Gây rụng nhiều trứng và cấy truyền phôi R.G. Miller, G.J.Fawcett, B. Dunn, B.M. Burns Giới thiệu Cấy truyền phôi là một kỹ thuật lấy phôi từ đờng sinh dục của một bò cái (con cho phôi) và cấy vào đờng sinh dục của bò cái khác (con nhận phôi) để ở đó quá trình có chửa đợc hoàn thành. Gây rụng nhiều trứng Đây là một quá trình kích thích buồng trứng để tạo ra nhiều nang trứng rụng và rụng nhiều trứng hơn bình thờng. Để khai thác tiềm năng di truyền vợt trội của một con cái tốt bằng việc sử dụng cấy truyền phôi rõ ràng là phải thu đợc càng nhiều phôi càng tốt từ con cái đó. Vì bò bình thờng chỉ rụng một trứng sau mỗi lần động dục, đây là một quá trình không có hiệu quả. Có nhiều kỹ thuật để kích thích tăng số nang trứng có thể rụng trứng ở bò cái. Những ứng dụng của cấy truyền phôi Khi kết hợp với gây rụng nhiều trứng của con cho phôi kỹ thuật cấy chuyền phôi có những ứng dụng nh sau Tăng số đời con của những bò cái có tiềm năng di truyền siêu trội. Tăng tốc độ kiểm tra đời sau. Giảm khoảng cách thế hệ bằng cách gây rụng nhiều trứng của những bò cái hậu bị trớc lúc thành thục về tính và cấy phôi cho những con nhận đã trởng thành. Điều này có thể làm tăng tốc độ chọn lọc di truyền. Vận chuyển phôi từ nớc này sang nớc khác do đó có thể vợt qua đợc các vấn đề lây truyền bệnh tật và giảm thời gian kiểm dịch. Điều này cũng loại bỏ stress và giá vận chuyển gia súc sống. Tạo sinh đôi. Có thể thu phôi từ những bò cái vô sinh không có khả năng duy trì quá trình có chửa bình thờng. Cấy truyền phôi có thể đợc dùng nh một công cụ nghiên cứu. Chọn con cho phôi Bò cái sẽ đợc chọn bởi ông chủ vì ông ta biết đợc nó có giá trị di truyền cao hay nó có thể bị vô sinh. Phải ít nhất 2 tháng từ khi sinh bê lần cuối mới có thể thu phôi. Bò cái phải có cấu trúc và chức năng sinh sản bình thòng. Bò cái phải khỏe mạnh, thể trạng cơ thể tốt và tăng trọng. Chọn con nhận phôi Bò hậu bị hoặc những con bò còn ít tuổi. Bò phải có cấu trúc và chức năng sinh sản bình thòng. Bò phải đẻ ít nhất 2 tháng trớc đó Bò phải đủ trởng thành và cơ thể đủ lớn, do đó cần phải biết giống và loại phôi sẽ đợc cấy, bò phải có khả năng mang thai đến lúc đẻ và đẻ bình thờng. Bò phải không có bệnh tật và tăng trọng. Thu phôi Phôi đợc rửa lấy từ tử cung của bò cho phôi vào ngày thứ 6,7 hay 8 sau khi phối giống. Thu phôi đợc thực hiện bằng phơng pháp không phẫu thuật có sử dụng ống thông hai chiều, và phôi đợc tách ra khỏi dung dịch rửa bằng việc sử dụng các phin lọc phôi có bán sẵn. Con cho phôi đợc phong bế thần kinh tủy sống để loại bỏ sự co bóp của trực tràng trong lúc thu phôi. Dung dịch dùng để thu phôi đợc bán sẵn trong các túi nilon để dùng ngay. Albumin huyết thanh bò có thể đợc bổ xung để giảm nguy cơ phôi bị dính vào các dụng cụ thu phôi. Tử cung có thể đợc giội rửa bằng cách đặt ống thông vào thân tử cung và dội rửa thân tử cung và cả