Tách dòng phân tử xây dựng thư viện hệ gen Tách dòng phân tử (molecular cloning) khái niệm nhóm phương pháp sử dụng để: i) phân lập một trình tự gen (ADN) đặc hiệu từ hỗn hợp phân tử ADN ban đầu tách chiết từ mẫu sinh học vốn có cấu trúc phức tạp, kích thước lớn; ii) khuếch đại (sao chép) trình tự lên số lượng lớn đủ để tiến hành phân tích cấu trúc chức gen tương ứng Khả tinh đoạn gen (ADN) đặc hiệu có số lượng đủ lớn cần thiết để “thao tác” đoạn gen mục tiêu nghiên cứu khác Chẳng hạn, từ phân đoạn ADN tách dịng, người ta tạo phân tử ADN tái tổ hợp mang phân đoạn ADN mang nguồn gốc khác Các phân tử ADN tái tổ hợp làm thay đổi mức độ biểu bình thường gen (chẳng hạn việc dung hợp trình tự mã hóa lồi với trình tự promoter lồi khác) chí mã hóa tổng hợp loại protein “dung hợp” (protein lai) mang trình tự axit amin từ protein có nguồn gốc khác Hiện nay, kỹ thuật tách dòng phân tử (bao gồm PCR) trở thành công cụ thiết yếu nghiên cứu điều hòa biểu gen hệ gen lồi sinh vật khác Q trình tách dịng ADN tạo nên phân tử ADN tái tổ hợp điển hình thường liên quan đến việc sử dụng véctơ trình tự mang thơng tin điều khiển hoạt động nhân lên (khuếch đại) và/hoặc biểu tế bào phân tử ADN tái tổ hợp mang đoạn ADN cài (đoạn trình tự phân lập) bao gồm trình tự gen quan tâm nghiên cứu Các “cơng cụ” để tạo nên phân tử ADN tái tổ hợp enzym giới hạn giúp cắt phân tử ADN vị trí xác định enzym nối cho phép ghép nối phân đoạn ADN có nguồn gốc khác với Bằng việc tạo nên phân tử ADN tái tổ hợp tự nhận lên tế bào chủ, đoạn ADN cài xác định phân lập, tinh nhân lên thành số lượng lớn Tiếp theo đây, mô tả cách phân tử ADN cắt, tái tổ hợp nhân lên, đồng thời đề cập đến việc xây dựng thư viện hệ gen gồm tập hợp phân tử ADN lai chứa đoạn cài xuất phát từ hệ gen cần thiết lập để phục vụ cho việc nghiên cứu, phân tích hệ gen Thông thường thư viện hệ gen thiết lập việc sử dụng chung loại véctơ mang phân đoạn ADN cài khác Chúng ta thấy cách phân đoạn ADN đặc hiệu xác định phân lập từ thư viện hệ gen Tách dòng ADN véctơ plasmit Sau phân đoạn ADN cắt khỏi phân tử ADN có kích thước lớn enzym giới hạn, phân đoạn ADN cần “cài” vào véctơ để nhân lên Hay nói cách khác phân đoạn ADN cần cài vào phân tử ADN thứ hai (véctơ) để nhân lên tế bào chủ nói Cho đến nay, tế bào chủ sử dụng rộng rãi để nhân lên đoạn ADN công nghệ ADN tái tổ hợp vi khuẩn E coli Các véctơ ADN điển hình thường có đặc tính: 1) Chúng phải chứa trình tự khởi đầu chép (tái bản), cho phép chúng tự chép độc lập với nhiễm sắc thể tế bào chủ 2) Chúng phải mang dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng xác định phân lập tế bào mang véctơ tái tổ hợp (mang đoạn ADN cài) với tế bào khơng mang véctơ tái tổ hợp 3) Có vị trí cắt nhiều enzym giới hạn khác Đây vị trí cài phân đoạn ADN cần tách dòng vào véctơ Véctơ tách dòng phổ biến phân tử ADN sợi kép, mạch vòng kích thước nhỏ (khoảng kb) gọi plasmit Các véctơ phần lớn có nguồn gốc từ loài vi khuẩn số từ sinh vật nhân chuẩn đơn bào (nấm men) Trong nhiều trường hợp, phân tử ADN tự nhiên mang sẵn gen mã hóa tính kháng chất kháng sinh Như vậy, plasmid tự nhiên có sẵn hai thuộc tính là: khả tự chép tế bào chủ có trình tự dấu chuẩn chọn lọc Ngồi ra, véctơ plasmit cịn ưu điểm chúng đồng thời tồn nhiều tế bào Điều giúp khuếch đại phân lập số lượng lớn phân đoạn ADN từ quần thể tế bào nhỏ Trước đây, số véctơ plasmit có vị trí cắt enzym giới hạn Cùng với thời gian, cấu trúc véctơ plasmit cải tiến theo hướng cắt bỏ bớt trình tự khơng cần thiết gắn thêm vào đoạn trình tự cắt nhiều loại enzym giới hạn khác Vị trí véctơ mang đoạn trình tự gọi vị trí đa tách dịng (polycloning