Đang tải... (xem toàn văn)
luận văn
B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I - - LƯU TH H I Y N XÂY D NG QUY TRÌNH XÁC ð NH VI KHU N VEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI TRONG TH T B NG K THU T PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) LU N VĂN TH C S NÔNG NGHI P Chuyên ngành : THÚ Y Mã s : 60.62.50 Ngư i hư ng d n khoa h c: TS ð Hà N i - 2011 NG C THÚY L I CAM ðOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên c u c a riêng tơi Các s li u, k t qu nêu lu n văn trung th c chưa t ng ñư c cơng b b t kỳ cơng trình khác Tơi xin cam đoan r ng thơng tin trích d n lu n văn đ u ñư c ch rõ ngu n g c Hà N i, ngày 28 tháng 10 năm 2011 Tác gi Lưu Th H i Y n Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p i L I C M ƠN ð hoàn thành lu n văn này, s c g ng c a b n thân, ph i k t i s giúp ñ v v t ch t tinh th n c a th y, giáo, gia đình b n bè c a tơi Trư c h t, tơi xin đư c bày t s c m ơn chân thành t i TS ð Ng c Thúy – ngư i ñã tr c ti p hư ng d n tơi hồn thành lu n văn Tơi xin đư c c m ơn TS Nguy n Bá Hiên, th y cô giáo b môn Vi sinh v t – Truy n nhi m, Khoa Thú y, Trư ng ñ i h c Nơng nghi p Hà N i giúp ñ t o m i ñi u ki n cho tơi hồn thành lu n văn Tơi xin chân thành c m ơn PGS TS Cù H u Phú, cán b nghiên c u công tác t i b môn Vi trùng, Vi n Thú y Qu c gia ñã giúp ñ , hư ng d n, ch b o t n tình cho tơi q trình th c hi n đ tài Cu i cùng, gia đình b n bè tơi m t s c vũ to l n, ñ ng l c đ tơi hồn thành lu n văn Xin trân tr ng c m ơn! Hà N i, ngày 28 tháng 10 năm 2011 Tác gi Lưu Th H i Y n Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p ii DANH M C CÁC CH VI T T T VÀ KÝ HI U A/E Attaching and Effacing (Bám dính xâm nh p) BHI Brain Heart Infusion BPW Buffer Peptone Water cs C ng s DNA Deoxyribonucleic Acid E coli Escherichia coli FDA Food and Drug Administration (Cơ quan th c ph m dư c ph m M ) HC Hemorrhagic colitis (Viêm ru t xu t huy t) HUS Hemolytic uremic syndrome (H i ch ng huy t ni u) LB Luria Bertani MR Methyl Red m-TSB modified Trypticase Soy Broth NB Nutrient Broth PCR Polymerase chain reaction (Ph n ng chu i trùng h p) TTP Thrombotic thrombocytopenic purpure (Ban xu t huy t gi m ti u c u) VK Vi khu n VP Voges-Proskauer VSATTP V sinh an toàn th c ph m VT Verotoxin VTEC Verotoxigenic Escherichia coli WHO World Health Organisation (T ch c y t th gi i) Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p iii DANH M C B NG TT Tên b ng Trang 2.1 Trình t m i dùng đ xác đ nh gen VT1, VT2 eae 36 2.2 Thành ph n ch t ph n ng PCR dùng ñ xác ñ nh gen VT1, VT2 eae 37 2.3 Các chu kỳ nhi t c a ph n ng PCR dùng ñ xác ñ nh gen VT1, VT2 eae 37 2.4a M t s y u t gây b nh ch y u c a ch ng vi khu n E coli ñ i ch ng dương 38 2.4b M t s y u t gây b nh ch y u c a ch ng vi khu n ñ i ch ng âm 39 3.1 K t qu th nghi m ph n ng PCR ñơn ña m i ñ phát hi n m t s gen ñ c l c c a VTEC 45 3.2 K t qu xác đ nh mơi trư ng thích h p ni c y vi khu n đ chi t tách DNA cho ph n ng PCR 47 3.3a K t qu th c hi n ph n ng PCR ph c ñ phát hi n ch ng vi khu n ñ i ch ng dương .48 3.3b K t qu th c hi n ph n ng PCR ph c v i ch ng vi khu n ñ i ch ng âm 49 3.4 K t qu ñ m s hai ch ng vi khu n ñ i ch ng dương m t s môi trư ng nuôi c y .51 3.5 K t qu xác ñ nh ñ nh y ñ ñ c hi u c a ph n ng PCR môi trư ng nuôi c y .52 3.6 K t qu xác ñ nh ñ nh y ñ ñ c hi u c a ph n ng PCR m u th t s ch 55 3.7 T ng h p s lư ng ch ng lo i m u thu th p ñư c 60 3.8 K t qu ki m tra ñ c tính c a vi khu n E coli phân l p ñư c 61 3.9 T l phân l p vi khu n VTEC t m u th t 63 3.10 Kh s n sinh ñ c t VT c a ch ng VTEC phân l p ñư c 69 3.11 K t qu xác ñ nh serotyp c a ch ng VTEC phân l p ñư c 70 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p iv DANH M C BI U, HÌNH Hình 1.1: Cơ ch tác đ ng c a ñ c t VT .16 Hình 3.1: Các s n ph m c a ph n ng PCR v i ch ng vi khu n ñ i ch ng dương âm sau q trình n di 48 Hình 3.2: K t qu đ m s ch ng FD636 th ch máu 51 Hình 3.3: Các