hai sừng tử cung cùng một lúc, hay đặt ống thông vào sừng tử cung, dội rửa một sừng tử cung, sau đó 164 lấy ống thông ra và đặt vào sừng tử cung khác và lặp lại kỹ thuật. Cần khoảng 500ml dung dịch giội rửa cho mỗi con cho và xoa bóp dung dịch trong tử cung để tách phôi khỏi thành tử cung vào dung dịch và sau đó dung dịch giội rửa đợc hút ngợc trở lại vào phễu lọc. Cấy phôi Phôi đợc cấy cho con nhận mà con nhận đó động dục càng gần với thời gian động dục của bò cho phôi càng tốt. Sai lệch 24 giờ có thể chấp nhận đợc. Con nhận cần phải đợc sờ khám trớc khi lấy phôi để kiểm tra xem nó có thể vàng hoạt động tốt không. Con nhận phải có chức năng sinh dục bình thờng và tăng trọng trong tháng trớc khi cấy phôi thì có thể đạt đợc tỷ lệ có chửa tốt. Phôi có thể đợc cấy bằng phơng pháp phẫu thuật hay không phẫu thuật. Cấy phôi không phẫu thuật bao gồm đa phôi vào cọng rạ 0,25ml, và dùng pipet cấy phôi có bán sẵn, đặt phôi vào đầu sừng tử cung tơng ứng với phía buồng trứng có thể vàng hoạt động. Nhìn chung, phong bế thần kinh tuỷ sống thờng đợc sử dụng trong cấy phôi không phẫu thuật để loại bỏ co bóp trực tràng và do đó cho phép đặt phôi chính xác hơn và ít gây tổn thơng hơn. Cấy phôi phẫu thuật đợc thực hiện thông qua vết cắt tơng ứng với phía buồng trứng có thể vàng chức năng. Phôi đợc cấy bằng ống thông nhỏ vào đầu sừng tử cung cùng phía. Chỗ cắt đợc gây mê cục bộ trong lúc phẫu thuật. Cấy phôi bằng phẫu thuật nhìn chung đợc thực hiện khi rất khó đa qua tử cung và kỹ thuật này cho phép chính xác hơn và ít tổn thơng hơn ở sừng tử cung. Vì thế nhiều con nhận hơn có thể đợc sử dụng thành công và nhìn chung tỷ lệ có chửa cao hơn. Tuy nhiên, kỹ thuật này tốn nhiều thời gian. Cấy phôi ở bò Bos Indicus Giới thiệu Cấy phôi ở bò Bos indicus không giống nh bò Bos taurus. Điều này chủ yếu do sự khác biệt về giải phẫu và sinh lý của hệ thống sinh sản giữa 2 loại bò này. Cổ tử cung ở một số bò Bos indicus dài, xoắn và việc này làm cho khó dẫn tinh và thu phôi. Động dục ở loại bò này ngắn hơn, độ mẫn cảm thấp hơn, và ở một số trờng hợp, động dục xuất hiện chủ yếu vào ban đêm. Thời gian rụng trứng sớm hơn so với động dục. Những điều này đã làm cho việc thu phôi kém hơn, tỷ lệ thụ tinh kém hơn và gây ra các vấn đề khác. Tuy nhiên, hiểu biết đầy đủ về các đặc điểm giải phẫu, sinh lý và hành vi của bò Bos indicus có thể cho phép thu đợc kết quả tơng tự nh với bò Bos taurus. Trớc khi bắt đầu gây rụng nhiều trứng ở một bò cái Bos indicus cho phôi cần phải bảo đảm chắc chắn rằng cổ tử cung có thể dẫn tinh và rửa thu phôi đợc. Cổ tử cung bị xoắn thờng xuất hiện ở bò già nhiều hơn so với bò còn ít tuổi hay bò hậu bị. Những bò cái cho phôi có cổ tử cung xoắn nhiều có thể rửa thu phôi bằng phẫu thuật. Bình thờng bò Bos indicus đợc coi là bò nhút nhát. Tuy nhiên, việc này có thể vợt qua đợc bằng cách thờng xuyên nuôi giữ chúng trong sân chuồng, sử dụng đực thiến có buộc dụng cụ đánh dấu và sử dụng dụng cụ phát hiện động dục ở bò cho phôi. Gây động dục đồng pha ở bò cho phôi để gây rụng nhiều trứng Nếu trong chơng trình cấy phôi có nhiều bò cho phôi, thì cần phải gây động dục đồng pha những con bò này. Những bò cho phôi đang ở ngày 8-14 của chu kỳ động dục có thể nhóm lại với nhau và bắt đầu tiến hành gây rụng nhiều trứng. Các phơng pháp sau đây thờng đợc sử dụng: Chu kỳ tự nhiên: Phải nhận biết đợc động dục của tất cả bò cho phôi và lựa chọn những con ở giữa ngày 8-14 của chu kỳ để đa vào chơng trình cấy phôi. Tiêm một liều prostaglandin: Phải nhận biết đợc động dục của tất cả bò cho phôi, loại bỏ những con ở ngày 3-4 của của kỳ và tiêm cho tất cả những con còn lại bằng một liều prostaglandin (PG) để gây động dục đồng pha. Tiêm 2 liều prostaglandin: 165 Tiêm tất cả bò cho bằng một liều PG ở ngày 1. Sau đó 11 ngày tiêm PG lần 2. Quan sát động dục trong 4-5 ngày. Bắt đầu gây rụng nhiều trứng 10 ngày sau khi động dục của đa số bò cho phôi. Synchromate-B: Đặt SMB ở ngày 1, prostaglandin vào sáng ngày 9 và rút SMB vào chiều cùng ngày. Quan sát động dục trong 3 ngày. Đa tất cả bò động dục vào chơng trình cấy phôi. Kiểm tra buồng trứng để gây rụng nhiều trứng Điều quan trọng là phải sờ khám buồng trứng của bò cho phôi một ngày trớc khi bắt đầu tiến hành gây rụng nhiều trứng để đảm bảo chắc chắn sự có mặt của thể vàng vì một số gia súc, mặc dầu có biểu hiện tất cả các triệu chứng động dục, nhng không rụng trứng. Hiện tợng này phổ biến ở bò Bos indicus hơn so với ở bò Bos taurus. Gây rụng nhiều trứng ở những gia súc kém nh thế sẽ dẫn đến không rụng trứng, tỷ lệ thu phôi kém và chất lợng phôi kém. Các loại hocmôn dùng gây rụng nhiều trứng: Folltropin: Bò già Bò non Bò hậu bị Ngày 1 sáng/chiều Ngày 2 sáng/chiều Ngày 3 sáng/chiều Ngày 4 sáng/chiều 3,0ml 2,5ml 2,0ml 1,5ml 2,5ml 2,0ml 1,5ml 1,0ml 2,0 ha y 1,8ml 1,5 ha y 1,3ml 1,0 ha y 0,8 ml 0,5 ha y 0,3ml Prostaglandin đợc tiêm vào ngày 3 hay ngày 4 vào buổi sáng và buổi chiều. Bò cho phôi đợc phối giống 12, 24 và 36 giờ sau khi động dục. Thu phôi 6-7 ngày sau khi động dục. Đông lạnh và giải đông phôi Glycerol 10% (1,4M) và Ethylene Glycol (E.G) 1,5M đều đợc dùng làm chất bảo vệ lạnh. Cả hai loại chất bảo vệ lạnh này đều đợc đóng trong lọ thuỷ tinh có nút cao xu trong EMCARE (môi trờng không đệm phosphate) hay môi trờng nuôi cấy trứng (OCM-môi trờng đệm phosphate). Cả hai loại đều đợc bổ xung 0,4% BSA và kháng sinh (Kanamycin). (Nghiên cứu gần đây ở RuaKura, New Zealand đã chứng minh rằng EMCARE, một hệ thống đệm ZWITTERION tốt hơn so với các hệ thống đệm PHOSPHATE đối với môi trờng nuôi giữ phôi trong thời gian vừa phải, và vì thế nhiều loại môi trờng EMCARE đợc khuyến cáo). 