TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA NÔNG LÂM NGƯ -------------- THỰC NGHIỆM KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA Cordyceps sp1. TRÊN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN XỐP VÀ HẠT NGŨ CỐC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY KỸ SƯ NGÀNH: NÔNG HỌC Người thực hiện: Cao Thị Thu Dung Lớp: 45 Nông học Người hướng dẫn: PGS.TS Trần Ngọc Lân VINH - 1.2009 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là hoàn toàn trung thực, có được qua các thí nghiệm do bản thân tiến hành và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan các thí nghiệm để thu thập số liệu trong khóa luận đã được chính bản thân tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi sinh - Công nghệ sinh học Nông nghiệp và phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật, khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Vinh với sự đồng ý và hướng dẫn của PGS TS. Trần Ngọc Lân - giáo viên hướng dẫn và các kỹ thuật viên phụ trách phòng thí nghiệm. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc. Vinh, ngày 12 tháng 12 năm 2008 Tác giả Cao Thị Thu Dung ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình tiến hành làm khóa luận tốt nghiệp ngành kỹ sư Nông học, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía các thầy cô giáo, bạn bè, người thân… Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới PGS TS. Trần Ngọc Lân, người đã dìu dắt và hướng dẫn cho tôi từ những bước đầu tiên làm quen với nghiên cứu khoa học, là người thầy đã rất tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn tôi suốt thời gian làm đề tài khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Bảo vệ thực vật, các giáo viên phụ trách, các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như những sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài. Xin được gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình, họ hàng và tất cả bạn bè, những người đã có sự hỗ trợ thiết thực cho tôi cả về mặt tinh thần, vật chất và công sức để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài khóa luận của mình. Xin chân thành cảm ơn. Vinh, ngày 12 tháng 12 năm 2008 Tác giả Cao Thị Thu Dung iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Bảng chữ cái viết tắt vi Danh mục các bảng số liệu vii Danh mục các hình vẽ, biểu đồ viii MỞ ĐẦU 1 1. Sự cần thiết và ý nghĩa của nghiên cứu ứng dụng Cordyceps 1 2. Mục đích nghiên cứu 3 3. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4 Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Cơ sở khoa học 5 1.1.1. Nấm ký sinh côn trùng 5 1.1.2. Cơ chế tác động của nấm lên cơ thể côn trùng 6 1.1.3. Giả thuyết khoa học 10 1.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng Cordyceps trên thế giới 11 1.2.1. Nghiên cứu các loài nấm ký sinh côn trùng nhóm Cordyceps 11 1.2.2. Các hoạt chất sinh học có trong Cordyceps 12 1.2.3. Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm từ Cordyceps 13 1.3. Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam 16 1.3.1. Nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam 16 1.3.2. Nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng Cordyceps 17 1.4. Nhân nuôi sinh khối nấm ký sinh côn trùng 18 Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Quy trình nghiên cứu 21 2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu 22 2.3. Vật liệu nghiên cứu 22 2.4. Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1. Phương pháp thu thập nấm ký sinh côn trùng 22 2.4.2. Phương pháp phân lập và bảo quản giống 24 2.4.3. Phương pháp xác định số lượng bào tử Cordyceps 27 2.4.4. Môi trường nuôi cấy 29 2.4.