s n ph m c a ph n ng PCR v i n ng đ pha lỗng khác t mơi trư ng LB ni c y ch ng FD636 54 Hình 3.5: X lý m u t i phịng thí nghi m .60 Hình 3.6: Tính ch t m c c a E coli môi trư ng MacConkey 62 Hình 3.7: Tính ch t m c c a E coli môi trư ng th ch máu .62 Hình 3.8: Tính ch t m c c a E coli môi trư ng EMB 62 Hình 3.9: Tính ch t m c c a E coli môi trư ng CT-SMAC 62 Hình 3.10: Kh lên men sinh m t s lo i ñư ng c a E coli .62 Hình 3.11: Kh sinh Indol c a E coli 62 Hình 3.12: S n ph m c a ph n ng PCR t m u th t sau trình ñi n di 64 Bi u ñ 3.1: T l phân l p vi khu n VTEC t m u th t 64 Hình 3.13: S n ph m c a ph n ng PCR t khu n l c riêng bi t c a m t s m u th t sau trình ñi n di .66 Hình 3.14: S n ph m c a ph n ng PCR t m u phân m u lau .67 thân th t sau trình ñi n di 67 Hình 3.15: S n ph m c a ph n ng PCR t khu n l c riêng bi t c a m u phân sau q trình n di 67 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p v M CL C L I CAM ðOAN .i L I C M ƠN ii DANH M C CÁC CH VI T T T VÀ KÝ HI U iii DANH M C B NG .iv DANH M C BI U, HÌNH .iv M C L C vi M ð U PH N I - T NG QUAN 1.1 L ch s nghiên c u .3 1.2 Phân lo i E coli 1.3 ð c tính c a vi khu n E coli 1.4 Verocytogenic Escherichia coli (VTEC) 12 PH N II - ð I TƯ NG, N I DUNG, NGUYÊN LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 34 2.1 ð i tư ng, ñ a ñi m nghiên c u 34 2.2 N i dung nghiên c u 34 2.3 Nguyên li u dùng nghiên c u 34 2.4 Phương pháp nghiên c u 35 PH N III - K T QU VÀ TH O LU N 44 3.1 Thi t l p chu n hóa phương pháp PCR 44 3.1.1 L a ch n gi a PCR ñơn PCR ph c 44 3.1.2 L a ch n môi trư ng ni c y thích h p đ tách chi t DNA m u 46 3.1.3 K t qu th c hi n ph n ng v i ch ng ñ i ch ng .47 3.2 K t qu xác ñ nh ñ nh y ñ ñ c hi u c a phương pháp PCR dùng ñ xác ñ nh VTEC 49 3.2.1 K t qu xác ñ nh ñ nh y ñ ñ c hi u c a phương pháp PCR dùng ñ xác ñ nh VTEC môi trư ng nhân t o 50 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p vi 3.2.2 K t qu xác ñ nh ñ nh y ñ ñ c hi u c a phương pháp PCR dùng ñ xác ñ nh VTEC m u th t s ch 55 3.3 Quy trình xác đ nh s có m t c a vi khu n VTEC m u th t57 K t qu phân l p vi khu n VTEC m u th t 58 3.4.1 K t qu áp d ng quy trình phân l p xác đ nh vi khu n VTEC có m u th t thu th p t ch lò m 59 3.4.2 K t qu giám ñ nh ch ng vi khu n VTEC phân l p ñư c 68 PH N IV - K T LU N VÀ ð NGH 71 4.1 K t lu n 71 4.2 ð ngh .71 TÀI LI U THAM KH O 73 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p vii M ð U Tính c p thi t c a ñ tài Trên ph m vi th gi i, c tính hàng năm có kho ng t ngư i b ng ñ c th c ph m (ð u Ng c Hào, 2011) Vi t Nam, theo c tính th ng kê c a T ch c y t th gi i (WHO) có kho ng tri u ngư i b ng ñ c th c ph m m i năm, ph n l n x y t i b p ăn t p th , khu công nghi p, b p ăn c a h c sinh Năm 2010, c nư c x y 175 v ng ñ c th c ph m, làm 5.000 ngư i m c 42 trư ng h p t vong Thi t h i kinh t cho chi phí u tr b nh ngh làm vi c kho ng tri u USD/năm (Phương Thu n, 2011) Các s ñây cho th y m t th c tr ng ñáng lo ng i v v n ñ v sinh an toàn th c ph m (VSATTP) VSATTP có vai trị r t quan tr ng đ i v i cu c s ng ngư i, nh hư ng tr c ti p t i s c kh e, tu i th , ch t lư ng môi trư ng, ch t lư ng cu c s ng, phát tri n kinh t uy tín thương hi u s n ph m, uy tín qu c gia Trong nh ng th p k g n ñây, ô nhi m vi khu n Escherichia coli (E.coli) thu c nhóm Verotoxygenic Escherichia coli (VTEC) s n sinh ñ c t Verotoxin (VT) th c ph m ñã tr thành ñ tài nghiên c u c a nhi u tác gi tính nghiêm tr ng c a b nh vi khu n gây ngư i (Bergamini, 2007) Tuy nhiên, t i Vi t Nam, có r t cơng trình nghiên c u tương t ð c t VT có hai nhóm VT1 VT2 v i nhi u bi n th khác (Gyles Fairbrother, 2004) ð c t gây lo i b nh viêm ru t xu t huy t (HC – Hemorrhagic colitis), h i ch ng huy t ni u (HUS – Haemolytic uremic syndrome), ban xu t huy t gi m ti u c u (TTP – Thrombotic Thrombocytopanic purpura), viêm ñư ng ni u (Urinary tract Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p infections), viêm màng