site) Có vị trí đa tách dịng có kích thước ngắn cắt 20 loại enzym giới hạn khác Nhờ đặc tính này, véctơ dùng để tách dịng nhiều phân đoạn ADN có nguồn gốc khác Trên sở nguyên tắc tương tự, véctơ plasmit, người ta phát triển nhiều loại véctơ khác có nguồn gốc phagơ, lai vi khuẩn - phagơ (như phagemid, cosmid P), có nguồn gốc từ nấm men (ví dụ: YAC) Việc cài phân đoạn ADN vào véctơ thường công việc tương đối đơn giản Người ta thường sử dụng loại enzym giới hạn để cắt véctơ đoạn ADN cài Chẳng hạn việc sử dụng enzym EcoRI cắt chuyển véctơ từ dạng “vịng” sang dạng “mạch thẳng” có hai đầu dính Do cắt enzym giới hạn, nên đoạn ADN cài có hai đầu dính với trình tự bổ trợ với trình tự đầu dính véctơ Các đầu dính liên kết véctơ đoạn ADN cài lại với hình thành nên phân tử ADN mạch vòng (phân tử ADN tái tổ hợp) thiếu hai liên kết phosphodieste lại mạch Hai liên kết “hàn” kín nhờ sử dụng enzym ADN ligase có mặt ATP Để hạn chế khả gắn kết lại hai đầu dính véctơ (vì hai đầu dính có trình tự bổ trợ) sau cắt enzym giới hạn, người ta thường cho lượng ADN cài dư thừa so với véctơ để phần lớn véctơ sau gắn lại véctơ tái tổ hợp mang đoạn ADN cài Một số loại véctơ cho phép phân lập tinh phân đoạn gen đó, mà cịn điều hịa biểu gen nằm phân đoạn ADN cài Những véctơ gọi véctơ biểu Các véctơ thường phải chứa trình tự promoter nằm ngược dịng sát với vị trí cài gen Nếu vùng mã hóa gen (khơng chứa promoter) gắn vào véctơ theo chiều khung đọc gen, gen cài phiên mã thành mARN dịch mã thành protein tế bào chủ Các véctơ biểu thường sử dụng để biểu gen đột biến gen lai để tiến hành phân tích chức chúng Chúng dùng để sản xuất lượng lớn loại protein vốn khơng thu hiệu suất tương tự đường tự nhiên Ngoài ra, promoter véctơ biểu lựa chọn cho biểu gen cài điều hòa việc bổ sung hợp chất đơn giản vào môi trường nuôi cấy (như loại đường axit amin chẳng hạn) Việc điều khiển chủ động biểu gen có ý nghĩa quan trọng, đặc biệt gen gây độc Biến nạp véctơ ADN vào tế bào chủ Biến nạp q trình thể chủ tiếp nhận phân tử ADN ngoại lai từ mơi trường bên ngồi Một số vi khuẩn (trong khơng có E coli) có khả biến nạp tự nhiên gọi vi khuẩn khả biến di truyền Vi khuẩn E coli trở nên khả biến xử lý với ion Ca2+ Mặc dù chế khả biến chưa biết đầy đủ, dường ion Ca2+ bao bọc lại điện tích âm phân tử ADN tăng cường khả chúng xuyên qua màng tế bào Các tế bào xử lý với Ca2+ gọi tế bào khả biến Người ta sử dụng chất kháng sinh mà véctơ plasmid mang gen dấu chuẩn mã hóa tính kháng chất kháng sinh để chọn lọc thể mang plasmid tái tổ hợp Các tế bào mang véctơ tái tổ hợp sinh trưởng mơi trường chứa chất kháng sinh, tế bào khác khơng Thơng thường q trình biến nạp có hiệu suất khơng cao Chỉ có tỉ lệ nhỏ tế bào xử lý biến nạp tiếp nhận plasmid tái tổ hợp Nhưng, hiệu biến nạp thấp giúp hầu hết tế bào mang véctơ tái tổ hợp thường tiếp nhận plasmid Thuộc tính giúp cho tế bào biến nạp dòng tế bào chúng sinh (do phân chia trực phân) mang véctơ ADN tái tổ hợp cho phép nhà nghiên cứu thể phân lập tinh gen hoặc sản phẩm gen riêng rẽ từ hỗn hợp biến nạp mang phân tử ADN khác Thiết lập thư viện hệ gen untitled_500_28Đối với hệ gen đơn giản, kỹ thuật tách dòng thường đơn giản Chẳng hạn với hệ gen số virut có kích thước khoảng 10 kb, người ta trực tiếp tách chiết ADN, cắt chúng enzym giới hạn tiến hành phân tích điện di Các phân đoạn ADN tách biệt gel điện di cắt khỏi gel, tinh cài vào véctơ Trong đó, hệ gen phức tạp, kích thước lớn (như hệ gen người), việc cắt ADN tổng số enzym giới hạn phân tích điện di thường dẫn đến hình thành dải băng điện di liên tục có phân bố liên tục phân đoạn ADN cắt giới hạn khác một vài nucleotit