Nhập môn Công nghệ sinh học 31 Chương 2 Công nghệ DNA tái tổ hợp I. Mở đầu Công nghệ DNA tái tổ hợp được hình thành từ những năm 1970 nhờ sự phát triển của các phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu các quá trình sinh học ở mức độ phân tử. Từ đó, cho phép phân lập, phân tích và thao tác trên các nucleic acid theo nhiều phương thức khác nhau, giúp hiểu biết sâu sắc các lĩnh vực mới của sinh học như công nghệ sinh học, bào chế các loại thuốc mới, y học phân tử và liệu pháp gen. Sự khám phá ra các enzyme hạn chế (restriction endonuclease) trong những năm đầu 1970 là sự phát triển then chốt (key development) không chỉ cho khả năng phân tích DNA hiệu quả hơn, mà còn cung cấp khả năng cắt các phân tử DNA để tạo ra các đoạn DNA tái tổ hợp mới, một quá trình mà ngày nay được gọi là tạo dòng gen (gene cloning). Phương thức tạo dòng này đã báo hiệu một kỷ nguyên mới trong thao tác, phân tích và khai thác các phân tử nucleic acid. Tạo dòng gen đã cho ra nhiều phát minh quan trọng và cung cấp những hiểu biết giá trị trong cấu trúc, chức năng và sự điều hòa hoạt động của gen. Từ những ứng dụng đầu tiên của chúng, các phương pháp xây dựng thư viện gen (gene library) được hình thành và phát triển, và hiện nay được xem như là nền tảng cơ sở cho nhiều thí nghiệm hóa sinh và sinh học phân tử. Mặc dù phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction-PCR) để khuếch đại gen cho phép phân tích gen nhanh hơn nhưng trong nhiều trường hợp kỹ thuật tạo dòng gen vẫn còn hữu ích và là một yêu cầu tuyệt đối. Những phần dưới đây cung cấp một bức tranh tổng quát về các quá trình cơ bản của công nghệ DNA tái tổ hợp. II. Phân lập đoạn DNA/gen Một số phương pháp phân lập gen để thực hiện kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã được sử dụng là: Nhập môn Công nghệ sinh học 32 1. Tách các đoạn DNA từ genome Phương pháp này được thực hiện như sau: DNA hệ gen (genomic DNA) của một sinh vật được cắt thành các đoạn nhỏ dài khoảng 20 kb (kích thước thích hợp tùy thuộc vào loại vector nhận chúng) bằng enzyme hạn chế rồi gắn vào vector để xây dựng thư viện genome (genomic library). Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae . Thông thư 4 bp, ví dụ như Mbo - - . (clone). . Nhập môn Công nghệ sinh học 33 (physical mapping). 2. Sinh tổng hợp cDNA từ mRNA Đoạn DNA được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu mRNA được gọi là cDNA (complementary DNA). ba như sau: - . - - 2 (Mg 2+ . - . mRNA-cDNA (khi tổng hợp sợi th E. coli (đ E. coli 5 . - 1. . Sợi đ bacteriophage (cDNA library). 3. Phân lập đoạn DNA bằng phương pháp PCR Ngoài hai phương pháp trên, hiện nay người ta sử dụng rất phổ biến phương pháp PCR để phân lập một trình tự nucleotide (gen) từ genome của Nhập môn Công nghệ sinh học 34 sinh vật dựa trên các primer đặc hiệu cho trình tự đó. Phương pháp PCR đơn giản và ít tốn thời gian hơn hai phương pháp trên, mà hiệu quả vẫn rất cao. 2.1. PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bư các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot (phân tích DNA). AAAAAA 3’ mRNA AAAAAA 3’ mRNA TTTTTT 5’ sợi cDNA thứ nhất TTTTTT 5’ AAAAAA 3’ TTTTTT 5’ AAAAAA 3’ TTTTTT 5’ cDNA sợi đôi Nuclease S1 DNA polymerase I Tổng hợp sợi cDNA thứ hai Biến tính nhiệt và xử lý RNase H để phá hủy sợi mRNA Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất trên khuôn mẫu mRNA Reverse transcriptase