cADN

Trong các phản ứng này, một lượng không đổi của các nhánh bacteriophage l được gắn với các lượng khác nhau của cDNA, mục đích là để xác định lượng cDNA tạo ra ít nhất là 5´ 10 6 bact[r]

Bài tiểu luận: Lập thư viện cADN

Nhóm sinh viên thưc hiên:

1 Trần Thị Vân Anh Trần Trung Hiếu

2 Trần Xuân Bách Nguyễn Quang Huy 3 Trương Thị Hải Cấn Thị Khánh

Huyền

4 Hà Minh Hiền Hoàng Thị Thu Hường

Khái quát chung

 Ngày trái đất đối mặt với biến đổi khí hậu Thay

đổi khí hậu làm thay đổi mức độ thiệt hại khô hạn, ngập úng, ngập mặn, nhiệt độ cao, tác hại sâu bệnh Chiến lược phát triển chung ngành nông

nghiệp giới tập trung vào nội dung sau: làm cho trồng thích ứng với biến đổi hậu; cải tiến suất vượt trội; tạo tảng đa dạng di

 Để làm điều người ta phải thực

nghiên cứu trình tự genom, cải tiến phương pháp đánh giá kiểu hình, áp dụng kĩ thuật di truyền đặc

biệt xây dựng thư viện cDNA

 Trong nội dung Hội nghị quốc tế lần thứ

 Thư viện cDNA giúp có

dịng cDNA mã hóa liên tục gen, tìm chúng cách dễ dàng.

 Nhận thấy tầm quan trọng đề tài

Tổng quan đề tài

I, Thư viện cDNA gì?

 1, Khái niệm

 2, Các bước tổng hợp cDNA

 3, Các bước lập thư viện cDNA

 4, Ưu điểm việc lập thư viện cDNA

I Thư viện cDNA (c-DNA library) gì?

 1 Khái niệm

 cDNA (complementary DNA) có nghĩa ADN bổ trợ.  ADN bổ trợ ADN đựơc tổng hợp từ ARN

thông tin( messenger RNA hay m- RNA) duới xúc tác enzim phiên mã nguợc (reverse

transcriptase).

 Thư viện cADN tập hợp lưu trữ ADN bổ

 Là tập hợp cDNA từ tất mARN

của tế bào Không giống với thư viện gen thư viện cDNA thiết lập từ tế bào xác định

Trong gen cần nghiên cứu phải biểu thành mARN

 Thường nguời ta thiết lập thư viện cADN vectơ

thực khuẩn thể lambda( vectơ chèn) truờng hợp cần lập thư viện cADN tổng thể, hay vectơ plasmid

trong truờng hợp cần lập thư viện cADN hạn chế.

1.Các buớc để tổng hợp cDNA

Tổng hợp sợi thứ enzyme reverse transcriptase ( enzim phiên mã nguợc).

Biến tính cắt RNA thể lai mRNA-cDNA tuần tự nhiệt enzyme RNase H E

coli Thay khuôn mẫu chuỗi RNA bằng chuỗi cDNA thứ tổng hợp sợi cDNA thứ hai nhờ DNA polymerase I E coli.

(1) Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất

 ARN thông tin sinh vật bậc cao thuờng có

đi (3’ end) chuỗi gốc A (poly-A) Như mồi để tổng hợp chuỗi gốc T ( oligo-dT) Enzim xúc tác trình là enzim phiên mã nguợc (reverse

Có thể tóm tắt q trình làm sau:

Người ta tách riêng mARN nhờ tổ hợp ologonucleotid chứa deoxythimidin (Oligo dT) Người ta gắn oligo (dT) phiễu chiết Sau chiết xuất toàn ARN tế bào gồm rARN, tARN, mARN cho hỗn hợp chảy qua phễu có gắn xellulo-oligo (dT)

Sau tổng hợp xong sợi ADN bổ trợ, lúc sợi ADN bổ trợ kết cặp với ARN thông tin liên kết hydro ( hỗn hợp sợi ARN ADN gọi

heteroduplex)

Nguời ta gây biến tính (đun sôi) thể lai

mRNA-cDNA để cắt RNA RNase H

(2) Tổng hợp sợi cADN thứ 2

 Thông thường, đầu tận 3’ cDNA sợi

đơn có khả tạo thành cấu trúc vịng cặp tóc (hairpin loop) và vì sử dụng để làm mồi (primer) cho trình tổng hợp sợi cDNA thứ hai DNA polymerase I của E coli reverse transcriptase

 Đoạn Klenow DNA polymerase I thiếu hoạt

(3) Cắt vịng cặp tóc cDNA sợi đơi

 Sau tổng hợp cDNA hồn toàn, sợi thứ thứ hai liên kết cộng hóa trị vịng cặp tóc vịng cặp tóc dễ bị cắt nuclease S1 Sau đó, đoạn cDNA sửa chữa enzyme Klenow,kết hai đầu tận đầu

 Sợi đôi cDNA sau tách thành tiểu phần theo kích thước phân tử lớn gắn vào

 Tuy nhiên, việc đưa đầu vào vector gây khó khăn việc lấy chúng khỏi vector cách nguyên vẹn sau Do linker thường nối vào hai đầu cDNA nhờ DNA ligase Linker đoạn

nucleotide ngắn có chứa vị trí nhận biết loại RE (ví dụ: EcoRI) tổng hợp nhân tạo tương ứng với vị trí nhận

biết RE (ví dụ: EcoRI) vector Sau đó, cDNA mang linker vector cắt enzyme (ví dụ:

