LỜI CAM ĐOAN Thực tập tốt nghiệp là thời gian để người sinh viên có điều kiện rèn luyện tính tự lực, độc lập trong suy nghĩ, bổ sung những kiến thức mới mẻ từ thực tiễn, nâng cao trình độ lý luận chuyên môn. Tiếp tục rèn luyện đạo đức tác phong, quan điểm phục vụ của người cán bộ khoa học kỹ thuật. Để hoàn thành luận văn này tôi xin cam đoan: 1. Trong quá trình nghiên cứu, bản thân luôn nhiệt tình với công việc. 2. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực. 3. Kết quả nghiên cứu của bản thân có được là nhờ sự giúp đỡ tận tình của thầy hướng dẫn PGS.TS Trần Ngọc Lân. 4. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn và các thông tin trich dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc. Vinh, ngày tháng năm Tác giả luận văn Võ Thị Trang 1 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình tiến hành làm khóa luận tốt nghiệp ngành kỹ sư Nông học, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía các thầy cô giáo, bạn bè, người thân… Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới PGS TS. Trần Ngọc Lân, người đã dìu dắt và hướng dẫn cho tôi từ những bước đầu tiên làm quen với nghiên cứu khoa học, là người thầy đã rất tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn tôi suốt thời gian làm đề tài khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Bảo vệ thực vật, các giáo viên phụ trách, các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm đặc biệt là NCS. Nguyễn Thị Thu, KS. Trần Văn Cảnh đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như những sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài. Xin được gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình, họ hàng và tất cả bạn bè, những người đã có sự hỗ trợ thiết thực cho tôi cả về mặt tinh thần, vật chất và công sức để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài khóa luận của mình. Xin chân thành cảm ơn. Vinh, ngày tháng năm Tác giả Lê Thị Thanh Vinh 2 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN . ii BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT . vi DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ . viii MỞ ĐẦU .1 1. Tính cấp thiết của đề tài .1 2. Mục đích nghiên cứu .3 3. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu 3 4. Ý nghĩa thực tiễn và khoa học của đề tài 4 Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Phân loại và lịch sử nghiên cứu nấm Trichoderma .5 1.1.1. Hệ thống phân loại của nấm Trichoderma 5 1.1.2. Lịch sử nghiên cứu Trichoderma .5 1.2. Đặc điểm hình thái và sinh thái của nấm Trichoderma 6 1.2.1. Đặc điểm hình thái .6 1.2.2. Đặc điểm sinh trưởng và hình thành bào tử của Trichoderma 7 1.2.3. Đặc điểm sinh thái của Trichoderma .9 1.2.3.1. Sinh cảnh .9 1.2.3.2 Thông số môi trường 10 1.2.3 3. Đa dạng thể nền .12 1.3. Vai trò của vi nấm Trichoderma 12 1.3.1. Vai trò của nấm Trichoderma trong việc xử lý hạt giống .13 1.3.2. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng và làm phân bón .14 1.3.3. Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen 14 1.3.4 Lương thực và ngành dệt 14 1.4. Tính năng của Trichoderma trong phòng trừ sinh học .15 1.4.1. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma 15 3 1.4.2. Các sản phẩm trao đổi của nấm Trichoderma 15 1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động đối kháng 16 1.5. Nhân nuôi sinh khối vi nấm Trichoderma .17 1.5.1. Dinh dưỡng của vi sinh vật 17 1.5.2. Ứng dụng công nghệ len men bề mặt trong sản xuất sinh khối .19 1.6. Tổng quan tài liệu nghiên cứu 21 1.6.1.Những nghiên cứu trên thế giới 21 1.6.2.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 25 Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28 2.1. Quy trình nghiên cứu .28 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29 2.3. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 29 2.3.1. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu .29 2.3.2. Dụng cụ phục vụ nghiên cứu .29 2.4. Phương pháp tiếp cận trong nghiên cứu vi nấm 29 2.4.1 Tiếp cận công nghệ sinh học hiện đại phù hợp 29 2.4.2. T iếp cận ứng dụng thực tiễn 30 2.5. Phương pháp thu thập và phân lập nấm Trichoderma .31 2.5.1. Phương pháp thu thập 31 2.5.2. Phương pháp phân lập .31 2.6. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm mốc A. Flavus 32 2.7. Phương pháp nhân sinh khối nấm Trichoderma .34 2.7.1. Bố trí thí nghiệm .34 2.7.2. Môi trường PDA và phương pháp cấy nấm từ PDA sang PDA .36 2.7.3. Môi trường lên men lỏng và phương pháp cấy nấm .37 2.7.4. Chuẩn bị môi trường và phương pháp cấy nấm trên môi trường rắn .38 2.7.5. Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu .39 2.7.6. Phương pháp pha loãng nồng độ bào tử .40 4 2.7.7. Phương pháp thu hồi sinh khối bào tử 40 2.8. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 40 2.8.1.Phương pháp thu thập số liệu môi trường rắn: .40 2.8.2. Phương pháp xử lý số liệu 41 Chương III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42 3.1. Thành phần loài và mức độ phổ biến của các loài Trichoderma .42 3.2. Mô tả chủng Trichoderma harzianum Tri.011(1).NL 44 3.3. Khả năng đối kháng của chủng Trichoderma harzianum Tri.0011.NL với A.flavus 46 3.4. Khả năng sinh trưởng của T. harzianum Tri.0011.NL trên các loại môi trường rắn 50 3.4.1. Ảnh hưởng của phương pháp cấy giống đến khả năng phát sinh bào tử của nấm T.harzianum Tri.011(1).NL 50 3.4.2. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất đến khả năng sinh trưởng của T. harzianum Tri.011(1).NL .52 3.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất đến khả năng sinh trưởng của T. harzianum Tri.011(1).NL 54 3.4.4. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng của T. harzianum Tri.011(1).NL .60 3.5. Xây dựng quy trình nhân sinh khối nấm T. harzianum Tri.011(1).NL 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 1. KẾT LUẬN 64 2. KIẾN NGHỊ .65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 5 BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ cái viết tắt Nội dung 2R Đường kính Asp./A. Aspergillus BPSH Biện pháp sinh học BVTV Bảo vệ thực vật M Trung bình PDA Potato Dextrose Agar/ môi trường thạch agar PIMG Percent Inhibition of Mycelial Growth/ Tỷ lệ kìm hãm sự sinh trưởng sợi nấm PTN Phòng thí nghiệm PTSH Phòng trừ sinh học SD Độ lệch chuẩn SSF Solid state fermentation / Lên men trạng thái rắn RH Độ ẩm Tri./T. Trichoderma WA Water agar 6 DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU Bảng 2.1. Thành phần và tỉ lệ các công thức môi trường rắn 35 Bảng 2.2. Thành phần và tỉ lệ công thức môi trường rắn .36 Bảng 2.3. Thành phần và tỷ lệ môi trường PDA .36 Bảng 2.4. Thành phần và tỷ lệ môi trường lỏng 37 Bảng 3.1. Tần suất xuất hiện Trichoderma trên đất ruộng lạc ở Nghệ An 42 Bảng 3.2: Thành phần loài nấm đối kháng Trichoderma trong đất lạc ở Nghệ An . 43 Bảng 3.3. Khả năng đối kháng của các loài Trichoderma đối với chủng A. flavus 46 Bảng 3.4. Khả năng đối kháng của các chủng T. hazianum đối với chủng A. flavus .47 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của phương pháp cấy giống đến khả năng phát sinh bào tử của T. harzianum trên môi trường rắn 51 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất đến độ bao phủ bề mặt môi trường của T. harzianum Tri.011(1).NL 52 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất đến khả năng phát sinh bào tử của T. harzianum Tri.011(1).NL .53 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất đến độ bao phủ bề mặt môi trường của T. harzianum Tri.011(1).NL 54 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất đến khả năng phát sinh bào tử của T. harzianum Tri.011(1).NL 56 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng phát sinh bào tử của T.harzianum .61 7 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 3.1. Bào tử của nấm Trichoderma harzianum Tri.011(1).NL .44 Hình 3.2. Cuống bào tử đính của Trichoderma harzianum Tri.011(1)NL . 44 Hình 3.3 Mặt trước và mặt sau nấm Trichoderma harzianum Tri.011(1)NL trên đĩa petri 45 Hình 3.4. Chỉ số đối kháng của các loài Trichoderma 46 Hình 3.5. Chỉ số đối kháng của các chủng T. harzianum 48 Hình 3.6. Sự đối kháng của chủng T. harzianum Tri.011(1).NL với A. flavus Asp.006.VAĐ 48 Hình 3.7. Sự đối kháng của chủng T. harzianum Tri.038(1).NL với A. flavus Asp.006.VAĐ 49 Hình 3.8. Khả năng phát sinh bào tử trên 2 môi trường giống 51 Hình 3.9. Khả năng phát triển sợi nấm trên bề mặt môi trường có các thành phần khác nhau .53 Hình 3.10. Nồng độ bào tử của T. harzianum Tri.011(1).NL trên các môi trường có các thành phần khác nhau 54 Hình 3.11. Khả năng phát triển sợi nấm của T. harzianum Tri.011(1).NL trên các loại môi trường có tỷ lệ cơ chất khác nhau 55 Hình 3.12. Khả năng phát sinh bào tử của T. harzianum Tri.011(1).NL trên các loại môi trường tỷ lệ cơ chất khác nhau .56 Hình 