Gắn oligo(dT) primer 5’ 5’ 5’ 3’ Đầu 3’ của cDNA tạo thành vòng cặp tóc 5’ 3’ AAAAAA 3’ mRNA TTTTTT Mô (ví dụ: não) Sinh tan tế bào và tinh sạch mRNA Nhập môn Công nghệ sinh học 35 in vitro đ - đ 20 nucleotide. ▪ Nguyên tắc của PCR Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus tide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất , nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng. P DNA 3’ - 5’ - ). Nguyên tắc của PCR được trình đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác định. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thu - , qua đó từ 10 -6 g DNA ban đầu có thể khuếch đại lên tới trên 1 PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau: - Gây biến tính (denaturation) ở 90-95 o C. Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands). Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước đó). - Gắn primer (annealing) ở 40-65 o C. Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu. Các primer bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và bị đứt gãy liên tục giữa primer sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi đơn. Các liên kết ion ổn định hơ đoạn nhỏ (các primer đ Nhập môn Công nghệ sinh học 36 ) và trên các đ đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu. Hình 2.2. Sơ đ phản ứng chuỗi polymerase (PCR) - Kéo dài phân tử (extension) ở 70-72 o C. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’ 3’. Các primer có mối liên kết ion mạnh hơn các lực phá v . Các primer ở các vị trí không bắt cặp chính xác lại bị rời ra (do nhiệt đ . Enzyme Taq polymerase bổ sung các dNTP từ 5’ 3’. III. Tạo dòng (gắn) đoạn DNA/gen vào vector 1. Enzyme hạn chế Việc phát hiện ra các enzyme hạn chế (restriction enzyme) của vi khuẩn cắt DNA ở những trình tự đặc trưng, đã giúp cho việc thao tác gen dễ dàng hơn, vì nó có thể giảm chiều dài của các phân tử DNA thành một tập hợp bao gồm các đoạn ngắn hơn. Các enzyme hạn chế hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai (của bacteriophage) tiếp quản bộ máy tổng hợp Gen đích DNA khuôn mẫu Khuếch đại theo hàm mũ Chu kỳ 35 2 2 = 4 2 3 = 8 2 4 = 16 2 36 = 68 tỷ bản sao bản sao bản sao bản sao Nhập môn Công nghệ sinh học 37 protein của tế bào. DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của enzyme hạn chế, nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa (methylation) các nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không thể bị nhận biết bởi các enzyme hạn chế. Mỗi enzyme hạn chế nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc trưng chứa 4 hoặc 6 cặp nucleotide. Ví dụ: enzyme EcoRI chiết từ E. coli cắt trình tự GAATTC, enzyme TaqI của Thermus aquaticus cắt trình tự TCGA (Hình 2.3). Hiện nay, có trên 900 enzyme hạn chế khác nhau đã được tinh sạch từ hơn 230 chủng vi khuẩn. Các enzyme hạn chế cắt gãy các phân tử DNA sợi đôi theo hai cách khác nhau như trình bày ở hình 2.3: Pvu II ( Proteus vulgaris ) Eco RI ( Escherichia coli ) (A1) (A2) Rs AI ( Rhodopseudomonas sphaeroides ) Taq I ( Thermus aquaticus ) (B1) (B2) Hình 2.3. Các kiểu cắt và nhận biết trình tự nucleotide của enzyme hạn chế. (A1): tạo ra đầu bằng và (A2): tạo ra đầu so le với trình tự 6 nucleotide. (B1): tạo ra đầu bằng và (B2): tạo ra đầu so le với trình tự 4 nucleotide. - Cắt trên một đường thẳng đối xứng để tạo ra các phân tử đầu bằng (Hình 2.3, A1 và B1). Nhập môn Công nghệ sinh học 38 - Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối xứng để tạo ra những phân tử đầu so le (đầu dính) (Hình 2.3, A2 và B2). Vì một enzyme hạn chế nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ. Các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di agarose gel để nghiên cứu. Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả các cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú tương hợp nhau về cấu trúc. Vì thế, một đoạn DNA từ một dạng sống này có thể dễ dàng được pha trộn với DNA của một dạng sống khác. Sự tương tự này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA mạch vòng đóng-sợi đôi được dùng làm vector mang các đoạn DNA ngoại lai (foreign DNA) dùng trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA. 2. Các vector được dùng để tạo dòng các đoạn DNA in vitro 5’-PO 4 . . Trong thực tế, các đoạn DNA được gắn với nhau để tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp thường không phải là các đoạn ngẫu nhiên của DNA hệ gen, mà thay vào đó là một trong các đoạn DNA mang một gen từ sinh vật eukaryote hoặc vi khuẩn và một đoạn DNA khác thường là một phân tử vector (vector molecule) hoạt động như là một vật truyền để chuyển gen quan tâm vào trong một vi khuẩn hoặc một tế bào eukaryote. Hai loại vector được sử dụng phổ biến nhất là một loại có nguồn gốc từ các plasmid của vi Nhập môn Công nghệ sinh học 39 khuẩn và một loại khác có nguồn gốc virus xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn (bacteriophage, viết tắt là phage). 2.1. Plasmid vector 1- . đặc đ . đư i) hay multiple cloning sites (vùng 3- : - . 2.600 bp, mang gen Amp r và gen lacZ’ lacZ’ . N có ưu điểm k lacZ’ . - . 3.000 bp, mang gen Amp r , gen lacZ . - . 2.6). Nhập môn Công nghệ sinh học 40 2.4. Plasmid vector pUC19. Vùng tạo dòng (từ 396-447) được gắn vào gen lacZ’, nhưng không can thiệp vào chức năng của gen. 2.5. Plasmid vector pGEM -T Easy. Loại vector này đã được mở sẵn ở vùng tạo dòng trên gen lacZ mang hai đầu T, thích hợp cho việc gắn các sản phẩm PCR do chúng có mang hai đầu A. AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCATAATCATGGTCAT EcoRI SacI KpnI BamHI XbaI HincII PstI SphI HindIII SmaI XmaI AccI SalI 1 lacZ’ ThrIleMetThr(Met) 400 420 440 460 [...]... cách dùng các chủng vi khuẩn thích hợp hơn cho mục đích này và có thể thu được hiệu suất 109 thể biến nạp/µg plasmid IV Chọn dòng mang DNA tái tổ hợp Trong thí nghiệm tạo vector tái tổ hợp, hỗn hợp vector và một lượng lớn phân tử DNA cắt cùng một enzyme hạn chế được gắn lại với nhau bằng enzyme DNA ligase Kết quả, hỗn hợp này có plasmid tái tổ hợp lẫn các Nhập môn Công nghệ sinh học 48 plasmid không có... thiếu ở đầu 5’ Trong trường hợp này các phản ứng cắt và gắn giống như các phản ứng truyền thống 4 Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn/tế bào vật chủ Sau khi tạo được vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai, việc tiếp theo là biến nạp nó vào tế bào vật chủ Trong trường hợp này tế bào vật chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E coli để khuếch đại một lượng lớn DNA của plasmid tái tổ hợp dùng cho các phân tích... trong một hỗn hợp không đồng nhất như vậy nên các dòng vi khuẩn mọc lên có ba loại như sau: - Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid - Tế bào vi khuẩn nhận plasmid không có gen ngoại lai chèn vào - Tế bào vi khuẩn nhận đúng plasmid tái tổ hợp Vì