1. Đông lạnh và giải đông trong Glycerol i) Đông lạnh trong Glycerol Tổng thời gian phôi cần phải ở trong glycerol 10% trớc khi đa vào đông lạnh ở -5,5- 6,5 0 C là 15-30 phút ở nhiệt độ 20-25 0 C. (Độc tính có liên quan đến nhiệt độ, do đó nhiệt độ càng cao thì thời gian cân bằng càng ít hơn. Một điều nữa là cân bằng không nên thực hiện ở nhiệt độ dới 20 0 C). Hãy cài đặt máy đông lạnh và cọng rạ đợc dán nhãn trớc khi hút phôi từ môi trờng giữ phôi vào môi trờng đông lạnh. Đa phôi vào glycerol 10%, và bắt đầu đặt đồng hồ (hay chú ý đến thời gian). Đa phôi vào cọng rạ nh đã mô tả ở trên. Sau một thời gian tối thiểu 15 phút và tối đa 20-30 phút (phụ thuộc vào nhiệt độ), đặt cọng rạ vào máy đông lạnh ở = 5,50 - 6,5 0 C. Tạo đá sau 1 phút (thời gian không quan trọng, nhng thời gian cần thiết phải đủ lạnh để tạo đá). Tạo đá phía trên cột có phôi bởi vì đá không tạo bóng khí. Một số cọng rạ có thể tự tạo đá trong một số máy đông lạnh nhng đừng tin tởng vào điều này- thờng xuyên phải kiểm tra bằng tay nếu nghi ngờ. Rất dễ nhìn thấy sự hình thành đá (môi trờng biến thành màu trắng) nếu có đủ ánh sáng-hãy sử dụng ngọn nến nếu thấy cần thiết. Giữ trong 10 phút. Khi sử dụng glycerol làm chất bảo vệ lạnh, tốc độ làm lạnh từ - 0,3 0 C/phút 0,5 0 C/phút đến 34 0 C và -35 0 C sẽ cho kết quả tơng tự. Tốc độ làm lạnh - 0,5 0 C/phút đến -30 0 C cho kết quả tốt trong glycerol. Nhúng vào ni tơ lỏng ở nhiệt độ -30 0 C đến - 35 0 C. 166 167 dịch vụ nhân giống bò thịt chơng trình cấy chuyền phôi bò Tên gia chủ Điện thoại . Địa chỉ . . Tên bò .Số sổ theo dõi Ngày đẻ Xử lý Ngày động hớn Ngày chế độ xử lý Động hớn Đực giống . Ngày động hớn .Thời gian . Dẫn tinh . giờ sau khi bắt đầu chịu đực 2 ml Estrumate vào ngày v 2 ml Estrumate tiếp vào ngày . .lúc 1 giờ chiều Ghi lại chính xác thời gian bắt đầu chịu đực cho mỗi con nhận Chú ý: Tất cả các lần tiêm cho con cho và con nhận phải tiêm bắp bằng kim tiêm 18g x 11/2 con nhận chi tiết phối giống Ngày cấy chuyền Đa phôi vào cọng rạ để đông lạnh và cấy chuyển gián tiếp (ví dụ, trong Glycerol) Phần do nhà sản xuất Nút Khí FM (7cm) FM (0,5cm) Cột nhỏ môi trờng đông lạnh (FM) 0,5-1 cm Phôi Khí Nếu sử dụng PVC để gắn thì phải có một lợng nhỏ dung dịch ở đây để làm ớt PVC Nếu gắn bằng nhiệt thì để trống chỗ này để gắn Phải đa phôi vào cọng rạ làm sao cho phôi ở vị trí ít nhất là 1/3 cọng rạ kể từ phía dới (khi cọng rạ đợc để đứng trong máy đông lạnh), do đó phôi không chìm xuống phía dới và không bị đông lạnh ở trong phần bóng khí. Phôi phải ở phần giữa cột môi trờng do đó không đợc tạo đá trực tiếp lên phôi. Có thể nhìn thấy phôi trong cọng rạ bằng mắt thờng nếu góc chiếu sáng phía sau cọng rạ đúng vị trí. Điều này đã tiết kiệm thời gian khi xem xét vị trí của phôi có đúng không, và vị trí của phôi rất quan trọng để cho những kết quả thống nhất. Nếu phôi không ở đúng vị trí, hãy giữ cọng rạ thẳng đứng (hay lộn ngợc xuống) và điều đó cho phép phôi rơi xuống đúng vị