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm 31 2.4.6. Phương pháp thu thập số liệu 32 2.5. Phương pháp xử lý số liệu 33 2.6. Trang thiết bị, vật tư, hoá chất 33 2.6.1. Trang thiết bị dùng để thu thập nấm ký sinh côn trùng 33 2.6.2. Trang thiết bị dùng để phân lập và nhân nuôi nấm ký sinh côn trùng 33 iv 2.6.3. Các hoá chất và nguyên liệu để pha chế môi trường 34 2.7. Một số đặc điểm của Vườn Quốc gia Pù Mát 34 Chương III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 3.1. Đặc điểm hình thái nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sp1. 37 3.2. Sự sinh trưởng, phát triển của Cordyceps sp1. trên môi trường PDA 39 3.2.1. Khả năng sinh trưởng, phát triển của Cordyceps sp1. 39 3.2.2. Ảnh hưởng của độ dày môi trường đến sự sinh trưởng, phát triển của Cordyceps sp1. 40 3.2.2.1. Ảnh hưởng của độ dày môi trường đến sự sinh trưởng của Cordyceps sp1. 40 3.2.2.2. Ảnh hưởng của độ dày môi trường đến khả năng phát sinh bào tử của Cordyceps sp1. 42 3.3. Khả năng sinh trưởng, phát triển của Cordyceps sp1. trên môi trường nước đậu nành 43 3.3.1. Ảnh hưởng của độ dày môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cordyceps sp1. 43 3.3.2. Ảnh hưởng của độ dày môi trường đến độ dày của hệ sợi nấm Cordyceps sp1. 45 3.4. Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên môi trường xốp 46 3.4.1. Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên môi trường xốp 46 3.4.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng sinh trưởng của nấm Cordyceps sp1. trên môi trường lên men xốp 47 3.4.3 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng phát sinh bào tử của nấm Cordyceps sp1. trên môi trường lên men xốp 50 3.5. Sự sinh trưởng, phát triển của Cordyceps sp1. trên hạt ngũ cốc 51 3.5.1. Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên hạt ngũ cốc 51 3.5.2. Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên các loại hạt ngũ cốc 52 3.5.3. Khả năng phát sinh bào tử của Cordyceps sp1. trên các loại hạt ngũ cốc 57 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 Kết luận 58 Đề nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung ’ Phút BCCHD Bọ cánh cứng hại dừa BT Bào tử BTTN Bảo tồn thiên nhiên C Các bon C. Cordyceps CT Công thức D x R Dài x Rộng ĐTHT Đông trùng - Hạ thảo EPF Entomology pathogenic fungi (Nấm ký sinh côn trùng) LN Lúa nếp LT Lúa tẻ M.a Metarhizium anisopliae MT Môi trường N Ni tơ NL Ngô lai NN Ngô nếp PDA Potato Dextrose Agar SD Standard Deviation (Độ lệch chuẩn) TB Trung bình TT Thứ tự TTCP Thủ tướng Chính phủ VQG Vườn Quốc gia YD Ý dĩ DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU Bảng Tên bảng Trang vi 3.1 Sự sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps sp1. trên môi trường PDA theo thời gian 39 3.2 Ảnh hưởng của độ dày môi trường lên sự sinh trưởng của nấm Cordyceps sp1. trên môi trường PDA 40 3.3 Nồng độ bào tử của nấm Cordyceps sp1. ở các độ dày môi trường PDA khác nhau 42 3.4 Khả năng sinh trưởng của nấm Cordyceps sp1. trên bề mặt môi trường nước đậu nành ở các mức thể tích khác nhau 44 3.5 Khả năng phát sinh bào tử của nấm Cordyceps sp1. trên các độ dày môi trường nước đậu nành sau 12 ngày nuôi 45 3.6 Khả năng tăng trưởng về độ dày của hệ sợi nấm trên bề mặt môi trường nước đậu nành ở 3 mức thể tích sau 12 ngày nuôi 45 3.7 Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên môi trường lên men xốp 46 3.8 Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên 5 loại môi trường xốp 48 3.9 Nồng độ bào tử của Cordyceps