vậy, việc xác định đúng các dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp phải mất nhiều công sức Có ba phương thức chính để xác định các dòng DNA tái tổ hợp là lai khuẩn... enzyme SalI, BamHI và EcoRI mang các vị trí 3 Gắn đoạn DNA vào vector 3.1 Gắn các đoạn cDNA đư , chẳng hạn như: b Nhập môn Công nghệ sinh học 43 (homopolymetric tailing) (linkers và adapter) vector Sợi đ (ví dụ: đoạn Klenow của DNA polymerase I của E coli ase 3’ (polymerase 5’ 3’ 3.1.2 Các adapter vector DNA Nhập môn Công nghệ sinh học 44 cDNA sợi đôi Sửa chữa bằng cách xử lý với đoạn Klenow Bổ... môi trường có Amp và IPTG+X-gal Vi khuẩn E coli chứa vector tái tạo vòng phát triển thành khuẩn lạc có màu xanh Vi khuẩn E coli chứa vector tái tổ hợp phát triển thành khuẩn lạc có màu trắng Hình 2.11 Khử hoạt tính bằng chèn đoạn Ampr: gen kháng ampicillin, lacZ: gen lacZ mã hóa enzyme β-galactosidase Về mặt lý thuyết, kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép đưa bất kỳ một đoạn gen nào từ sinh vật này vào... Cuối cùng đoạn cDNA có hai đầu tương đồng được gắn với vector và biến nạp vào E coli Nhập môn Công nghệ sinh học 45 3.2 Gắn các sản phẩm PCR Trong một số trường hợp nhất định có thể thay thế phương pháp tạo dòng truyền thống bằng phương pháp PCR, vì PCR cho phép sản xuất ra một lượng lớn đoạn DNA mong muốn và sau đó có thể tạo dòng đoạn DNA này trong các vector plasmid hoặc phage thích hợp Phương thức... hoạt tính V Biểu hiện của gen được tạo dòng Muốn gen tạo dòng có biểu hiện tổng hợp protein cần cấu tạo vector có đủ các yếu tố phiên mã và dịch mã Các vector này được gọi là vector Nhập môn Công nghệ sinh học 52 biểu hiện Nếu gen không nằm giữa promoter và terminator, nó sẽ không được phiên mã Các gen được tổng hợp hóa học hay từ cDNA không có promoter nên phải gắn chúng cạnh promoter thì mới có thể biểu... trên màng bằng cách đun nóng (baking) hoặc chiếu tia tử ngoại (UVNhập môn Công nghệ sinh học 49 crosslinking), và sau đó được lai trong đệm chứa probe đánh dấu đồng vị phóng xạ có trình tự bổ trợ một phần hoặc toàn bộ của chuỗi được xác định Ví dụ: có thể một oligonucleotide tổng hợp nhân tạo, có nguồn gốc từ DNA hệ gen từng phần, cDNA hoặc trình tự protein hoặc sản phẩm PCR Một đôi khi probe có thể được... -galactosidase của gen lacZ -gal sẽ có màu trắng do đoạn DNA ngoại lai chèn vào giữa gen lacZ lacZ không bị mất hoạt tính (Hình 2.11) Hin Bam của vector Bam Hin đ (protruding ends) Hin E coli Bam E coli Nhập môn Công nghệ sinh học 50 - Amp r BamHI BamHI BamHI BamHI lacZ Plasmid vector DNA ngoại lai Amp r Gen lacZ mất hoạt tính DNA ligase Amp r Amp r lacZ Đoạn DNA ngoại lai chèn giữa gen lacZ làm gen lacZ mất... biến nạp có thể được chuẩn bị trước và bảo quản vô hạn định mà không mất tính khả biến Nhập môn Công nghệ sinh học 47 - Tần số điện biến nạp với DNA siêu xoắn và DNA mạch vòng là giống nhau Do đó, không cần thiết phải dùng vector được tinh sạch cao trong các phản ứng gắn - Hiệu suất biến nạp phân tử cho DNA mạch vòng rất cao đối với các plasmid có kích thước lên đến 50 kb Nhược điểm của phương pháp . Nhập môn Công nghệ sinh học 31 Chương 2 Công nghệ DNA tái tổ hợp I. Mở đầu Công nghệ DNA tái tổ hợp được hình thành từ những năm. trình cơ bản của công nghệ DNA tái tổ hợp. II. Phân lập đoạn DNA/ gen Một số phương pháp phân lập gen để thực hiện kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã được sử dụng