trí. ii) Giải đông phôi đông lạnh trong glycerol Giải đông cũng phải đợc thực hiện ở nhiệt độ 20-30 0 C. Tuy nhhiên, khi không thể thì hãy nhớ rằng pha loãng chất bảo vệ lạnh chậm hơn ở nhiệt độ thấp hơn, và pha loãng nhanh hơn ở nhiệt độ cao hơn. Đĩa giải đông (môi trờng chuyên biệt) 1 2 Đĩa rửa (Môi tròng giữ phôi) Đĩa giải đông Lỗ A 5% glycerol, 0,5M Sucrose* 6 phút 30 giây (ở nhhiệt độ 20-25 0 C) Lỗ B 0% glycerol, 0,5M Sucrose** 6 phút 30 giây (ở nhhiệt độ 20-25 0 C) * Trộn một nửa và một nửa (Ví dụ 2ml và 2ml) 1M Sucrose và 10% Glycerol. ** Trộn một nửa và một nửa (Ví dụ 2ml và 2ml) 1M Sucrose và môi trờng giữ phôi. Khi trộn lẫn hãy bảo đảm để sử dụng phôi bằng syringe an toàn, và trộn kỹ. Giải đông Lấy ra khỏi ni tơ lỏng, giữ 10 giây và sau đó giữ ở 30 0 C trong 15-20 giây. Hãy cẩn thận lau sạch nớc khỏi cọng rạ. Khi giải đông, nếu cọng rạ đợc gắn bằng bột PVC, hãy bảo đảm rằng không có bột, hay dung dịch đã tiếp xúc với bột, đợc tiếp xúc với phôi. Bột PVC rất độc đối với phôi. Hẫy đẩy dung dịch trong cọng rạ vào một đĩa sạch 35mm, hãy định vị phôi và đặt vào lỗ A 6 phút, 30 giây, sau đó trong lỗ B 6 phút, 30 giây (ở nhiệt độ 20-25 C ) sau đó đa vào đĩa rửa. Đĩa rửa Khoảng 2ml môi trờng giữ phôi trong mỗi lỗ. Rửa khoảng 15 giây trong mỗi lỗ, sau đó giữ trong lỗ 4 và đa vào cọng rạ. Thay thế cọng rạ và dung dịch rửa sau khi mỗi đĩa đã xử lý khoảng 8 phôi. 168 Đa phôi vào cọng rạ để cấy sau khi giải đông Rửa mỗi cọng rạ 2 lần với môi trờng giữ phôi và kiểm tra đầu cuối của cọng rạ (vì phôi có thể bị mắc kẹt ở đó). Đầu sản xuất Bọt khí Phôi Bọt kh Nút Cắt 2-4mm nếu cần thiết ~5cm ~3cm ~2cm Hút khoảng 5cm môi trờng, sau đó khoảng 3- 4mm bóng khí, sau đó phôi ở trong cột khoảng 3cm, 3-4mm bóng khí khác, và sau đó hút đầy môi trờng vào cọng rạ. Cắt khoảng 3-4mm phần cuối của cọng rạ nếu thấy cần (một số súng đòi hỏi cọng rạ ngắn hơn). Hãy kiểm tra vị trí của phôi trong cọng rạ và đa vào súng cấy phôi có cả vỏ súng và vỏ nilon để giữ vệ sinh. Hãy giữ cọng rạ nằm ngang (do đó phôi không bị rơi vào bóng khí) trong găng tay dẫn tinh sạch và tránh ánh sáng chiếu trực tiếp vào phôi. Đông lạnh và giải đông trong Ethylene Glycol (E.G.) i) Đông lạnh trong Ethylene Glycol Ethylene Glycol (E.G.) có phân tử nhỏ hơn glycerol, do đó nó di chuyển vào trong tế bào phôi nhanh hơn. Vì điều này mà nó đợc coi là độc hơn. Chỉ nên giữ phôi trong E.G. tối đa là 10 phút trớc khi đa vào máy đông lạnh ở nhiệt độ - 5,5 đến - 6,5 0 C. Giữ 5-10 phút sau khi tạo đá sau đó đông lạnh với tốc độ - 0,5 0 C-0,6 0 C/phút đến -30 0 C đến - 32 0 C sau đó nhúng vào ni tơ lỏng. (Hãy nhớ rằng một khi phôi đã đợc đặt vào máy đông lạnh ở khoảng -6,0 0 C và đã tạo đá, độc tính của chất bảo vệ lạnh bị giảm xuống rất nhiều, do đó hãy sử dụng những hiểu biết này khi hết thời gian nếu bạn có rất nhiều phôi cần phải đa vào cọng rạ. Điều này