Vì vậy, để đơn giản hóa quy trình tách dịng hệ gen này, người ta thường tiến hành biến nạp toàn phân đoạn ADN (thu sau cắt enzym giới hạn) vào véctơ tách dòng biến nạp tất chúng vào tế bào chủ, sau phân lập dịng tế bào mang véctơ tái tổ hợp có đoạn cài ADN khác Tập hợp dòng tế bào gọi thư viện hệ gen Như vậy, thư viện hệ gen tập hợp dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp chứa đoạn ADN cài khác có nguồn gốc (cùng hệ gen) untitled_500_28Để thiết lập thư viện gen, hệ gen tế bào đích (chẳng hạn ADN hệ gen người) cắt enzym giới hạn để tạo phân đoạn ADN có kích thước trung bình mong muốn Kích thước phân đoạn (đoạn cài) dao động từ 100 bp đến Mb (đối với phân đoạn ADN kích thước lớn, phân tử ADN thường cắt khơng hồn tồn enzym giới hạn) Các phân đoạn ADN cắt giới hạn sau “trộn” với loại véctơ phù hợp (trước cắt loại enzym giới hạn) ADN ligase Kết bước tạo tập hợp véctơ mang đoạn ADN cài khác Người ta tạo nhiều thư viện gen khác bắt nguồn từ nguồn vật liệu khác Thư viện hệ gen đơn giản bắt nguồn từ ADN hệ gen tổng số cắt enzym giới hạn nhất, gọi thư viện hệ gen Loại thư viện có ý nghĩa ứng dụng rõ rệt nhằm giải mã trình tự hệ gen Ngược lại, mục đích tìm phân lập phân đoạn mang gen mong muốn, thư viện hệ gen tỏ hiệu hệ gen chứa phần tương đối nhỏ vùng khơng mã hóa Đối với hệ gen phức tạp hơn, thư viện hệ gen không phù hợp cho việc tìm phân đoạn mang gen mong muốn phần lớn dịng thư viện mang đoạn cài thuộc vùng khơng mã hóa Để có thư viện gen mang hầu hết đoạn cài vùng mã hóa, người ta sử dụng thư viện cADN Các bước thiết lập thư viện cADN minh họa hình 10 Theo đó, bước thay ADN, người ta phiên mã ngược trình tự mARN thành trình tự ADN phiên (cADN) Quá trình gọi trình phiên mã ngược thực nhờ enzym ADN polymerase đặc biệt reverse transcriptase Enzym có khả tổng hợp ADN bắt nguồn từ phân tử ARN mạch đơn làm khn ban đầu Khi có mặt enzym reverse transcriptase, trình tự mARN phiên mã ngược thành phân tử ADN sợi kép, phân tử gắn vào véctơ Để phân lập đoạn cài riêng rẽ từ thư viện hệ gen, tế bào E coli tiến hành biến nạp với tất phân đoạn thư viện Mỗi tế bào biến nạp thường mang véctơ mang đoạn cài ADN Vì vậy, tế bào nhân lên sau chúng sẽ tạo nhiều dịng tế bào, dòng chứa nhiều phân đoạn thư viện cADN Khuẩn lạc tạo từ tế bào mang trình tự ADN mong muốn phân lập từ thu lại ADN Có số cách để xác định dòng tế bào mang gen biến nạp Chẳng hạn phương pháp nêu sử dụng mẫu dò ARN /hoặc ADN để xác định quần thể tế bào mang đoạn ADN định Sử dụng lai mẫu dị để xác định dòng tế bào thư viện gen Trong phương pháp sử dụng mẫu dò, người ta sử dụng đoạn trình tự ADN /ARN có trình tự bổ trợ đánh dấu lai với dòng tế bào mang đoạn gen cài khác thư viện hệ gen Kỹ thuật gọi phương pháp lai khuẩn lạc Một thư viện hệ gen điển hình thường chứa hàng ngàn đoạn cài khác mang loại véctơ tách dòng Sau véctơ biến nạp vào chủng vi khuẩn phù hợp, tế bào vi khuẩn cấy bề mặt đĩa petri chứa môi trường bán rắn chứa agar Mỗi tế bào sau phát triển lên thành khuẩn lạc riêng rẽ, ... tự hệ gen Ngược lại, mục đích tìm phân lập phân đoạn mang gen mong muốn, thư viện hệ gen tỏ hiệu hệ gen chứa phần tương đối nhỏ vùng khơng mã hóa Đối với hệ gen phức tạp hơn, thư viện hệ gen. .. Người ta tạo nhiều thư viện gen khác bắt nguồn từ nguồn vật liệu khác Thư viện hệ gen đơn giản bắt nguồn từ ADN hệ gen tổng số cắt enzym giới hạn nhất, gọi thư viện hệ gen Loại thư viện có ý nghĩa... cứu, phân tích hệ gen Thơng thư? ??ng thư viện hệ gen thiết lập việc sử dụng chung loại véctơ mang phân đoạn ADN cài khác Chúng ta thấy cách phân đoạn ADN đặc hiệu xác định phân lập từ thư viện hệ gen