Đang tải... (xem toàn văn)
Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất enzyme celllulase từ nấm mốc - Chương 3.
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU36 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Nguyên liệu 3.1.1.Nguồn carbon và cách xử lý 3.1.1.1.Bã mía Rửa sạch, phơi khô 2-3 ngày. Sau đó cắt nhỏ, xay, cho qua rây 0,1 và 0,05 lấy phần trên rây 0,05mm.3.1.1.2.Rơm Xử lý giống như bã mía.3.1.1.3.Mùn cưaDo kích thước mùn cưa nhỏ nên ta chỉ cần phơi khô và rây để lựa chọn kích thước hợp lý.Nguyên liệu sau khi rây được ngâm trong dung dòch NaOH 1% với tỉ lệ 1:10 trong 2 giờ. Sau đó hấp tiệt trùng ở 1210C, 1at trong 15 phút. Lọc rửa nguyên liệu bằng nước cất đến khi dung dòch rửa trung tính (pH=7). Kế đến ta vắt kiệt và sấy khô ở 60-700C. 3.1.2.Hóa chất sử dụng o NaOH 1% dùng để xử lý nguyên liệu.o NaOH 1N chỉnh pHo HCl 1N chỉnh pHo DNSo NaCl 1%o NaNO3o KClo FeSO4.7H2Oo MgSO4.7H2Oo K2HPO4.3H2O37 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUo Peptono Agaro Saccharoseo Conggo đỏo Dung dòch đệm photphat 0.5 M3.1.3.Dụng cụ thí nghiệm o Máy đo pHo Máy so màu o Máy lắco Câno Tủ sấy, tủ ấm và tủ lạnh.o Bể điều nhiệt3.1.4.Các loại môi trường sử dụng 3.1.4.1Môi trường carrot-potato:Thành phần môi trường:o Khoai tây: 2%o Cà rốt: 2%o Agar: 2%o CMC: 1%o Nước cấtĐầu tiên khoai tây và cà rốt lát mỏng sau đó nấu 1 giờ trong ½ lượng nước cất, lọc lấy dòch lọc. Các thành phần khác được nấu trong lượng nước cất còn lại đến khi tan hoàn toàn. Trộn 2 thành phần lại và tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút.Môi trường carrot-potato được dùng để giữ giống nấm mốc.38 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1.4.2Môi trường Czapek (Dox) (CZ)- Czapek stock solution A 50ml- Czapek stock solution B 50ml- Nước cất: 900mlThành phần A: NaNO340gKCl 10gMgSO4.7H2O 10gFeSO4.7H2O 0.2gNước cất: 1000mlThành phần B: K2HPO420gNước cất: 1000mlMôi trường A và B được trữ lạnh. Môi trường CZ dùng để nuôi cấy nấm mốc trong môi trường lỏng.3.1.4.3Môi trường maltMôi trường này được sử dụng làm môi trường để nấm mốc sinh trưởng và phát triển tạo bào tử. Từ đó ta có thể lấy bào tử để nuôi cấy trong môi trường lỏng thu nhận enzym.3.2 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống Môi trường được chuẩn bò đổ vào ống nghiệm (khoảng ¼ ống nghiệm), tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó để nghiêng 450 cho đến khi thạch đông.Dùng que cấy nhọn cấy nấm mốc từ ống giống sang môi trường thạch nghiêng. Để ở 30-400C trong tủ ấm từ 5 ngày. Sau đó bảo quản lạnh <40C.39 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.3 Phương pháp nuôi cấy nấm mốc tạo enzymMôi trường sử dụng ở đây là môi trường CZ. Cho 100ml môi trường vào erlen 250 ml, sau đó đem tiệt trùng. Dùng 10ml nước cất vô khuẩn cho vào ống giống trưởng thành. Sau đó lắc để rơi bào tử nấm mốc. Hút 1ml cho vào môi trường nuôi cấy. Sau đó môi trường nuôi cấy được để trên máy lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ môi trường. đây ta nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy chìm nên việc lắc được tiến hành liên tục nhằm mục đích hòa tan oxy vào môi trường tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển.3.4 Phương pháp nghiên cứu3.4.1 Trình tự tiến hành thí nghiệm Bước 1: Chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp enzym cellulase với hoạt tính cao nhất. Ta khảo sát 9 loài: A.Niger, A.awamori, A.aculactum, A oryzae, T.konigii, T.hazianum, T.viride, P.citrinum, Rhizopus sp.Bước 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase của nấm mốc.Bước 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase của nấm mốc.Bước 4: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzym của nấm mốc.Bước 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzym cellulase.Bước 6: Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym cellulase.Bước 7: Thử ứng dụng enzym cellulase thủy phân cơ chất rơm.3.4.2 Thuyết minh