não (meningitis) (XU Jian-Guo cs, 1999; Lake Cressey, 2002) Vi khu n có th lây nhi m qua nhi u ñư ng khác nhau, s d ng th c ph m, rau xanh, nư c u ng b nhi m vi khu n, ti p xúc tr c ti p v i ñ ng v t mang trùng, … (Võ Thành Thìn cs, 2008) Vi c xây d ng ñư c m t quy trình chu n đ xác đ nh vi khu n VTEC phù h p v i ñi u ki n phịng thí nghi m t i Vi t Nam, nh m xác đ nh nhanh xác th t tươi b nhi m vi khu n VTEC s n n t ng quan tr ng ch n đốn u tr trư ng h p ng ñ c th c ph m cho nghiên c u ti p theo Vì v y, chúng tơi ti n hành nghiên c u ñ tài: “Xây d ng quy trình xác ñ nh vi khu n Verotoxigenic Escherichia coli th t b ng k thu t PCR (Polymerase chain reaction)” Nghiên c u cho phép xác đ nh nhanh xác tiêu chu n vi sinh ñ i v i vi khu n VTEC th c ph m, lo i b ho c tiêu h y k p th i th c ph m có nhi m m m b nh ho c xác ñ nh nguyên nhân c a v ng ñ c th c ph m VTEC M c tiêu nghiên c u Xây d ng đư c m t quy trình thích h p có th dùng đ xác đ nh xác th t b nhi m vi khu n VTEC Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p PH N IV K T LU N VÀ ð NGH 4.1 K t lu n T k t qu c a nghiên c u, rút m t s k t lu n sau: 4.1.1 Phương pháp PCR ph c v i lo i c p m i (VT1, VT2 eae) v i ñi u ki n ph n ng ñã ñư c thi t l p chu n hóa nghiên c u có th đư c áp d ng ñ xác ñ nh vi khu n VTEC, ph n ng có đ đ c hi u 100% ñ nh y 2,3 – 6,6 x 104 vi khu n/ml 4.1.2 ðã xây d ng ñư c m t quy trình xác đ nh vi khu n VTEC th t Quy trình có th d dàng áp d ng phịng thí nghi m vi trùng ñ xác ñ nh m c ñ v sinh an toàn c a th t tươi 4.1.3 K t qu áp d ng th nghi m quy trình đư c xây d ng v i 100 m u th t t i ch 30 m u t i lị m cho t l dương tính v i vi khu n VTEC l n lư t 32% 6,7% 4.1.4 Trong 41 ch ng VTEC phân l p ñư c, ña s ñ u có gen VT1 (hơn 70%), ch có m t s ch ng có gen VT2, có ch ng phân l p đư c t th t bị có c hai gen đ c t VT1 VT2, chi m t l 25% ð c bi t, không ch ng s ch ng VTEC phân l p đư c có gen eae 4.1.5 K t qu xác ñ nh serotyp kháng nguyên O c a 41 ch ng VTEC phân l p ñư c cho th y ch ng VTEC thu c v 14 nhóm kháng nguyên O khác nhau, khơng có ch ng thu c nhóm O157, O111 hay O26 Nhóm O8 O103 đ u ñã ñư c phát hi n th y m t t l nh t ñ nh s ch ng có ngu n g c t th t l n th t bò 4.2 ð ngh 4.2.1 Áp d ng th nghi m quy trình v i m u phân môi trư ng t i tr i chăn ni đ xác đ nh m c ñ lưu hành c a vi khu n thu c nhóm VTEC Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 71 kh lây nhi m c a chúng sang v t nuôi th c ph m dùng làm th c ăn cho ngư i 4.2.2 Ti p t c ti n hành thí nghi m lo i m u ñ xác ñ nh ñư c t l VTEC th t ñ ng v t cung c p th c ph m, ñ ng th i xác ñ nh ñư c ngu n g c c a VTEC Vi t Nam Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 72 TÀI LI U THAM KH O TI NG VI T ð u Ng c Hào (2011), “An tồn s n ph m chăn ni t s n xu t t i tiêu dùng”, T p chí khoa h c k thu t thú y, T p XVIII (1), tr 84 – 88 Bùi Th Phương Hịa (2008), “ Th c tr ng cơng tác v sinh an toàn th c ph m ngành chăn nuôi thú y gi i pháp kh c ph c”, T p chí khoa h c k thu t thú y, t p XV (2), tr 93 – 99 Nguy n Bình Minh (2004), “K thu t PCR ña m i xác ñ nh lo i Escherichia coli gây b nh”, T p chí Y h c Vi t Nam, s 7, T ng h i y dư c h c Vi t Nam, tr - 4 Ph m Th Tâm, Ph m Công Ho t, Tr n Th H nh, Tô Long Thành Lê Văn Nhương (2009), “Nghiên c u ch t o l a ch n kháng nguyên c a vi khu n E coli O157:H7 ph c v thi t l p ph n ng ELISA”, T p chí khoa h c k thu t thú y, T p XVI (5), tr.11 – 15 Nguy n Như Thanh, Nguy n Bá Hiên, Tr n Th Lan Hương (2001), Vi sinh v t thú y, NXB Nông nghi p, Hà N i Võ Thành Thìn, Nguy n Th Ánh Hưng, ð ng Văn Tu n Ngô ðăng Nghĩa (2008), “T l nhi m phân tích đ c t Shiga c a vi khu n E coli phân l p t th t bò t i TP Nha Trang”, T p chí khoa h c k thu t thú y, t p XV (3), tr 26 – 31 Phương Thu n (2011), “Hơn 6000 ngư i b ng ñ c th c ph m m i năm”, http://giadinh.net.vn/2011032509425334p1044c1045/hon-6000- nguoi-bi-ngo-doc-thuc-pham-moi-nam.htm Lê Th Tuy t Trinh (2007), Phát tri n hoàn thi n h th ng PCR ña m i xác ñ nh tr c ti p Escherichia coli gây tiêu ch y t phân, Lu n văn th c s y h c, ð i h c Y Hà N i, Hà N i Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 73 Tr n Trí Tu (2001), Góp ph n nghiên c u ng d ng k thu t PCR đa m i ch n đốn Escherichia coli gây tiêu ch y, Lu n văn Th c s y h c, Trư ng ñ i h c Y Hà N i TI NG ANH 10 Acheson D W K., Keusch G T., Lightowlers M and Donohue-Rolfe A (1990), “Enzyme linked immunosorbent assay for Shiga toxin and Shigalike toxin II using P1 glycoprotein from hydatid cysts”, Journal of Infectious Diseases, 161, p 134 – 137 11 Alfredo Caprioli, Silvia Bonardia, Emilio Maggia, Gisella Pizzina and Stefano Morabitob (2001), “Faecal carriage of Verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 and carcass contamination in cattle at slaughter in northern Italy”, International Journal of Food Microbiology, Vol 6, Issues – 2, p 47 – 53 12 Allerberger F., Rossboth D., Dierich M P., Aleksic S., Schmidt H and Karch H (1996), “Prevalence and clinical manifestations of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli infections in Australian children”, European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Disease, 15(7), p 545 – 550 13 Beebakhee G., Louie M., de Azavedo J and Brunton J (1992), “Cloning and nucleotide enterohemorrhagic sequence of Escherichia the coli eae gene serotyp homologue O157:H7”, from FEMS Microbiology Letters, 91, p 63 – 68 14 Begum D., M P Jackson (1995), “Direct detection of Shiga-like toxinproducing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction”, Mol Cell probes, 9, p 259 – 264 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 74 15 Benjamin M M and Datta A R (1995), “Acid tolerance of enterohemorrhagic Escherichia coli”, Applied and Environmental Microbiology, 61 (4), p 1669 – 1672 16 Bergamini A.M.M (2007), “Prevalence and characteristics of Shiga toxinproducing Escherichia coli (STEC) strains in ground beef in Sao Paulo, Brazil”, Brazilian Journal of Microbiology, p 1517 – 8382 17 Bettelheim K A (1997), “Escherichia coli O157 outbreak in Japan: lesson for Australia”, Australian Veterinary Journal, 75 (2), p 108 18 Beutin L., Geier D., Steinruck H., Zimmermann S and Scheuts F (1993), “Prevalence and some properties of Verotoxin (Shiga-like toxin)producing Escherichia coli in seven different species of healthy dosmetic animals”, Journal of Clinical Microbiology, 31 (9), p 2483 – 2488 19 Beutin L., Aleksic S., Zimmermann S and Gleier K (1994), “Virulence factors and phenotypical traits of verotoxigenic strains of Escherichia coli isolated from human patients in Germany”, Medical Microbiology and Immunology, 183, p 13 – 21 20 Bolton F J., Crozier L and Williamson J K (1996), “Isolation of Escherichia coli from raw meat products”, Letters in Applied Microbiology, 23, p 317 – 321 21 Buchanan R L and Edelson S G (1996), “Culturing enterohemorrhagic Escherichia coli in the presence and absence of glucose as a simple means of evaluating the acid tolerance of stationery-phase cells”, Applied and Environmental Microbiology, 62 (11), p 4009 – 4013 22 Carter G R., Chengappa M M and Rober T S A W (1995), Essentials of veterinary Microbiology, Williams and Wikkins, Rose tree corporate Center building 21400 North providence Rd, Suite 5025 Media PA 19063-2043, A waverly Company Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 75 23 Carlton L Gyles (2004), Pathogenesis, epidemiology, and control of VTEC infection in the cattle industry, 23rd World Buiatrics Congress, Quebec city, Canada 24 Cray W C., Thomas L A., Schneider R A and Moon H W (1996), “Virulence attributes of Escherichia coli from dairy heifer feces”, Veterinary Microbiology, 53 (3-4), p 467 – 474 25 Donnenberg M S., Tzipori S., Mc Kee M L., O’Brien A D., Alroy J and Kaper J B (1993), “The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model”, Journal of Clinical