuôi cÊy [ ] Tªn vitamin Nång ®é sư dơng (mg/l) Myo_Inositol 100 Axit nicotinic ( niaxin ) 0,5-1 Pyridoxine HCl ( vitamin B6 ) 0,05-0,5 Thiamine HCl ( B1 ) 10-50 Pandothenat canxi 1-5 Riboflavin ( B2 ) 1-5 Biotin 0,1-1 Axit folic 0,1-1 Các vitamin thờng đợc pha hỗn hợp dung dịch mẹ có nồng độ cao gấp 500 đến 1000 lần so với dung dịch lam việc, cần giữ điều kiện lạnh dới 0oC để tránh nấm khuẩn nhiễm tạp e Các chất điều khiÓn sinh trëng B¶ng : Mét sè chÊt ®iỊu khiĨn sinh trëng thêng dïng [ ] Tªn chÊt sinh trëng Nång ®é sư dơng ( mg/l ) 2,4 D [dichlorophenoxy axetic] 0,2-5 _NAA [ naphtylaxetic axit] 0,1-5 5-20 _NAA [ indol axetic axit] 1-5 IBA [ indol butyric axit] 0,1-2 0,1-2 Kinetin [6 finfurylaminopurine] 0,1-2 BA [ 6_BAP ][ benzyl amino purine] 0,1-2 2_iP [ N6 _ Dimetylallylaminopurine] GA [ Gibberelic axit ] Thờng pha dung dịch mẹ chất sinh trởng có nồng độ cao gấp 1000 lần so với dung dịch làm việc g Các hỗn hợp chất tự nhiên + Nớc dừa: Từ 1941, nớc dừa đà đợc sử dụng để nuôi phôi Daruta năm 1949 nuôi mô Daucus Lợng nớc dừa dùng môi trờng lớn, 10-20 % thể tích môi trờng + Dịch chiết nấm men Là chế phẩm thờng dùng nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật 1934,White lần đà nuôi cấy thành công rễ cà chua ống nghiệm kéo dài vô thời hạn dịch chiết nấm men Thành phàn hoá học không rõ, chủ yếu chứa đờng, axit nucleic, axit amin, vitamin, auxin khoáng.Lợng thờng dùng 1g/l môi trờng h Một số môi trờng nuôi cấy + Môi trờng Murashige-Skoog( MS ): Là loại môi trờng đợc sử dụng phổ biến nuôi cấy mô, tế bào thực vật Thích hợp cho Một mầm Hai mầm + Môi trờng Anderson : Chuyên dùng cho việc nhân giống vô tính họ Rhododendron ( Mẫu đơn ) số thân gỗ loại nhỏ Nồng độ loại muối khoáng dùng môi trờng thấp, nửa so với môi trờng MS + Môi trờng Gamborg: Đợc thử nghiệm lần cho đậu tơng nh- ng đợc dùng nhiều nhân giống vô tính, đặc biệt nuôi tách tế bào trần + M«i trêng nu«i cÊy phong lan ( P ) + M«i trêng N6 _ Chu : HiƯu nuôi cấy bao phấn lúa hoà thảo Bảng : Thành phần số loại môi trờng thông dụng dùng Nuôi cấy mô_ Tế bào thực vật[] STT Thành phần MS A G P N6 Muèi kho¸ng NH4NO3 1650 400 134 825 - (NH4)2SO4 - - - - 463 H3PO3 6,2 6,2 3,1 3,1 1,6 CaCl2 322,2 332,2 113,2 166 125,3 Ca3(PO4)2 - - - - - CuSO4.5H2O 0,025 0,025 0,025 0,0125 - CoCl2.6H2O 0,025 0,025 0,025 0,0125 - Natri tactrat.2H2O 37,26 74,5 37,26 37,26 37,26 S¾t tactrat.2H2O - - - - - 10 FeSO4.7H2O 27,8 55,7 27,8 27,8 27,8 11 MgSO4 180,7 180,7 122,1 90,35 90,35 12 MnSO4 16,9 16,9 10 8,45 33,3 13 Na2(NH4)4Mo7O24.H2O 0,25 0,25 0,25 0,125 - 14 KI 0,83 0,3 0,75 0,415 0,8 15 KNO3 1900 480 2500 950 2830 16 K2HPO4 - 330 130,5 85,5 400 17 KCl - - - - - 18 ZnSO4.7H2O 8,6 8,6 2,0 5,3 1,5 Chất hữu vitamin 19 Glyxin - - - 20 Vitamin B1 0,4 0,4 10 1 21 Bios I 100 100 100 100 100 22 Vitamin B6 0,5 - 0,5 0,5 23 Axit nicotinic 0,5 - 0,5 0,5 24 MES - - - 1000 - 25 Pepton - - - 