BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------------------ NGUYỄN THỊ HOÀ VÂN BƯỚC ðẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU CRYIAC VÀO CÂY HOA ðỒNG TIỀN LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT Mã số: 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. NGUYỄN QUANG THẠCH HÀ NỘI - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 06 tháng 09 năm 2009 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hòa Vân Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự giúp ñỡ. Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo hướng dẫn GS.TS. Nguyễn Quang Thạch. Tôi ñã học hỏi ñược rất nhiều từ những bài giảng ñặc biệt hấp dẫn và khoa học trên lớp của thầy. Thầy luôn là người ñưa ra ñịnh hướng ñúng ñắn và ñộng viên kịp thời trong từng bước tôi thực hiện ñề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn cô giáo PGS.TS. Nguyễn Thị Lý Anh - Viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp ñã tạo mọi ñiều kiện ñể tôi hoàn thành các thí nghiệm. Tôi xin bày tỏ niềm ngưỡng mộ và biết ơn tới TS. Nguyễn Thị Phương Thảo, cô giáo dạy môn Công nghệ sinh học ñầu tiên, ñã cho tôi những lời khuyên và gợi ý bổ ích dẫn tới việc tôi theo ñuổi ñề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Thanh Phương - người ñã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình thực tập; em Hoàng Thị Giang - người ñầu tiên giúp tôi làm quen với các thao tác trong phòng thí nghiệm, ñã hướng dẫn thật tận tình và chu ñáo. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ làm việc tại Viện Sinh học Nông nghiệp, các bạn cùng thực tập ñã giúp ñỡ khi tôi làm ñề tài tại Viện. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới sự ñộng viên, cổ vũ và giúp ñỡ của chồng, bố mẹ và gia ñình hai bên. Hà Nội, ngày 06 tháng 09 năm 2009 Học viên Nguyễn Thị Hòa Vân Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt và kí hiệu v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình vii Danh mục các hình vii 1. MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích và yêu cầu 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Giới thiệu chung về cây hoa ñồng tiền 4 2.2 Giới thiệu chung về công nghệ chuyển gen ở thực vật 8 2.3 Phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 16 2.4 Giới thiệu chung về gen kháng sâu 21 2.5 Tình hình nghiên cứu chuyển gen 25 3. ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm nghiên cứu 33 3.2 Nội dung nghiên cứu 34 3.2.1 Nhóm thí nghiệm xác ñịnh các thông số cho quá trình chuyển gen 35 3.2.2 Nhóm thí nghiệm xác ñịnh sự hiện diện của các gen chuyển vào 39 3.2.3 Nhóm thí nghiệm ñánh giá sản phẩm chuyển gen 40 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 3.3 Phương pháp nghiên cứu 41 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 49 4.1 Nhóm thí nghiệm xác ñịnh các thông số cho quá trình chuyển gen 49 4.1.1 Thí nghiệm 1 49 4.1.2 Thí nghiệm 2 52 4.1.3 Thí nghiệm 3 55 4.1.4 Thí nghiệm 4 57 4.1.5 Thí nghiệm 5 59 4.2 Nhóm thí nghiệm xác ñịnh sự hiện diện của các gen chuyển vào 64 4.2.1 Thí nghiệm 6 64 4.2.2 Thí nghiệm 7 65 4.2.3 Thí nghiệm 8 67 4.3 Nhóm thí nghiệm ñánh giá sản phẩm chuyển gen 68 4.3.1 Thí nghiệm 9 68 4.3.2 Thí nghiệm 10 71 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 75 5.1 Kết luận 75 5.2 ðề nghị 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU Chữ viết tắt Kí hiệu AS Acetone Syringone BA Benzyl Adenin CHS Chalcone synthase CNSH Công nghệ sinh học DFR Dihydroflavonol-4-reductase ðC ðối chứng ðNC ðồng nuôi cấy IAA Indol Axetic Acid LB Luria Bertoni MES 2N – Morpholino ethanesulfonic acid MS Murashige và Skoog, 1962 PCR Polymerase Chain Reaction PPT Phosphinotricin TNC Tiền nuôi cấy TS Tái sinh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Hệ thống phân loại ñộc tố vi khuẩn Bt theo cách cũ [30] 24 3.1. Xác ñịnh mô thích hợp cho chuyển gen 37 3.2. Xác ñịnh thời gian ñồng nuôi cấy thích hợp 38 3.3. Xác ñịnh thời gian tiền nuôi cấy thích hợp 38 3.4. Xác ñịnh kỹ thuật lây nhiễm thích hợp 38 3.5. Xác ñịnh kỹ thuật rửa khuẩn thích hợp 39 3.5. Test kháng sâu 41 4.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu ñưa vào lây nhiễm ñến chuyển gen 50 4.2. Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến chuyển gen 53 4.3. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ñến chuyển gen 55 4.4. Ảnh hưởng của kỹ thuật lây nhiễm ñến chuyển gen 57 4.5. Ảnh hưởng của kỹ thuật rửa khuẩn ñến tỷ lệ mẫu sống và sạch khuẩn 60 4.6. Ảnh hưởng của các dòng ñồng tiền ñã chuyển gen ñến tỷ lệ chết của sâu khoang 71 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Cấu tạo vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 17 2.2. Cấu trúc Ti- plasmid trong vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 17 2.3. Quá trình chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 18 2.4. Cấu trúc vector chuyển gen pCAMBIA 20 2.5. Quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 20 3.1. Cây hoa ñồng tiền giống Gerbera jamesonii Ferrari 33 3.2. Sơ ñồ cấu trúc plasmid ITB2c trong vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 33 3.3. Sơ ñồ quy trình nghiên cứu 35 4.2. Biểu ñồ tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc của các mô 50 4.3. Biểu ñồ tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc ở các ngày ñồng nuôi cấy 53 4.4. Biểu ñồ tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc ở các ngày tiền nuôi cấy 56 4.5. Biểu ñồ tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc của các kỹ thuật lây nhiễm 58 4.6. Biểu ñồ tỷ lệ mẫu sống và sạch khuẩn của các kỹ thuật rửa khuẩn 60 4.7 . Sơ ñồ quy trình chuyển gen vào cây hoa ñồng tiền 62 4.8. Các mô ñược sử dụng làm ñối chứng 62 4.9. Sự phát triển của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên các loại mô 63 4.10. Sự phát triển của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở các ngày ñồng nuôi cấy 63 4.11. Sự phát triển của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở các kỹ thuật lây nhiễm 63 4.12. Các mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc 64 4.13. Nhân và tách các dòng ñồng tiền sau chọn lọc 64 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii 4.14. Callus chuyển gen biểu hiện âm tính và dương tính với thuốc thử gus 66 4.15. Phân tích PCR gen cryIAc 67 4.16. Các hộp nuôi sâu có ñục lỗ thở phía trên 69 4.17. Các loại sâu ñã thu thập trên ñồng ruộng 69 4.18. Hình ảnh về sâu khoang ăn lá ñồng tiền 69 4.19. Sâu khoang ăn lá các dòng ñồng tiền chuyển gen và chết trong vòng 9 ngày 74 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Vấn ñề sâu hại là một khó khăn lớn trong sản xuất hoa cây cảnh nói riêng và cây trồng nói chung. Tổn thất do sâu gây ra rất nghiêm trọng, hàng năm gây thiệt hại 29,7 tỷ USD, khoảng 13,8% mùa màng - cao nhất so với các loài dịch hại khác (H.H. Cramer, 1967). ðể phòng trừ sâu hại, ngoài các biện pháp truyền thống như canh tác, hóa học, cơ giới, vật lý ., sử dụng giống kháng sâu là một biện pháp mới và hiệu quả. Trước ñây, muốn tạo ra giống có ñặc tính mới này, người ta phải lai tạo trong thời gian dài. Tuy nhiên, công nghệ gen ra ñời ñã giải quyết ñược nhược ñiểm ñó. Nhiều giống cây trồng có khả năng kháng sâu như: bông, ngô, lúa, ñậu tương . ñã có mặt trên thị trường nhờ phương pháp chuyển gen và khẳng ñịnh ưu thế vượt trội. Ở Việt Nam nghiên cứu tạo giống cây chuyển gen nói chung và cây kháng sâu nói riêng còn hoàn toàn mới mẻ. ðã có những thành công bước ñầu ở một số loại cây lương thực nhưng vẫn chưa ñược ñưa vào sản xuất ñại trà. Nghiên cứu tạo ñặc tính kháng sâu cho ñối tượng hoa cây cảnh là một thị trường mới, còn ñang bị bỏ ngỏ. Mặc dù ñồng tiền là loại hoa mang lại hiệu quả kinh tế cao trong các loại hoa thông dụng hiện nay nhưng chưa có nhiều nghiên cứu trên ñối tượng này. Trên cơ sở ñã có nguyên liệu là vectơ chuyển gen, câu hỏi ñặt ra là: Liệu có chuyển gen kháng sâu vào cây hoa ñồng tiền ñược không? ðể trả lời câu hỏi này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Bước ñầu nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryIAc vào cây hoa ñồng tiền" . . ñề tài: Bước ñầu nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryIAc vào cây hoa ñồng tiền& quot; . Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông. ñích và yêu cầu 1.2.1 Mục ñích Chuyển ñược gen kháng sâu cryIAc vào cây hoa ñồng tiền tạo vật liệu hoa ñồng tiền chuyển gen. 1.2.2 Yêu cầu 1.2.2.1 Xác