Investigation, 92, p 1418 – 1424 26 Doyle M P and Padhye V V (1989), “Escherichia coli”, Foodborn bacterial pathogens, Marcel Dekker, Inc., New York, p 235 – 281 27 Dytoc M., Soni R., Cockerill III F., de Azacedo J., Louie M., Brunton J and Sherman P (1993), “Multiple determinants of Verotoxin-producing Escherichia coli O157:H7 attachment-effacement”, Infection and Immunity, Vol 61 No 8, p 3382 – 3391 28 Fairbrother J M., Bestchinger H U., Nielsen O N and Pohlenz J F (1992), Escherichia coli infections diseases of swine, 7th edition, Wolfe publishing Ltd., Australian, p 489 – 497 29 Faith N G., Shere J A., Brosch R., Arnold K W., Ansay S E., Lee M S., Luchansky J B and Kaspar C W (1996), “Prevalence and clonal nature of Escherichia coli O157:H7 on dairy farms in Wisconsin”, Appiled and Environmental Microbiology, 62 (5), p 1519 – 1525 30 Gannon V P J., R K King, E J Thomas (1992), “Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction”, Appl Environ Microbiol, 58, p 3809 – 3815 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 76 31 Garber L P., Wells S J., Hancock D D., Doyle M P., Tuttle J., Shere J A and Zhao T (1995), “Risk factors for fecal shedding of Escherichia coli O157:H7 in dairy calves”, Journal of American Veterinary Medicine Association, 207 (1), p 46 – 49 32 Gross W G (1994), Disease due to Escherichia coli in poultry In Escherichia coli in Dosmetic animals and human, Edited by C L Gyles, Wallingford, England: CAB International, p 237 – 259 33 Gyles C.L and Fairbrother J.M (2004), Escherichia coli In: Pathogens of bacterial infection in animal, Editor: Gyles C.L, Prescott J.F, Songer J.G and Thoen C.O Blackwill publishing, p 193 – 214 34 Hancock D D., Besser T E., Kinsel M L., Tarr P I., Rice D H and Paros M G (1994), “The prevalence of Escherichia coli O157:H7 in dairy and beef cattle in Washington state”, Epidemiology and Infection, 113, p 199 – 207 35 Hanna Evelina Sidjabat-Tambunan (1997), Verocytotoxin producing Escherichia coli in food-producing animals, The degree of master of veterinary science, The University of Queensland, Australia 36 Helge Karch and Thomas Meyer (1989), “Single primer pair for amplifying segments of distinct Shiga-like-toxin genes by polymerase chain reaction”, Journal of clinical microbiology, Vol 27, No 12, p 2751 – 2757 37 Vũ Kh c Hùng (2004), Escherichia coli – prevalence and comparison of virulence factors in strains isolated from pigs with diarrhea in Slovak Republic, The degree of Doctor, Slovak Republic 38 Irino K., Kato M.A.M.F., Vaz T.M.I., Ramos I.I., Souza M.A.C., Cruz A.S., Gomes T.A.T., Vieira M.A.M and Guth B.E.C (2005), “Serotyps and virulence markers of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 77 isolated from dairy cattle in Sao Paulo state, Brazil”, Veterinary Microbiology, 105, p 29 – 36 39 Jenkins C., G A Willshaw, J Evans, T Cheasty, H Chart, D.J Shaw, G Dougan, G Frankel and H.R Smith (2003), “Subtyping of virulence genes in verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) other than serogroup O157 associated with disease in the United Kingdom”, Journal of Medical Microbiology, 52, p 941 – 947 40 Jorge Blanco, Azucena Mora, Miguel Blanco, Jesus E Blanco, Ghizlane Dahbi, Cecilia Lopez, Paula Justel, Maria Pilar Alonso, Aurora Echeita, Maria Isabel Bernardez and Enrique A Gonzalez (2007), “Serotyps, virulence genes and intimin typs os Shiga toxin (verocytotoxin)producing Escherichia coli isolates from minced beef in Lugo (Spain) from 1995 through 2003”, BMC Microbiology, 7:13, p – 41 Karch H., Heesemann J., Laufs R., O’Brien A D., Tacket C O and Levine M M (1987), “A plasmid of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 is required for expression of a new fimbrial antigen and for adhesion to epithelial cells”, Infection and Immunity, 55 (2), p 455 – 461 42 Konowalchuk J., Speirs J I and Stavric S (1977), “Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli”, Infection and Immunity, 18 (3), p 775 – 779 43 Kudva I T., Hatfield P G and Hovde C J (1997), “Characterization of Escherichia coli O157:H7 and other shiga toxin-producing E coli serotyps isolated from sheep”, Journal of Clinical Microbiology, 35 (4), p 892 – 899 44 Lai King Ng., Matthew W Gilmoiur, Tyler Cote, Jamie Munro, Linda Chui, John Wylie, Judith Issac-Renton, Greg Horsman, Dobryan M Tracz and Ashleigh Andrysiak (2005), “Multilocus sequence typing of Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 78 Escherichia coli O26:H11 isolates carrying stx in Canada does not identify genetic diversity”, Journal of Clinical Microbiology, Vol 43, No 10, p 5319 – 5323 45 Lake R and Cresscy A.H (2002), Rick profile: Shiga toxin-producing Escherichia coli in red meat and meat products, Institute of Environment Science & Research Limited Christchurch Scienve Centre, New Zealand 46 Levent Akkaya, Halil Ibrahim Atabay, Beytullah Kenar and Mustafa Alisarli (2006), “Prevalence of verotoxigenic Escherichia coli O157:H7 on chicken carcasses sold in Turkey”, Bull Vet Inst Pulawy, 50, p 513 – 516 47 Lior H (1994), “Classification of Escherichia coli”, In: Gyles C L (ed.) Escherichia coli in domestic animals and humans, CAB International, Wallingford, p 31 – 72 48 Louie M., de Azavedo J., Clarke R., Borczyk A., Lior H., Richter M and Brunton J (1994), “Sequence heterogeneity of the eae gene and detection of verotoxin-producing Escherichia coli using serotyp-specific primers”, Epidemiology and Infection, 112, p 449 – 461 49 MacDonald K L and Osterholm M T (1993), “The emergence of Escherichia coli O157:H7 infection in the United States”, Journal of American Medical Association, 269 (17), p 2264 – 2266 50 Mainil J G., Jacquemin E R., Kaeckenbeeck A E and Pohl P H (1993), “Association between the effacing (eae) gene and the Shiga-like toxin-encoding genes in Escherichia coli isolates from cattle”, American Journal of Veterinary Research, 54 (7), p 1064 – 1067 51 Matar G M., Abdo D., Khneisser I., Youssef M., Zouheiry H., Abdelnour G and Harakeh H S (2002), “The multiplex PCR based detection and Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 79 genotyping of diarrhoeagenic Escherichia coli in diarrhoeal stools”,Ann Trop Med Parasitol, 96 (3), p 317 - 324 52 McKee M L and O’Brien A D (1996), “Truncated enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157:H7 Intimin (EaeA) fusion proteins promote adherence of EHEC strains to HEp-2 cells”, Infection and Immunity, 64 (6), p 2225 – 2233 53 McMaster C., Roch E.A., Willshaw G.A., Doherty A., Kinnear W and Cheasty (2001), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli serotype O26:H11 outbreak in an Irish Creche”, Eur J Clin Microbiol Infect Dis., 20(6), p 430 - 432 54 McPaeke S J W., Smyth J A and Ball H J (2005), “Characterisation of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) associated with colisepticaemia compared to faecal isolates from healthy birds”, Veterinary Microbiology, 110, p 245 – 253 55 Mechie S C., Chapman P A and Siddons C A (1997), “A fifteen month study of Escherichia coli O157:H7 in dairy herd”, Epidemiology and Infection, 118, p 17 – 25 56 Meng J., Zhao S., Doyle M P., Mitchell S E and Kresovich S (1996), “Polymerase chain reaction for detecting Escherichia coli O157:H7”, International Journal of Food Microbiology, 32, p 103 – 113 57 Meng J., Zhao S., Doyle M P., Mitchell S E and Kresovich S (1997), “A multiplex PCR for identifying Shiga-like toxin-producing Escherichia coli O157:H7”, Letters in Applied Microbiology, 24, p 172 – 176 58 Mohammad A Islam, Abdus S Mondol, Enne de Boer, Rijkelt R Beumer, Marcel H Zwietering, Kaisar A Talukder and Annet E Heuvelink (2008), “Prevalence and Genetic Characterization of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Isolates from Slaughtered Animals in Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 