2000 - Các chất điều tiết sinh tr- ëng 26 Adenin hemisulphat - - - - - 27 6_Dimetylallylaminopurine - 80 - - - 28 2,4_ Dichlophenoxy axetic axit - - - 29 _indolaxetic axit - - - - - 30 _ Naphthalen axetic axit - - - 0,5 - 31 6_Benzyl amino purine - 0,5 - - 32 Saccaroza (g/l) 30 30 30 20 20 33 Agar ( g/l ) 8 - PH 5,6 5,8 5,8 5,8 5,8 1.2 Quy tr×nh chung cđa NCM_TB invitro VỊ nguyên tắc, quy trình nhân giống vô tính invitro gồm giai đoạn [] 1.2.1 Giai đoạn vào mẫu cấy gây Đây giai đoạn quan trọng, đóng vai trò định toàn quy trình Mục đích giai đoạn phải tạo đợc nguyên liệu thực vật vô trùng để đa vào nuôi cấy invitro Yêu câù giai đoạn là: - Tû lƯ nhiƠm thÊp - Tû lƯ sèng cao - Tốc độ sinh trởng cao Kết giai đoạn phụ thuộc vào cách lấy mẫu, quan trọng đỉnh sinh trởng, chồi nách, sau hoa tự đoạn thân, cành,mảnh lá, rễ,từ đĐể khử trùng mô, ngời ta thờng dùng số hoá chất: HgCl2, CoCL2, NaOCl, H2O2, tuú thuéc vµo tõng loại mô thực vậtmà lựa chọn nồng độ thời gian xử lý hoá chất thích hợp Đối với mẫu dễ bị hoá nâu nuôi cấy, bổ sung vào môi trờng than hoạt tính ngâm mẫu trớc cấy vào hỗn hợp axit ascobic axit citric nồng độ 25-150 mg/l Chọn phơng pháp khử trùng đa lại tỷ lệ sống cao, chọn môi tr- êng dinh dìng thÝch hỵp sÏ gióp cho mÉu đạt tốc độ sinh trởng nhanh Môi trờng nuôi cấy thờng dùng môi trờng MS 1.2.2 Giai đoạn nhân nhanh 10 _ Các giai đoạn: khử trùng, vào mẫu, nhân nhanh, rễ, tạo hoàn chỉnh đợc thực Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô_ tế bào thực vật Khoa sinh học, trờng Đại học Vinh _ Các nghiên cứu khả thích ứng invitro với điều kiện môi trờng bình thờng đợc tiến hành nhà lới _ Koa Sinh học_ trờng Đại học Vinh 2.1.3 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 3-2005 đến tháng 4-2006 2.2 Nội dung nghiên cứu Nội dung nghiên cứu đề tài là: ảnh hởng thời gian, nồng độ, hoá chất khử trùng đến tiêu: tỷ lệ sèng, tû lƯ nhiƠm, tû lƯ bËt chåi cđa mÉu ảnh hởng BAP đến phát triển chồi invitro trình nhân nhanh ảnh hởng - NAA đến rễ chồi invitro ảnh hởng giá thể đến sức sống chồi exvitro 2.3 Phơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Vật liệu khởi đầu Vật liệu khởi đầu,tức giống để từ lấy chồi, đỉnh sinh tr- ởng, đồng tiền trởng thành đợc trồng nhà lới Các muốn đ- ợc sử dụng làm vật liệu khởi đầu phải đạt đợc yêu cầu hình thái, phải khoẻ mạnh, không mang mầm bệnh, phát triển tốt Mẫu đợc lấy vào ngày nắng , trớc ngày ma để hạn chế nhiễm khuẩn 2.3.2 Giai đoạn khử trùng mô nuôi cấy_ vào mẫu Bộ phận đợc dùng đỉnh sinh trởng Đồng tiền có đỉnh sinh trởng yếu, ít, khó tách, mặt khác có nhiều lông tơ nơi có nhiều vi khuẩn, việc vào mẫu gặp nhiều khó khăn, hoá chất thời gian xử lý phải vừa đủ để diệt hết vi khuẩn, nấm mà không ảnh hởng đến đỉnh sinh trởng Các công thức đ- ỵc sư dơng lµ :  CT M1 : Cån 700 (3 phót) + H2O2 15% (10 phót) + HgCl2 0,1% (10 phót)  CT M2 : Cån 700 (3 phót) + H2O2 