sp1. trong môi trường lên men xốp có các thành phần dinh dưỡng khác nhau 50 3.10 Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên môi trường hạt Ý dĩ 52 3.11 Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên môi trường từ 5 loại hạt ngũ cốc 53 3.12 Nồng độ bào tử của Cordyceps sp1. trong các loại môi trường hạt ngũ cốc 57 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 1.1 Chu trình xâm nhiễm chung của nấm ký sinh côn trùng 6 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 10 2.1 Các ô vuông trên buồng đếm bào tử 28 2.2 Trang thiết bị dùng để thu thập EPF ngoài tự nhiên 33 2.3 Thiết bị dùng để phân lập và nuôi cấy nấm ký sinh côn trùng 33 3.1 Mẫu nấm Cordyceps sp1. 37 vii 3.2 Mẫu Cordyceps sp1. trên môi trường PDA và bào tử quan sát dưới kính hiển vi 38 3.3 Sự sinh trưởng của sợi nấm theo chiều ngang (đường kính) 41 3.4 Sự sinh trưởng của sợi nấm theo chiều cao (độ dày) 41 3.5 Sự sinh trưởng của nấm Cordyceps sp1. trên môi trường PDA 43 3.6 Sự sinh trưởng của nấm Cordyceps sp1. trên bề mặt môi trường lỏng ở các thể tích khác nhau 44 3.7 Môi trường nước đậu nành 45 3.8 Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm trên bề mặt môi trường lên men xốp 48 3.9 Độ ăn sâu của hệ sợi nấm vào trong khối môi trường lên men xốp 48 3.10 Tỷ lệ sợi nấm trên thể tích khối môi trường lên men xốp 48 3.11 Nuôi cấy Cordyceps sp1. trên môi trường lên men xốp 51 3.12 Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm trên bề mặt môi trường hạt ngũ cốc 54 3.13 Độ ăn sâu của hệ sợi nấm vào trong khối môi trường hạt ngũ cốc 54 3.14 Tỷ lệ sợi nấm trên thể tích khối môi trường hạt ngũ cốc 54 3.15 Sự sinh trưởng của nấm Cordyceps sp1. trên 5 loại hạt ngũ cốc 56 MỞ ĐẦU 1. Sự cần thiết và ý nghĩa của nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng Cordyceps Cordyceps là một giống nấm ký sinh côn trùng thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes), bộ Clavicipitales, họ Clavicipitaceae. Tất cả các loài Cordyceps ký sinh chủ yếu trên côn trùng và động vật chân khớp, một số ít ký sinh trên các loài nấm khác. Loài được biết đến nhiều nhất của giống là Cordyceps sinenesis - nấm phát sinh trên sâu bướm thực vật, một thành phần quý giá trong các vị thuốc cổ truyền của Trung Hoa (http://en.wikipedia.org) [61]. Trên thế giới hiện có 400 loài của giống nấm Cordyceps đã được mô tả, trong khi đó ở Trung Quốc đã tìm thấy 60 loài, nhưng cho đến nay mới chỉ tập trung nghiên cứu 2 loài (Cordyceps sinensis (Beck.) Sacc. - Đông trùng Hạ thảo và Cordyceps militaris (L. ex Fr.) Link - Nhộng trùng thảo) (http://www.sgtt.com.vn) [21]. viii Giống nấm Cordyceps là một giống đặc biệt, có nhiều ứng dụng để sản xuất các hoạt chất sinh học, sản xuất thuốc chữa bệnh, các thực phẩm chức năng tăng cường sinh lực của con người. Các nghiên cứu y học và dược học đã chứng minh nấm ký sinh côn trùng loài Cordyceps sinensis (Đông trùng - Hạ thảo) có tới 25 tác dụng về các chức năng và bệnh thuộc thận, huyết áp, tim mạch, miễn dịch, nội tiết tố, ung thư, an thần… (Nguyễn Lân Dũng, 2005) [11]. Các nghiên cứu phân tích hóa sinh cho thấy trong sinh khối (biomass) của nấm ký sinh côn trùng, như Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có 17 axit amin khác nhau, có nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na…), các loại vitamin (như vitamin B12, A, C, B2…) và quan trọng nhất là có nhiều chất hoạt tính sinh học có giá trị dược liệu thần kỳ (như HEAA - Hydroxy ethyl adenosine analogs, cordyceptic acid, cordycepin, adenosine, hydroxyethyl - adenosine,…) [10]. Loài nấm ký sinh