80 Bangladesh”, Applied and environmental microbiology, Vol 74, No 17, p 5414–5421 59 Montenegro M A., Bulte M., Trumpf T., Aleksic S., Reuter G., Bulling E and Helmuth R (1990), “Detection and characterization of fecal verotoxin-producing Escherichia coli from healthy cattle”, Journal of Clinical Microbiology, 28 (6), p 1417 – 1421 60 Paton A W., J C Paton, P N Goldwater, P A Manning (1993), “Direct detection of Escherichia coli Shiga-like toxin genes in primary fecal cultures using the polymerase chain reaction”, J Clin Microbiol, 31, p 3063 – 3067 61 Paton J C and A W Paton (1998), “Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections”, Clin Microbiol Rev., 11, p 450 – 479 62 Paton J C and A W Paton (2002), “Direct detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by multiplex PCR for stx1, stx2, eae, ehxA and saa”, Journal of clinical microbiology, Vol 40, No 1, p 271 – 274 63 Paton A W., Ratcliff R M., Doyle R M., Seymour-Murray J., Davos D., Lanser J A and Paton J C (1996), “Molecular microbiological investigation of an outbreak of hemolytic-uremic syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin-producing Escherichia coli”, Journal of Clinical Microbiology, 34 (7), p 1622 – 1627 64 P Alexa, L Konstantinova, Z Sramkova-Zajacova (2011), “Faecal shedding of verotoxigenic Escherichia coli in cattle in the Czech Republic”, Veterinarni Medicina, 56 (4), p 149 – 155 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 81 65 Peiris J.S.M., P.H.M Leung, W.C Yam and W.W.S Ng (2001), “The prevalence and characterization of verotoxin-producing Escherichia coli isolated from cattle and pigs in an abattoir in Hong Kong”, Epidemiol Infect., 126, p 173 – 179 66 Pourbakhsh S., Dho-Moulin M., Bree A., Desautels C., Martineau-Doize B and Fairbrother J M (1997), “Localization of the in vivo expression of P and F1 fimbriae in chickens experimentally inoculated with pathogenic Escherichia coli”, Microbiol Pathog., 22, p 331 – 341 67 Pryor W., Hodson E., McIntyre P and Bettelheim K A (1990), “Toxigenic Escherichia coli in haemolytic ureamic syndrome” , The Medical Journal of Australia, 152, p 221 – 222 68 Rasmussen M A., Cray W C Jr., Casey T A and Whipp S C (1993), “Rumen contents as a reservoir of enterohemorrhagic Escherichia coli”, FEMS Microbiology Letters, 114, p 79 – 84 69 Saiki R K., Gelfand D H., Stoffel S., Scharf S J., Higuchi R., Horn G T., Mullis K B and Erlich H A (1987), “Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase”, Science, 239, p 487 – 491 70 Samadpour M., Onerth J E., Liston J., Tran N Nguyen D., Whittam T S., Wilson R A and Tarr P I (1994), “Occurrence of Shiga-like toxin producing Escherichia coli in retail fresh seafood, beef, lamb, pork and poultry from grocery stores in Seattle, Washington”, Applied and Environmental Microbiology, 60 (3), p 1038 – 1040 71 Sandhu K S., Clarke R C., McFadden K., Brouwer A., Louie M., Wilson J., Lior H and Gyles C L (1996), Prevalence of the eaeA gene in verotoxigenic Escherichia coli strains from dairy cattle in Southwest Ontario Epidemiology and Infection, 116, p -7 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 82 72 Schmidt H., Rusmann H., Schwarzkoft A., Aleksic S., Heesemann J and Karch H (1994), “Prevalence of attaching and effacing Escherichia coli in stool samples from patients and controls”, Zentrablatt fur Bakteriologie, 281 (2), p 201 – 213 73 Schmidt H., Beutin L and Karch H (1995), “Molecular analysis of the plasmid-encoded hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933”, Infection and Immunity, 63 (3), p 1055 – 1061 74 Stein P E, Boodhoo A., Tyrrell G J., Brunton J L and Read R J (1992), “cvCrystal structure of the cell-binding B oligomer of verotoxin-1 from E coli”, Nature (London), 355, p 748 – 750 75 Takeda Y (1995), “Shiga and Shiga-like (Vero) toxins”, Bacterial toxins and virulence factors in disease (Edited