15% (15 phót) + HgCl2 0,1% (10 phót)  CT M3 : Cån 700 (3 phót) + H2O2 15% (15 phót) + HgCl2 0,1% (15 phót) 14  CT M4 : NaOCl 10% (10 phót) + NaOCl 5% (8 phót) + NaOCl 1% (3 phót) Môi trờng đợc sử dụng để vào mẫu cấy gây MS + 50g/l saccaroza + 6g/l agar + 2mg/l BAP + 10% nớc dừa giai đoạn , số đợc đánh giá là: _ Tỷ lệ c©y chÕt _ Tû lƯ c©y bËt chåi _ Tû lệ đợc sử dụng để cấy chuyển Thời gian nghiên cứu giai đoạn 2-3 tuần 2.3.3 Giai đoạn nhân nhanh Giai đoạn bố trí công thức nuôi dỡng chồi đồng tiền có chất điều tiết sinh trởng khác với nồng độ khác công thức dinh dỡng giống để nghiên cứu ảnh hởng chất điều tiÕt sinh trëng ®Õn sù sinh trëng cđa chåi invitro Các chất điều tiết sinh trởng nồng độ công thức nh sau: CT N1: 1,5 mg/l BAP CT N2 : 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l IAA CT N3 : 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l IAA CT N4 : 1,5 mg/l BAP + 1,0 mg/l IAA CT N5 : 5mg/l K + 0,5 mg/l IAA CT N6 : 5mg/l K + 1,0 mg/l IAA M«i trêng dinh dỡng để nghiên cứu giai đoạn là: MS + 50g/l saccaroza + 6g/l agar + 10% níc dõa Các tiêu cần nghiên cứu là: _ Số lá/ _ Số chồi / sau thời gian nuôi cấy _ Hệ số nhân nhanh _ Hình thái Thời gian nghiên cứu giai đoạn tuần 2.3.4 Giai đoạn rễ- tạo hoàn chỉnh Các công thức nghiên cứu giai đoạn rễ bao gồm thành phần môi trờng MS + 50g/l saccaroza + 6g/l agar + than ho¹t tÝnh + 10% nớc dừa; môi trờng khác nồng ®é c¸c chÊt ®iỊu tiÕt sinh trëng bỉ sung ®Ĩ nghiên cứu ảnh hởng chất điều tiết sinh trëng ®Õn sù rƠ cđa chåi invitro 15 C¸c chất điều tiết sinh trởng nồng độ sử dụng nh sau: CT R1: 0,5mg/l NAA CT R2: 1,0mg/l NAA CT R3: 1,5mg/l NAA C¸c chØ tiêu cần theo dõi: _ Số rễ _ Chiều dài rễ _ Hình thái cây, rễ Điều kiện nuôi cấy:ở ba giâi đoạn cấy gây, nhân nhanh rễ chồi invitro đợc nuôi cấy điều kiện ổn định nhiệt độ, ánh sáng: -Nhiệt độ: 250C 20C -¸nh s¸ng: 2000-2500 lux -Thêi gian chiếu sáng 12h/ngày 2.3.5 Giai đoạn huấn luyện giai đoạn bố trí exvitro vào giá thể khác điều kiện nuôi cấy để nghiên cứu ảnh hởng giá thể khác đến tỷ lệ sức sống exvitro Các công thức giá thể: CT H1 : C¸t CT H2 : TrÊu hun CT H3 : C¸t + trÊu hun §iỊu kiƯn hn lun: _ §é Èm kh«ng khÝ: 80-85% _ Độ ẩm giá thể: 65-80% _ Nguồn khoáng bổ sung dung dịch NPK với tỷ lệ 1:1:1 với nồng độ 2% phun trực tiếp lên Các tiêu theo dõi: _ Tỷ lệ sống thích nghi với môi trờng _ Các tiêu hình thái: chiều cao cây, số lá/cây, màu sắc lá, phát triển rễ, 2.3.6 Phơng pháp xử lý số liệu Số liệu đợc xử lý toán thống kê: - Giá trị trung bình: 16 X =  ∑xi (i lµ sè lÇn thùc hiƯn thÝ nghiƯm) n - Độ lệch chuẩn: Chơng III: kết nghiên cứu bàn luận 2.3 Kết nghiên cứu giai đoạn vào mẫu Chồi đỉnh đồng tiền đợc lấy từ giống trồng nhà lới vào thời điểm râm mát, trớc ngày ma để hạn chế nhiễm khuẩn Mẫu đợc làm sơ chất tẩy rửa, rửa dới vòi nớc ch¶y Sau xư lý b»ng cån 700 thêi gian phút, mẫu đợc khử trùng loại hoá chất có