Bài thực hành 1 Rút sắc tố từ lá và thực hiện một số phản ứng lí hoá học của clorophin 1. Nguyên tắc của phương pháp Do có nhân Mg trong vòng pyron mang tính tan trong nước và kết hợp với protein màng, trong khi đó đuôi dài cacbon của gốc rượu phytol lại mang tính kị nước và hướng tới cấu trúc lipit của màng tilacoit, nên phân tử clorophin chủ yếu hoà tan trong dung môi hữu cơ. Tuy nhiên để tách tốt clorophin ra khỏi lá, người ta không dùng ête petrol hay benzen, mà dùng cồn hay axeton pha với một ít nước để tách được hết phân tử clorophin từ lá. Các sắc tố của nhóm carotenoit cũng được tách chiết theo phương pháp này. 2. Đối tượng, hoá chất và dụng cụ thí nghiệm - Lá tươi - Đũa thuỷ tinh - Cồn etilic hoặc axeton 80% - Giá ống nghiệm và các ống nghiệm - Benzen - KOH 20% - KOH 20% - HCL 10% - Axetat đồng - CaCO 3 - Bột thuỷ tinh - Phễu lọc số 3 - Pipet - Kéo - ống nhỏ giọt - Đèn cồn - Giấy lọc - Diêm - Cối chày sứ 3. Các bước tiến hành Lá tươi được cắt nhỏ trong cối sứ (vứt bỏ phần gân lá), thêm một ít bột thuỷ tinh cho dễ nghiền, một ít CaCO 3 để trung hoà độ axit của dịch tế bào. Nghiền các mẩu lá cùng với một ít dung môi (cồn hoặc axeton 80% đã chuẩn bị) đến khi thành một thể đồng nhất. Thêm dung môi, rửa chày sứ, dùng đũa thuỷ tinh đổ dung dịch vào ống nghiệm qua phễu lọc. Dung dịch sắc tố thu được sẽ được dùng để đo hàm lượng sắc tố và tiến hành một số thí nghiệm nhằm chứng minh các tính chất lí, hoá học của clorophin. a.Xác định hàm lượng clorophin Đem dịch chiết sắc tố đo trên máy quang phổ ở các bước sóng 663nm, 645nm. Sau đó sử dụng các công thức để tính hàm lượng các sắc tố thành phần như sau: Clorophin a (mg/ l): 12,7. OD 663 - 2,69. OD 645 Clorophin b (mg/ l): 22,9. OD 645 - 4,68. OD 663 Ghi chú: Công thức này sử dụng cho dung môi là axeton 80% , OD là số đo trên máy quang phổ ở các bước sóng xác định. Cũng trên dung môi này, nếu đo ở các bước sóng khác, có thể dùng các công thức khác như: Clorophin a (mg/ l): 11,63. OD 665 - 2,39. OD 649 Clorophin b (mg/ l): 20,11. OD 649 - 5,18. OD 665 Clorophin a (mg/ l): 11,78. OD 664 - 2,29. OD 647 Clorophin b (mg/ l): 20,05. OD 647 - 4,77. OD 664 Sau đây là một vài công thức khác khi sử dụng các dung môi khác nhau: - Dung môi axeton 100 %: Clorophin a (mg/ l): 11,70. OD 662 - 2,09. OD 644 Clorophin b (mg/ l): 21,19. OD 644 - 4,56. OD 662 - Dung môi ête êtilic 100 %: Clorophin a (mg/ l): 10,1. OD 662 - 1,01. OD 644 Clorophin b (mg/ l): 16,4. OD 644 - 2,57. OD 662 - Dung môi 96 % êtanol: Clorophin a (mg/ l): 13,70. OD 665 - 5,76. OD 649 Clorophin b (mg/ l): 25,80. OD 649 - 7,60. OD 665 - Dung môi metanol 100 % : Clorophin a (mg/ l): 16,5. OD 665 - 8,3. OD 650 Clorophin b (mg/ l): 33,8. OD 650 - 12,5. OD 665 b.Quan sát hiện tượng huỳnh quang Đặt ống nghiệm chứa dịch sắc tố ra gần cửa sổ có ánh sáng trên một nền đen hoặc gần bóng đèn điện. Quan sát màu của dịch sắc tố ở ánh sáng phản xạ, ta thấy dịch sắc tố có màu đỏ thẫm - màu của rượu vang. Đó chính là hiện tượng huỳnh quang của clorophin. Hiện tượng huỳnh quang cũng có thể quan sát ở các cây sống. Đối tượng tốt để quan sát là tảo, rêu thuỷ sinh. Các đối tượng này đặt trên lam kính rồi quan sát dưới kính hiển vi bằng ánh sáng xanh tím. Sẽ quan sát thấy clorophin trong lục lạp có màu đỏ thẫm. c. Phản ứng với bazơ Đổ vào 4 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch sắc tố và tiến hành các thí nghiệm sau: - ống 1 làm đối chứng - ống 2: nhỏ 4 - 5 giọt KOH 20 %, lắc đều, cho thêm 4 giọt benzen, lắc mạnh rồi để yên. Dung dịch sẽ xảy ra phản ứng xà phòng hoá: COOCH 3 COOK C 32 H 30 ON 4 Mg + 2 KOH => C32H30ON4Mg + CH 3 OH + C 20 H 39 OH COOC 20 H 39 COOK Muối của clorophin cũng có màu xanh, xong khác với clorophin là không tan trong benzen. Như vậy màu của cồn và benzen khác nhau khi so sánh với đối chứng. d. Phản ứng với axit Lấy 2 ống nghiệm còn lại, cho vào mỗi ống 2 - 3 giọt HCL 10%, ta sẽ có chất pheophytin có màu nâu xám, vì Mg đã bị thay thế bằng 2 nguyên tử hidro theo phản ứng sau: COOCH 3 COOCH 3 C 32 H 30 ON 4 Mg + HCL =>C 32 H 30 ON 4 + MgCL 2 COOC 20 H 39 COOC 20 H 39 Sau khi quan sát màu của dịch sắc tố, ta lại tiếp tục cho vào một trong hai ống nghiệm dung dịch axetat đồng, sau đó đun sôi dung dịch trên nồi cách thuỷ. Màu nâu xám của dịch lại dần trở lại màu xanh lục đậm. Như vậy liên kết kim loại lại được tái lập, tức là Cu thay thế chỗ của Mg. 4. Kết luận: Clorophin là este của axit dicacboxilic. . Bài thực hành 1 Rút sắc tố từ lá và thực hiện một số phản ứng lí hoá học của clorophin 1. Nguyên tắc của phương pháp Do có nhân. lượng sắc tố và tiến hành một số thí nghiệm nhằm chứng minh các tính chất lí, hoá học của clorophin. a.Xác định hàm lượng clorophin Đem dịch chiết sắc tố