by: Moss J., Iglewski B., Vaughan M and Tu A T ), Marcel Dekker Inc., p 313 – 326 76 Tesh V L., Burris J A., Owens J W., Gordon V M., Wadolkowski E A., O’Brien A D and Samuel J E (1993), “Comparison of the relative toxicities of Shiga-like toxins typ I and typ II for mice”, Infection and Immunity, 61, p 3392 – 3402 77 Thomas A., Cheasty T., Frost J A., Chart H., Smith H R and Rowe B (1996), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli, particularly serogroup O157, associated with human infections in England and Wales: 1992 – 4”, Epidemiology and Infection, 117, p – 10 78 ð Ng c Thúy (2004), The significance of Enterotoxigenic E coli as a cause of pre-weaning piglet diarrhoea in North VietNam, The degree of Doctor of philosophy, The University of Queensland, Australia 79 Tozzi A E., Niccolini A., Caprioli A., Luzzi I., Montini G., Zacchello G., Gianviti A., Principato F and Rizzoni G (1994), “A community outbreak of haemolytic-uraemic syndrome in children occurring in a large area of Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 83 Northern Italy over a period of several months”, Epidemiology and Infection, 113, p 209 – 219 80 Wachsmuth (1994), “Summary: public health, epidemiology, food safety, laboratory diagnosis”, Recent advances in Verocytotoxin-producing Escherichia coli infection, Karmali M A and Goglio A G (eds.), Elsevier, Amsterdam, p -6 81 Waters J R., Sharp J C M and Dev V J (1994), “Infection caused by Escherichia coli O157:H7 in Alberta, Canada and in Scotland: a five year review, 1987 – 1991”, Clinical Infectious Disease, 19, p 834 – 843 82 Wieler L H., Vieler E., Erpenstein C., Schlapp T., Steinruck H., Bauerfeind R., Byomi A and Baljer G (1996), “Shiga toxin-producing Escherichia coli strains from bovines association of adhesion with carriage of eae and other genes”, Journal of Clinical Microbiology, 34 (12), p 2980 – 2984 83 Willshaw G A., Smith H R., Roberts D., Thirlwell J., Cheasty T and Rowe B (1993), “Examination of raw beef products for the presence of verocytotoxin producing Escherichia coli, particularly those of serogroup O157”, Journal of Applied Bacteriology, 75, p 420 – 426 84 Willshaw G.A., Cheasty T., Smith H.R., O'Brien S.J and Adak G.K (2001), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) O157 and other VTEC from human infections in England and Wales: 1995-1998”, J Med Microbiol, 50 (2), p 135 – 142 85 Winkle S M., Refai M and Rhode R (1972), “On the antigenic relationship of Vibrio cholera to Enterobacteriaceae”, Annales de L’institut Pastuer, 123, p 775 – 781 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 84 86 Xu Jian-Guo, Cheng Bo-Kun and Jing Hual-Qi (1999), “Escherichia coli O157:H7 and Shiga like-toxin-producing Escherichia coli in China”, World Journal of Gastroenterology, ISSN 1007-9327 87 Yu J and Kapper J B (1992), “Cloning and characterization of the eae gene of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7”, Molecular biology, (3), p 411 – 417 88 Zhao T., Doyle M P., Shere J and Garber L (1995), “Prevalence of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in a survey of a dairy herds”, Applied and Environmental Microbiology, 61 (4), p 1290 – 1293 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i - Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 85 ... ? ?Xây d ng quy trình xác đ nh vi khu n Verotoxigenic Escherichia coli th t b ng k thu t PCR (Polymerase chain reaction) ” Nghiên c u cho phép xác ñ nh nhanh xác tiêu chu n vi sinh đ i v i vi khu n... t tên vi khu n Bacterium coli commune, sau nhi u l n ñ i tên, vào năm 1919, vi khu n ñư c g i v i m t tên th ng nh t Escherichia coli, vi t t t E coli T đ n nay, E coli đư c xác đ nh lồi vi khu... Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p vi 3.2.2 K t qu xác ñ nh ñ nh y ñ ñ c hi u c a phương pháp PCR dùng ñ xác ñ nh VTEC m u th t s ch 55 3.3 Quy trình xác đ nh s có m t c a vi khu