quá trình thí nghiệm 3.4.2.1Bước 1: Chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp enzym cellulase với hoạt tính cao nhất40 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUTrong bước này ta tiến hành 2 thí nghiệm.Thí nghiệm 1: 9 loài nấm mốc A.Niger, A.awamori, A.aculactum, A oryzae, T.konigii, T.hazianum, T.viride, P.citrinum, Rhizopus sp. được nuôi trong môi trường sinh tổng hợp enzym như trong phần 3.3 với nguồn carbon là CMC 1% có bổ sung pepton 0,5%. Sau thời gian 48 giờ, ta lấy một ít dòch từ môi trường lỏng đem lọc vô trùng và tiến hành xác đònh hoạt tính như trong phần 3.5.1. Đây là phương pháp thử nhanh để chọn loài nấm mốc có hoạt tính enzym, sau đó ta cần dùng phương pháp khác để chọn ra loài có hoạt tính enzym cellulase cao nhất.Thí nghiệm 2: từ những loài đã chọn trong thí nghiệm 1 ta tiếp tục nuôi trong môi trường sinh tổng hợp enzym như trong thí nghiệm 1. Sau mỗi ngày ta lấy một ít dòch trong môi trường đem lọc vô trùng, sau đó tiến hành xác đònh hoạt tính enzym CMCase theo phương pháp đo lượng đường khử tạo thành. Chọn ra loài nấm mốc có hoạt tính enzym cao nhất. Thí nghiệm được tiến hành trong 5 ngày.3.4.2.2Bước 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase của nấm mốc.Thí nghiệm 3: Với loài nấm mốc đã chọn ở thí nghiệm 2, ta tiếp tục nuôi cấy trong môi trường 3.3. Ta khảo sát ở 3 nguồn carbon là bã mía, mùn cưa và rơm với hàm lượng 1%. Nguồn nitơ bổ sung là pepton 0,5%. Sau 4 ngày đo hoạt tính CMCase. Sau đó ta chọn nguồn carbon có hoạt tính CMCase cao nhất.Thí nghiệm 4: với nguồn carbon đã chọn ở thí nghiệm 3, tiến hành nuôi cấy giống như trên ở các hàm lượng nguồn carbon là 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5. Lượng pepton bổ sung là 0,5%. Thời gian đo hoạt tính CMCase là 4 ngày. Chọn ra hàm lượng nguồn carbon tốt nhất.3.4.2.3Bước 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase của nấm mốc.Thí nghiệm 5: Nuôi cấy nấm mốc trong môi trường ở phần 2.6 với nguồn carbon và hàm lượng đã chọn ở thí nghiệm trên. Ta thay đổi nguồn nitơ bổ sung vào môi trường. ƠÛ đây ta tiến hành 3 mẫu: 1 mẫu bổ sung pepton, 1 mẫu bổ sung yeast extract và 1 mẫu không bổ sung cả 2 thành phần trên. Hàm lượng bổ sung là 0,5%.41 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUKết quả đo hoạt tính CMCase sau thời gian là 4 ngày.Chọn ra nguồn bổ sung cho hoạt tính enzym cao nhất.Thí nghiệm 6: mục đích là xác đònh hàm lượng nguồn nitơ bổ sung cho hoạt tính enzym cao nhất. Ta sử dụng nguồn nitơ này bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9%. Sau 4 ngày đo hoạt tính CMCase chọn ra hàm lượng tốt nhất.3.4.2.4Bước 4: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzym của nấm mốc.Thí nghiệm 7: Sử dụng các điều kiện tối ưu như trong các thí nghiệm trên, nhưng môi trường nuôi cấy được điều chỉnh ở các pH= 3, 4, 5, 7, 8. ƠÛ đây ta dùng NaOH và HCl để chỉnh pH. Thí nghiệm được khảo sát trong khoảng thời gian 7 ngày. Sau mỗi ngày ta đều lấy dòch lọc để đo hoạt tính CMCase. Chọn pH tối ưu và thời gian tối ưu tương ứng với pH đó.3.4.2.5Bước 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzym cellulaseThí nghiệm 8: Nhiệt độ ở đây không phải là nhiệt độ nuôi cấy mà là nhiệt độ trong phương pháp xác đònh hoạt tính enzym CMCase. Môi trường nuôi cấy sử dụng tất cả các điều kiện tối ưu trên. Khi xác đònh hoạt tính CMCase ta để enzym tác dụng ở các nhiệt độ 40, 45, 50, 55, 60. Chọn ra nhiệt độ tối ưu cho enzym cellulase.3.4.2.6Bước 6: Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym cellulase.Thí nghiệm 9: sử dụng tất cả các điều kiện tối ưu trên. Đo hoạt tính CMCase với các giá trò pH 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 ( dùng dung dòch đệm photphat). Chọn giá trò pH tối ưu.3.4.2.7Bước 7: Thử ứng dụng enzym cellulase thủy phân cơ chất rơm.Thí nghiệm 10: cơ chất ở đây đã được tiền xử lý trước. Với các điều kiện tối ưu đã khảo sát ở trên, ta nuôi cấy nấm mốc sau đó lọc lấy dòch lọc đem thủy phân cơ chất rơm. Cách tiến hành giống như trong phương pháp xác đònh hoạt tính CMCase nhưng thay nguồn cơ chất CMC 1% bằng rơm với 3 hàm lượng khảo sát là 5%, 10% và 20% (w/v).42 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUHệ số thủy phân A được tính bằng tỉ số lượng đường tạo thành khi dùng 1ml dòch môi trường nuôi cấy để thủy phân cơ chất trong thời gian 1h trên lượng cơ chất sử dụng để thủy phân. Hệ số này được tính ra %. 