nồng độ thời gian khác Kết giai đoạn khử trùng mẫu cấy gây thể bảng Bảng 1: Kết xử lý mẫu đồng tiền Công Hoá Nồng độ Thêi gian Tæng Sè mÉu Sè mÉu thøc chÊt xư lý sè nhiƠm bËt mÉu chÕt(%) chåi(%) M1 H2O2 15% 10 30 28(93,3%) 2(6,7%) HgCl2 0,1% 10phót 17(57%) 13(43%) M2 H2O2 15% 15 30 HgCl2 0,1% 10phót M3 H2O2 15% 15 30 25(83,3%) 5(16,7%) HgCl2 0,1% 15phót 25(83,3%) 5(16,7%) M4 NaOCl 10% 10 30 17 NaOCl 5% 8phót NaOCl 1% Môi trờng đợc sử dụng để cấy gây môi trêng dinh dìng MS + 50g/l sacaroza + 6g/l ©gar + 2mg/l BAP KÕt qu¶ b¶ng cho thÊy: _C«ng thøc khư trïng M1 : H2O2 15 % 10 vµ HgCl2 0,1% 10 phót, 30 mÉu xö lý, chØ cã mÉu sèng( chiếm tỷ lệ 6,7 %), 28 mẫu lại ®Ịu chÕt vµ nhiƠm nÊm,trong sè 28 mÉu cã 20 mÉu nhiƠm nÊm vµ vi khn ( chiÕm tû lƯ 66,7 % ) chøng tá hiƯu qu¶ khư trïng cđa công thức yếu, không loại trừ hết nấm vi khuẩn mẫu cấy gây _ C«ng thøc khư trïng M2 : H2O2 15% 15 phút HgCl2 0,1 % 10 phút, kết thông kê cho thấy công thức cho kết khö trïng tèt nhÊt Trong 30 mÉu xö lý cã 13 mẫu sống, nảy chồi đẹp(43%), công thức cho tû lÖ mÉu bËt chåi cao nhÊt(22 mÉu bËt chåi chiÕm tû lƯ 73%), ®ã cã nhiỊu mÉu bËt 2-3 chåi.Sè mÉu nhiƠm vµ chÕt chiÕm tû lƯ 57%, số mẫu chết mẫu chiếm tỷ lệ 27%, mẫu bị nhiễm(30%) _ Công thøc khư trïng M3: H2O2 15% 15 vµ HgCl2 0,1 % 15 phót, kÕt qu¶ cho thÊy 30 mẫu cấy gây có 10 mẫu nảy chồi ( 33,3%)trong có mẫu không bị nhiễm (16,7%) ,20 mẫu bị hoá nâu sau 2-3 ngày nuôi cấy(66,7%).Nh tăng thời gian xử lý HgCl2 có ảnh h- ởng xấu đến chồi invitro,làm chết mẫu cấy gây, thpì gian mẫu nảy chồi chậm ( sau tuần có dấu hiệu nảy chồi).Xử lý HgCl2 lâu ảnh hởng không tốt đến chất lợng mẫu cấy gây _ Công thức khử trùng M4 : Thay ®ỉi ho¸ chÊt khư trïng b»ng NaOCl , víi lần khử trùng với nồng độ thời gian xử lý giảm dần , sau lần xử lý mẫu đợc rửa bóc dần lớp bao bọc phía ngoài, sau lần xử lý lại đỉnh sinh trởng tiến hành cấy vào môi trờng.Kết cho thấy 30 mẫu xử lý có mẫu sống phát triển tốt(16,7%), số mÉu n¶y chåi nhiỊu(17 mÉu chiÕm tû lƯ 57%) nhng ®Ịu bÞ nhiƠm nÊm, vi khn.Nh vËy NaOCl cã tÝnh khử trùng yếu, không đủ để tiêu diệt hết vi khuẩn nấm mẫu cấy gây, không thích hợp để khử trùng chồi đỉnh đồng tiÒn NhËn xÐt: 18 Khi khư trïng b»ng H2O215% 10 vµ HgCl2 0,1 % 10 phút cho kết không tốt, nhng tăng nồng độ H2O2 15% lên 15 phút cho kết tốt hẳn,chứng tỏ H2O2 thích hợp để khử trùng chồi đỉnh đồng tiền,còn tăng thêi gian xư lý HgCl2 0,1 % lªn 15 co nhiều mẫu chết, xử lý HgCl2 lâu ảnh hởng không tốt đén sức sống khả phát triển chồi invitro tinh khử trùng HgCl2 mạnh làm chết chồi Qua công thức khử trùng với hoá chất khử trùng có nồng độ thời gian khác nhau, nhận thấy công thức khử trùng cho hiệu tốt công thức khử trïng kÐp: H2O2 15% 15 HgCl2 0,1 % 10 phút 3.2 Kết nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh giai đoạn này, nghiên cứu ảnh hởng loại chất điều tiết sinh trởng khác đến tỷ lệ phát triển