đặc biệt có giá trị khi sử dụng ethylene glycol). Đa phôi vào cọng rạ để đông lạnh và cấy truyền trực tiếp (ví dụ trong Ethylene Glycol) Phôi đợc đa vào cọng rạ giống nh đa phôi vào cọng rạ để cấy (xem phần trên). Sử dụng cột môi trờng càng dài (khoảng 5cm) phía trên phôi thì cột phôi càng ngắn hơn (khoảng 3cm) khi đa phôi vào đông lạnh và cấy trực tiếp. Một lần nữa, vị trí đúng của phôi trong cột là rất quan trọng. ii) Giải đông phôi trong Ethylene Glycol để cấy truyền trực tiếp Điều qquan trọng là cần phải đa phôi vào trong cơ thể bò cái càng sớm càng tốt sau khi giải đông cọng rạ. Do đó hãy bảo đảm rằng có sẵn bò cái có thể vàng tốt trớc khi giải đông cọng rạ. Giải đông 10 giây trong không khí và khoảng 15 giây trong nớc 30 0 C. Hãy lau sạch nớc bám trên cọng rạ. Cắt đầu gắn cọng rạ (đối diện với đầu nút chận của nhà sản xuất) bằng kéo sạch đã đợc lau qua bằng cồn. Đa vào súng cấy phôi có vỏ súng, vỏ nilon vệ sinh và cấy. iii) Giải đông phôi đông lạnh trong Ethylene Glycol và cấy gián tiếp Có nhiều cách pha loãng ethylene glycol của phôi đông lạnh một khi chúng đợc lấy ra khỏi cọng rạ mà ở đó chúng đã đợc đông lạnh. Nhiều ngời sử dụng nhiều phơng pháp khác nhau. a) Giải đông thông qua Ethylene Glycol và Sucrose Đây là một phong pháp do Pacifivet khuyến cáo để cấy trực tiếp phôi đông lạnh trong E.G. Đĩa giải đông (môi trờng chuyên biệt) 1 2 Đĩa rửa (Môi tròng giữ phôi) Đĩa giải đông Lỗ A 0,75M E.G; 0,5M Sucrose* 6 phút 30 giây (ở 20-25 0 C) 169 Lỗ B 0% E.G; 0,5M sucrose** 6 phút 30 giây (ở 20-25 0 C) * Trộn một nửa và một nửa (Ví dụ 2ml và 2ml) 1M Sucrose và 1,5M Ethylene Glycol. ** Trộn một nửa và một nửa (Ví dụ 2ml và 2ml) 1M Sucrose và môi trờng giữ phôi. Khi trộn lẫn hãy bảo đảm để sử dụng phôi bằng syringe an toàn, và trộn kỹ. Giải đông Lấy ra khỏi ni tơ lỏng, giữ 10 giây và sau đó 30 0 C trong 15-20 giây. Hãy cẩn thận lau sạch nớc khỏi cọng rạ. Khi giải đông, nếu cọng rạ đợc gắn bằng bột PVC, hãy bảo đảm rằng không có bột, hay dung dịch bị tiếp xúc với bột, đợc tiếp xúc với phôi. Bột PVC rất độc với phôi. Hãy đẩy dung dịch trong cọng rạ vào một đĩa sạch 35mm, hãy định vị phôi và đặt vào lỗ A 6 phút, 30 giây, sau đó trong lỗ B 6 phút, 30 giây (ở nhiệt độ 20-25 C ) sau đó đa vào đĩa rửa. Đĩa rửa Khoảng 2ml môi trờng giữ phôi trong mỗi lỗ. Rửa khoảng 15 giây trong mỗi lỗ, sau đó giữ trong lỗ 4 và đa vào cọng rạ. Thay thế cọng rạ và dung dịch rửa sau khi mỗi đĩa đã xử lý khoảng 8 phôi. Đa phôi vào cọng rạ để cấy sau khi giải đông Rửa mỗi cọng rạ 2 lần với môi trờng giữ phôi và kiểm tra đầu cuối của cọng rạ (vì phôi có thể bị mắc kẹt ở đó). Phôi Nút chận của Bọt khí Bọt khí nhà sản xuất Cắt 2-4mm ~5cm ~3cm ~2cm nếu cần thiết Hút khoảng 5cm môi trờng, sau đó khoảng 3- 4mm bóng khí, sau đó phôi ở trong cột khoảng 3cm, 3-4mm bóng khí khác, và sau đó hút đầy môi trờng vào cọng rạ. Cắt khoảng 