3 Các bước lập thư viện cADN bacteriophage l vector

 1 Chọn lọc kích thước cDNA

 2 Gắn cDNA với nhánh

bacteriophage l

(1) Chọn lọc kích thước cDNA

 cDNA sau cắt hạn chế phân đoạn

bằng sắc ký cột Sepharose để loại bỏ

những linker thừa phân tử cDNA có kích thước nhỏ 500 bp Cột sắc ký

(2) Gắn cDNA với nhánh bacteriophage l

 Thông thường cần phải tiến hành thử loạt phản ứng gắn phản ứng đóng gói Trong phản ứng này, lượng không đổi nhánh bacteriophage l gắn với lượng khác cDNA, mục đích để xác định lượng cDNA tạo 5´ 106 bacteriophage tái tổ

hợp

 Phản ứng gắn cần thiết kế cho tối thiểu

bacteriophage tái tổ hợp đơn chứa nhiều phân tử cDNA cách dùng tỷ lệ nhánh phosphoryl hóa cDNA để 5% bacteriophage tái tổ hợp Nếu sử dụng nhánh dephosphoryl hóa, bacteriophage khơng tái tổ hợp bị ức chế hiệu quả, xác định lượng cDNA cần thiết để tạo quần thể

(3) Phân tích đoạn chèn cDNA

Thu thập khoảng mười hai plaque bacteriophage tái tổ hợp chuẩn bị DNA để cắt RE thích hợp

Phân tích kích thước đoạn chèn cDNA điện di agarose gel 1%, dùng DNA marker có đoạn từ 500 bp tới kb

Nếu bacteriophage tái tổ hợp chứa đoạn chèn có kích thước khác kích thước trung bình chúng xấp xỉ kb lớn hơn, tiến hành bước (ví dụ: tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh)

(4) Tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh

 Nếu sử dụng nhánh dephosphoryl hóa để xây dựng thư viện cDNA,

tính tốn lượng cDNA cho kết tăng gấp 10 lần số lượng plaque không tái tổ hợp Nếu sử dụng nhánh phosphoryl hóa, tính toán

lượng cDNA cho kết quần thể bacteriophage chứa xấp xỉ 5% thể tái tổ hợp

 Thiết kế phản ứng gắn quy mô lớn, tăng số lượng tất thành

phần tỷ lệ thích hợp

 Chắc chắn thiết kế phản ứng gắn đối chứng chứa nhánh

(5) Khuếch đại thư viện cDNA

 Vector lgt10.

 Để thiết lập cung cấp lâu dài thư viện,

nó cần phải khuếch đại bằng sinh trưởng chủng E coli thích hợp (chẳng hạn chủng BNN102) trên đĩa agar Nếu thư viện chỉ sàng lọc lần, bước khuếch đại bỏ qua

bacteriophage dàn mỏng trực tiếp

 Vector lgt11 dẫn xuất lZAP, lZAPII Các thư

4 Ưu điểm

 Các dịng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục gen  Nhiều gen eukaryote gián đoạn, có chứa nhiều đoạn

intron Sau cắt tiền thân mRNA (pre-mRNA) nối lại, đoạn intron bị loại mRNA hồn thiện (mature mRNA) có trình tự mã hóa liên tục tạo thành Do cDNA phiên mã ngược từ khn mẫu mRNA hồn thiện nên dịng cDNA tổng hợp protein cần thiết với số lượng lớn mong muốn

 Nhiều protein tổng hợp với số lượng lớn tế bào

II.Những thành tựu đạt đựơc

Các nhà khoa học thuộc CIAT, Colombia Nhật Bản hòan thành việc xây dựng thư viện cDNA có chiều dài phân tử đầy đủ, điều kiện bình thường, nóng, khơ hạn, độ độc nhơm, điều kiện sau thu họach làm tổn hại đến sinh lý trồng

Bản chất di truyền genome khoai mì phức tạp với chu kỳ sinh trưởng dài, việc cải tiến

 Áp dụng công nghệ sinh học để cải tiến giống khoai mì

chiến lược động Kiến thức gen điều khiển chống chịu stress vô cần thiết tiếp cận với cơng nghệ sinh học, thí dụ chọn giống nhờ thị phân tử (MAS) chuyển nạp gen

 Thư viện cDNA khoai mì tiềm phục vụ cho nhà

Thành tựu nuớc ta

 Viện di truyền nông nghiệp Việt Nam:

Tách dòng tổng cộng 184 dòng gen hoạt động mạnh điều kiện cực đoan; giải mã trình tự ADN xác định trình tự axit amin 41 dịng gen hoạt động mạnh Ngồi kết đối chiếu với Ngân hàng gen cho thấy tất 41 dịng gen có vị trí xác định clone genomic, BAC PAC, có nhiều dịng gen có độ đồng cao (trên 90%) với clone cDNA Ngân hàng Gen biết rõ chức

Đã xác định dịng gen “kháng đạo ơn”, dòng gen