côn trùng Cordyceps unilateralis có các dẫn xuất của napthoquinone có hoạt tính sinh học cao như eythrostominone, deoxyerythrostominone, 4 - O - methyl erythrostominone, epierythrostominol, deoxyerythrosstominol và đặc biệt là 3,5 - β - trihydrooxy - 6 - methoxy - 2 - (5 - oxyohexa - 1,3 - dienyl) - 1,4 - naphthoquinone được xem như là chất có khả năng chống lại bệnh sốt rét (malaria) (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2008) [18, tr. 1 - 2]. Việt Nam là một quốc gia có nguồn tài nguyên sinh học đa dạng cao và phong phú. Về thực tiễn (Đề tài B2007 - 27 - 25) cho thấy, ở Vườn Quốc gia Pù Mát nhóm nấm ký sinh côn trùng có tính đa dạng về thành phần và nguồn lợi, có những loài đặc hữu có chứa các hoạt chất sinh học cao thuộc nhóm Cordyceps (Trần Ngọc Lân và cộng sự, 2008) [18]. Đối với Việt Nam, công nghệ nấm ký sinh côn trùng là một lĩnh vực rất mới, đặc biệt đối với các loài nấm ký sinh côn trùng có các hoạt chất sinh học và dùng làm dược liệu. Cho đến nay ở Việt Nam mới chỉ có một số công trình nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng như Beauveria và Metarhizium, trong tự nhiên còn rất nhiều loài nấm ký sinh côn trùng chúng ta chưa được biết đến. Nghiên cứu ứng ix dụng nấm ký sinh côn trùng rất cần những công nghệ như phân lập, phân loại nấm ký sinh côn trùng, chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học cao và công nghệ nhân nuôi trên môi trường lên men rắn và lên men lỏng. Tháng 1 năm 2008, nhóm nghiên cứu của Trung tâm Nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ sinh học Nông nghiệp, trường Đại học Vinh (CRABTA - VU) đã thu thập được trên lớp đất mặt của rừng nguyên sinh thuộc Vườn quốc gia Pù Mát - Nghệ An mẫu nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sp1. ở độ cao 800 - 1000 m so với mực nước biển. Qua nghiên cứu cho thấy rằng, loài Cordyceps sp1. có những điểm giống và cũng có những điểm không giống với loài Cordyceps sinensis (Đông trùng - Hạ thảo) của Trung Quốc. Việc tiến hành thu thập và tìm ra được mẫu nấm Cordyceps sp 1. đã mang đến triển vọng mới, hứa hẹn ở các nghiên cứu một “Đông trùng - Hạ thảo” của Việt Nam. Tuy nhiên, để chứng minh được tác dụng của Cordyceps sp1. thông qua các chất có hoạt tính sinh học cao và đi đến một sự định loại cuối cùng đòi hỏi phải tiến hành rất nhiều nghiên cứu, nhiều phân tích tỉ mỉ. Trong khi đó, sau nhiều đợt thu thập thì mẫu vật Cordyceps sp1. có được vẫn mới chỉ dừng lại ở con số là một mẫu. Chính vì vậy, những nghiên cứu ban đầu nhằm tìm ra phương pháp nhân nhanh sinh khối nấm Cordyceps sp1. để phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn là hết sức cần thiết. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài:“Thực nghiệm khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên môi trường lên men xốp và hạt ngũ cốc”. 2. Mục đích nghiên cứu Đề tài nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps sp1. trên các loại môi trường khác nhau, từ đó tìm ra loại môi trường và phương pháp nhân sinh khối thích hợp nhất để nhân nhanh sinh khối nấm Cordyceps sp1. phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn. 3. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu • Đối tượng nghiên cứu x . 3.5.1. Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên hạt ngũ cốc 51 3.5.2. Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên các loại hạt ngũ cốc 52 3.5.3. Khả năng. Cordyceps sp1. 45 3.4. Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên môi trường xốp 46 3.4.1. Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên môi trường xốp 46