chồi invitro thông qua hệ số nhân nhanh hình thái chåi invitro sè chåi sau thêi gian nu«i cÊy HƯ sè nh©n chåi = số chồi ban đầu Môi trờng nuôi giai đoạn nhân nhanh môi trowngf dinh dỡng MS + 50g/l saccaroza + 6g/l agar + 10% nớc dừa Các công thức khác loại chất điều tiết sinh trởng nồng độ chúng.Kết nghiên cứu giai đoạn đợc thể bảng 2: Bảng : ảnh hởng chất điều tiết sinh trởng lên phát triên chồi invitro Công Nồng độ Số Sau tuÇn Sau tuÇn Sau tuÇn thøc chÊt §TST mÉu Sè HÖ sè Sè HÖ sè Sè HÖ sè chåi nh©n chåi nh©n chåi nh©n chåi chåi chåi N1 1,5mg/lBAP 50 90 1,80 120 2,4 140 2,80 N2 1,5mg/ 50 71 1,42 102 2,04 136 2,72 lBAP+0,2mg/ lIAA 19 N3 1,5mg/ 50 90 1,80 131 2,62 150 3,00 lBAP+0,5mg/ lIAA 50 78 1,56 104 2,08 114 2,28 N4 1,5mg/ lBAP+1,0mg/ lIAA 50 87 1,74 112 2,24 128 2,56 N5 5mg/lK +0,5mg/lIAA N6 5mg/lK 50 103 2,06 110 2,20 114 2,28 +1,0mg/lIAA Nhận xét _ Công thức nhân nhanh N1: Chỉ dùng BAP 1,5 mg/l chất ĐTST , kết cho thấy chịu ảnh hởng tốt từ BAP, thể hệ số nhân chồi tơng đối cao, tăng qua thời điểm nghiên cứu.BAP loại chất kÝch thÝch sù ph©n chia chåi, ngän, thÝ nghiƯm víi công thức N1 cho thấy chồi đỉnh đồng tiền đà sinh trởng phát triển tốt môi trờng có BAP _ Công thức nhân nhanh N2: Kết hợp BAP 1,5mg/l 0,2 mg/l IAA nhằm nghiên cứu ảnh hởng tổng hợp BAP IAA đến phát sinh phát triển chồi invitro.Kết cho thấy tuần đầu, chồi phát triển chậm, hệ số nhân chồi đạt 1,42, thấp tất môi trờng bố trí.Sang tuần 3, hệ số nhân chồi đà tăng đáng kể (2,04 2,73 ), chứng tỏ IAA đà có tác dụng tốt phát triển chồi invitro,song ảnh hởng thể sau thời gian định _ Công thức nhân nhanh N3: 1,5mg/l BAP IAA 0,5 mg/l, kết cho thấy công thức đạt kết tốt nhất, hệ số nhân chồi cao với giá trị 1,81; 2,63; 3,00 tơng ứng với thời điểm nghiên cứu, hệ số nhân chồi hệ số nhân chồi cao so với công thức lại.Chứng tỏ việc tăng nồng độ IAA môi trờng phù hợp phát triển chồi invitro _ Công thức nhân nhanh N4: 1,5 mg/l BAP 1,0 mg/l IAA.Kết cho thấy việc tiếp tục tăng lợng IAA công thức lại ảnh hởng không tốt đến phát triển chồi invitro, hệ số nhân chồi thấp so với công thức N3( qua thời điểm thống kê 1,56; 2,08; 2,28) Nh nồng độ 1,0 mgl/l IAA đợc đánh giá không cao, không thích hợp để sử dụng môi trờng nhân nhanh chồi đồng tiền invitro 20 ... đỉnh cây, nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính giống hoa đồng tiền này, Nội dung đề tài nghiên cứu tim điều kiện nuôi cấy invitro thích hợp giai đoạn xử lý mẫu, nhân chồi invitro,... trình nhân giống hoa đồng tiền - gerbera b»ng c«ng nghƯ nu«i cÊy m« - invitro” Mục đích đề tài áp dụng sở khoa học công nghệ vi nhân giống để nhân nhanh giống hoa đồng tiền từ mô phân sinh đỉnh... invitro, rễ, tạo hoàn chỉnh, huấn luyện thích nghi,từ đtừ đề xuất quy trình nhân giống hoàn thiện hoa đồng tiền CHƯƠNG I: tổng quan tài liệu 1.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô invitro[ ] 1.1.1