3.5 Trình tự tiến hành xác đònh hoạt tính enzym cellulase[18]3.5.1 Phương pháp thử nhanh bằng cách đo đường kính vòng thủy phân Nguyên lý: khi enzym tác dụng lên cellulose trong môi trường thạch, cơ chất bò phân giải làm độ đục môi trường giảm đi, môi trường trở nên trong suốt. Độ trong suốt tỉ lệ vơi độ hoạt động của enzym.Cách tiến hành: Chuẩn bò môi trường có chứa 2% agar, 1% CMC trong dung dòch đệm photphat 0,1 M, pH=5 rồi phân phối vào đóa petri. Sau khi thạch đông ta khoét lỗ nhỏ trên thạch có đường kính 10mm. Lấy một ít dòch từ môi trường lỏng đem lọc vô trùng và lấy 50µl dòch lọc cho vào lỗ trên hộp petri. Để 400C sau thời gian 48giờ. Sau đó cho 5ml dòch Congo đỏ 1% vào hộp petri trong thời gian 15 phút. Gạn bỏ dòch Congo, cho thêm 5ml dung dòch NaCl 1M vào và tráng đều. Đợi 15 phút. Vùng màu vàng trên nền đỏ tía là chỗ enzym tác dụng.3.5.2 Phương pháp xác đònh hoạt tính CMCase bằng cách đo lượng đường khử tạo thành- Nguyên lý: khi enzym tác dụng trên cơ chất cellulose, dưới tác dụng của phức hệ enzym cellulase cơ chất bò phân giải tạo thành đường khử. Dùng phương pháp so màu DNS ta xác đònh được lượng đường khử tạo thành từ đó tính được hoạt độ của enzym.Hoạt độ enzym được tính bằng đơn vò UI/ml. Một UI được đònh nghóa là lượng enzym thủy phân cơ chất tạo thành 1µm glucose trong 1phút ở nhiệt độ thích hợp.- Cách tiến hành:Cách pha thuốc thử DNS:43 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUCho 1,6 g NaOH vào 20ml nước cất, khuấy đều. Cho tiếp 1g DNS vào. 30g Natri-Kali tactrat cho vào 50ml nước cất. Khuấy đều cho đến khi tan hoàn toàn. Trộn 2 thành phần lại sau đó đánh siêu âm đến khi DNS tan hết. Đònh mức 100ml.Để xác đònh hoạt tính enzym EG ta dùng cơ chất là CMC, còn để xác đònh hoạt tính enzym CBH ta dùng cơ chất là bông. Do EG tác dụng tốt trên cơ chất cellulose biến tính, còn CBH thì tác dụng tốt trên cơ chất cellulose kết tinh. Trình tự tiến hành: Đo hoạt tính enzym EG (còn được gọi là hoạt tính CMCase do dùng cơ chất CMC)Nấu CMC trong dung dòch đệm photphat 0,1M, pH=5 với nồng độ CMC 1% đến khi CMC tan hoàn toàn. Sau đó ta dùng dung dòch này làm cơ chất cho enzym tác dụng.Bảng 3.1- Lượng các chất cho vào trong quá trình thí nghiệm xác đònh hoạt tính CMCaseMẫu trắngMẫu 1Mẫu 2Chuẩn glucose 1% (ml)0,2 0,4 0,6 0,8 1Mẫu (ml) 1 1Cơ chất(ml)3 2,8 2,6 2,4 2,2 2 2 2DNS(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1Đầu tiên cho cơ chất phản ứng vào ống nghiệm, cho chuẩn glucose hoặc mẫu vào. Để ở 500C cho enzym tác dụng trong thời gian 20 phút. Sau đó cho DNS vào và đun cách thủy ở nhiệt độ sôi trong 5 phút. Làm nguội nhanh đến nhiệt độ phòng. Đo ở bước sóng 540nm.Do trong môi trường nuôi cấy có đường khử, vì vậy để xác đònh hoạt tính ta cần thêm mẫu đối chứng cho mỗi mẫu đo. Mẫu này có thành phần thêm vào giống như mẫu đo nhưng chỉ khác trình tự cho vào (Trong bảng là mẫu 1). Đối với mẫu 1 đầu 44 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUtiên ta cho dung dòch cơ chất vào, tiếp đó để ở 600C trong 20 phút, sau đó cho DNS vào, cho dòch mẫu vào. Đun cách thủy 5 phút giống như mẫu khác. Như vậy mẫu này thể hiện lượng đường khử còn lại trong môi trường nuôi cấy.45 . CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU36 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Nguyên liệu 3. 1.1.Nguồn carbon và cách xử lý 3. 1.1.1.Bã. trường carrot-potato được dùng để giữ giống nấm mốc. 38 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1.4.2Môi trường Czapek (Dox) (CZ )- Czapek stock