3-4mm phần cuối của cọng rạ nếu thấy cần (Một số súng đòi hỏi cọng rạ ngắn hơn). Hãy kiểm tra vị trí của phôi trong cọng rạ và đa vào súng cấy phôi có cả vỏ súng cấy phôi và vỏ nilon để giữ vệ sinh. Hãy giữ cọng rạ nằm ngang (do đó phôi không bị rơi vào bóng khí) trong găng tay dẫn tinh sạch và tránh ánh sáng chiếu trực tiếp vào phôi. b) Giải đông thông qua 0,5M Sucroses Khi đã đợc đẩy ra khỏi cọng ra, đa phôi vào 0,5M Sucrose 5-10 phút, sau đó vào môi trờng giữ phôi (rửa 4 lần), sau đó đa vào cọng rạ và đa đi cấy. c) Giải đông thông qua môi tròng giữ phôi Khi đã đẩy phôi ra khỏi cọng rạ, đa phôi trực tiếp vào môi tròng giữ phôi (rửa 4 lần), sau đó đa vào cọng rạ và cấy. sử dụng PMSG và kháng thể PMSG đơn dòng để gây rụng nhiều trứng trên bò Nhóm nghiên cứu Khoa Thú y Trờng Đại Học Queensland Dr. Michael McGowan Dr. Dan Jillella Sadahiro Sugiyama Nancy Johnston Mary Young Mục đích Tìm phơng pháp đơn giản nhng có hiệu quả để gây rụng nhiều trứng cho bò cái hậu bị Friesian. Gia súc thí nghiệm Thí nghiệm đợc tiến hành tại trại nghiên cứu bò sữa, Khoa thú y, Trờng Đại học Queensland. Trong thí nghiệm này đã dùng bò cái hậu bị có khối lợng trên 310 kg và đã có chu kỳ sinh dục. Bò đợc chăn thả trên đồng cỏ xen canh, bổ sung thêm rỉ mật, ngũ cốc và thức ăn tinh. Những nghiên cứu trớc đây để gây rụng nhiều trứng trên bò một năm tuổi tại trại nghiên cứu này Sử dụng quy trình dùng FSH-P chuẩn. Số lợng phôi có khả năng cấy trung bình là 4,0 0,72 Sử dụng phơng pháp tiêm FSH-P dới da 1 lần. 170 Số lợng phôi có khả năng cấy trung bình là 0,4 0.1 Ngày 3: 1 ml sáng và 1ml chiều Ngày 4: 1 ml sáng và 1ml chiều Xác định liều PMSG thích hợp - Kết quả nghiên cứu Liều lợng kích dục tố Những liều tiêm sau đây mang tính chất hớng dẫn. Neutra-PMSG là một dung dịch vô trùng của các kháng thể đơn dòng thuần khiết cao có khả năng kháng PMSG. Lọ chứa 6ml sẽ trung hoà lợng PMSG còn d thừa trong máu bò sau khi tiêm 3000 đơn vị (IU). Gonzalez và cộng sự (1994) báo cáo rằng một đơn vị Neutra-PMSG có tác dụng trung hoà 1 đơn vị (UI) PMSG. Phản ứng khác nhau của bò đối với gây rụng nhiều trứng bằng FSH phụ thuộc vào các yếu tố di truyền và môi trờng, đặc biệt là chế độ dinh dỡng. Liều FSH phù hợp cho từng con chỉ xác định sau một số lần gây rụng nhiều trứng và lấy phôi. Kết quả lấy phôi của các bò cùng huyết thống có thể là căn cứ để áp dụng về liều cho gây rụng nhiều trứng. Thời gian tiêm neutra-PMSG Khi Neutra-PMSG đợc tiêm vào bất kỳ thời điểm nào trớc lúc hàm lợng LH ở đỉnh cao nhất trớc rụng trứng, thì số lợng phôi có khả năng cấy có thể bị tác động ngợc lại. Lịch tiêm gây rụng nhiều trứng đã đợc thống nhất là 8 lần tiêm với liều giảm dần trong thời gian 4 ngày. Các lần tiêm cách nhau 12 tiếng vào thời gian 6-8 giờ sáng và 6-8 giờ chiều đều có kết quả nh nhau. Callesen và cộng sự (1990) đã báo cáo rằng, hàm lợng LH