3.13.Sự phát triển của sợi nấm T.harzianum Tri.011(1).NL sau 3 ngày cấy 59 Hình 3.14. Sự phát triển của sợi nấm T.harzianum Tri.011(1).NL sau 5 ngày cấy 59 Hình 3.15. Sự phát triển của sợi nấm T.harzianum Tri.011(1).NL sau 7 ngày cấy 59 Hình 3.16. Mối tương quan giữa nồng độ bào tử và thời gian nhân nuôi 61 8 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, có khoảng 30% các loài thực vật đã bị phá hủy bởi tác nhân gây bệnh cây trồng (Merih KIVANÇ, 2002) [48] và chúng tiếp tục đe dọa cây trồng trong sản xuất nông nghiệp. Không những thế chúng còn đóng vai trò trực tiếp trong việc phá hủy tài nguyên thiên nhiên trong nông nghiệp. Trong đất, sinh vật gây bệnh đặc biệt là nấm gây thiệt hại nghiêm trọng. Một số cây trồng quan trọng của đất chịu tác nhân gây bệnh như: Aspergillus, Pythium, Phytopthora, Botrytis, Rhizoctonia, Fusarium và Meloidogyne đã lây lan rất nhanh và tác động có hại trên các cây trồng có tầm quan trọng kinh tế. Với sự ra đời của các hợp chất hóa học mà người ta nghĩ rằng đó là một giải pháp lâu dài và đáng tin cậy cho việc phòng trừ các tác nhân gây bệnh trong qua đất truyền qua cây trồng nhưng họ đã nhận ra rằng sử dụng thuốc trừ sâu không an toàn cho môi trường như chất độc gây ra ô nhiễm môi trường và có hại đối với con người (FA. Mohiddin, 2010) [28]. Để kiểm soát một mầm bệnh mục tiêu trong đất bằng thuốc trừ sâu đã làm ảnh hưởng hơn 100 loài sinh vật không phải là mục tiêu (Alabouvette và Couteadier, 1992)[7]. Mặt khác, một số thuốc trừ sâu có hiệu quả đã bị cấm sử dụng trong nông nghiệp. Do đó, để giảm bớt việc sử dụng hóa chất biện pháp sinh học cần được áp dụng và tăng cường. Trong đó, tận dụng khả năng đàn áp (đối kháng) của một số vi sinh vật cần được đánh giá cao để đối kháng lại các tác nhân gây bệnh truyền qua đất đến cây trồng mục tiêu. Như vây được gọi là các tác nhân kiểm soát sinh học (biocontrol) và công thức thương mại của chúng như là thuốc trừ bệnh sinh học (biopesticides). Nghiên cứu gần đây về kiểm soát sinh học đã được thực hiện với phương pháp tiếp cận hệ thống lớn hơn và thiết thực hơn. Nhiều vi sinh vật như nấm, vi khuẩn,… đã được thử nghiệm khả năng đối kháng của chúng để kiểm soát bệnh gây hại cây trồng. Trichoderma nằm trong số loài nấm phân lập từ đất và thường 9 xuyên trong hệ sinh thái gốc của thực vật (Harman và cs., 2004) [33]. Hơn nữa, Trichoderma spp. chia sẻ gần 50% thị trường BCAs nấm. Cho đến nay Trichoderma sp. nằm trong số các tác nhân kiểm soát sinh học được nghiên cứu nhiều nhất trong hơn 80 năm và thương mại trên thị trường như là thuốc trừ bệnh sinh học, phân sinh học và cũng được sử dụng trong cải tạo đất (Harman, 2000; Harman và cs., 2004) [32], [33]. Tùy thuộc vào các chủng, việc sử dụng Trichoderma trong nông nghiệp có thể cung cấp rất nhiều lợi thế: (1) Thiết lập quần thể vùng rễ (ưu thế vùng rễ) cho phép thành lập nhanh chóng trong quần xã ổn định trong vùng rễ, (2) kiểm soát gây bệnh và cạnh tranh của hệ vi khuẩn bằng cách sử dụng nhiều cơ chế, (3) cải thiện sức khỏe cây trồng và (4) kích thích tăng trưởng gốc (Harman và cs., 2004 ). Cây lạc sản xuất củ (quả) lạc, là loại thực phẩm cho dầu quan trọng trong số những cây công nghiệp thực phẩm ngắn ngày không chỉ ở Nghệ An mà cả trên thế giới. Nhưng một bất cập rất đáng quan tâm là việc nhiễm nấm Aspergillus (Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus) sinh độc tố aflatoxin (trước khi thu hoạch và sau khi thu hoạch lạc), một loại độc tố ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người. Nhiều biện pháp được đưa ra để làm giảm thiểu độc tố mà các loại nấm mốc này sinh ra, tuy nhiên bệnh phát sinh từ đất, lan truyền mạnh qua đất, không khí và cả trong nguồn nước. Cho nên đã hạn chế các phương pháp đưa ra như phương pháp hóa học, sử dụng hóa chất bảo quản,… Vì vậy, để kiểm soát loài nấm này, trên thế giới các nhà khoa học đã thành công trong việc sử dụng chủng nấm đối kháng Trichoderma dựa vào các cơ chế ức chế bệnh có thể là competition (cạnh tranh), antibiosis (sự đối kháng) hoặc mycoparasitism (ký sinh nấm) đối với Aspergillus. Mỗi vùng có thể sẽ có những chủng nấm Trichoderma spp. khác nhau với những hiệu quả đối kháng khác nhau được gọi là các chủng bản địa. Các chủng bản địa sẽ thích ứng tốt với điều kiện ở vùng đó và tạo điều kiện cho khả năng đối kháng cao. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Thành phần loài nấm 10