đạt tới đỉnh điểm 41 1 giờ sau khi tiêm PGF 2 đối với bò sữa hậu bị gây rụng nhiều trứng bằng PMSG. Còn Dielman và cộng sự (1993) lại cho rằng khoảng cách giữa tiêm PGF 2 và đỉnh điểm LH rất giao động (34-49 giờ đối với bò cái sữa hậu bị). Ông đã kết luận rằng Neutra-PMSG nên tiêm ngay sau đỉnh điểm LH. Ví dụ về lịch tiêm với liều 20 ml đợc chia ra nh sau: Ngày 1: 4 ml sáng và 4ml chiều Ngày 2: 3 ml sáng và 3ml chiều Ngày 3: 2 ml sáng và 2 ml chiều Ngày 4; 1 ml sáng và 1ml chiều Lịch tiêm với liều 15 ml đợc chia nh sau Ngày 1: 3 ml sáng và 3ml chiều Ngày 2: 2 ml sáng và 2ml chiều Xác định liều PMSG thích hợp Gonzalez và cs. (1994) tiến hành nghiên cứu về phản ứng của liều hocmôn ở bò thịt lai hậu bị Liều PMSG (UI) n Số thể vàng Số lợng phôi Phôi đủ tiêu chuẩn cấy 1.500 12 9,0 2,5 a 2,8 0,8 a 0,4 0.7 3.000 10 8,0 2,0 a 2,2 1,1 a 0,3 0.3 a 4.500 10 10,8 3,3 a 5,1 2,4 b 0,6 0.5 a Các tác giả Đan Mạch cho rằng bò hậu bị lai hớng sữa nên sử dụng liều từ 2250-2500 UI PMSG Tiêm neutra-PMSG 48 hoặc 60 giờ sau khi tiêm PGF 2 Gonzalez và cộng sự (1994) kết quả tiêm bò lai Hereford với liều 2500 I.U. PMSG Nhóm n Số thể vàng Trứng/Phôi Phôi đủ tiêu chuẩn cấy Đối chứng 8 7,8 1,8 a 4,5 0,7 a 2,1 1,0 a Anti- PMSG 48 giờ 8 13,9 4,0 ab 6,0 1,8 ab 4,0 1,6 ab Anti- PMSG 60 giờ 8 17,0 2,7 b 9,7 2,1 b 5,3 1,3 b McGowan và cộng sự (số liệu không công bố) bò tơ friesian một năm tuổi. TN Sử lý n Số thể vàng Số trứng/phôi Số phôi đủ tiêu chuẩn cấy I 2400 I.U. PMSG + nPMSG 46giờ 12 5,2 2,4 3,4 3,8 2,77 N/A II 2250 I.U. PMSG = nPMSG 60 giờ 5 7,0 2,1 7,5 6,6 5,8 7,0 8 8,1 4,2 9,0 5,2 6,7 4,0 171 So sánh kết quả gây rụng nhiều trứng giữa lô tiêm 2250 UI PMSG và neutra-PMSG 60 giờ với lô tiêm 11,6 ml FOLLTROIN-V McGowan và cộng sự (số liệu không công bố) bò tơ friesian một tuổi TN Xử lý N Số Thể vàng Số lợng phôi Số phôi đủ tiêu chuẩn cấy I PMSG + nPMSG 5 7,0 2,1 7,5 6,6 5,8 7,0 FSH 11,6 5,3 5,4 6,8 5,0 6,4 II PMSG + nPMSG 8 8,1 4,2 9,0 5,2 6,7 4,0 FSH 7 4,7 3,0 2,71 2,0 1,9 1,8 So sánh kết quả gây rụng nhiều trứng giữa cách sử lý PMSG một mình hay PMSG + neutra PMSG sau khi tiêm PGF2 60 giờ Gozalez và cộng sự (1994) - bò tơ lai hớng thịt Sử lý n Số lợng thể vàng Số lợng trứng không rụng Số lợng phôi Số lợng phôi đủ tiêu chuẩn cấy 1500 I.U. PMSG 12 9,0 2,5 a 9,4 3,4 a 2,8 0,8 a 0,4 0,7 a 1500 I.U. PMSG +nPMSG 10 11,2 1,8 a 4,0 1,2 b 5,3 1,1 2,4 0,8 b 3000 I.U. PMSG 10 8,0 2,0 a 16,5 4,7 a 2,2 1,1 a 0,3 0,3 a 3000 I.U.PMSG +nPMSG 11 16,3 2,0 b 4,7 0,7 b 10,1 1,2 b 3,2 1,0 b McGowan và cộng sự (số liệu không công bố) bò hậu bị friesian một năm tuổi Sử lý nSố lợng Thể vàng Số lợng trứng không rụng Số lợng phôi Số lợng phôi đủ tiêu chuẩn cấy 2250 I.U. PMSG 8 4,9 2,5 4,8 1,7 2,1 3,6 0,7 1,0 2250I.U.PMSG +nPMSG 8 6,4 4,5 5,1 2,2 3,9 3,9 2,00 2,9 Kết luận Kết quả nghiên cứu cho thấy gây rụng nhiều trứng bằng sử dụng PMSG và NEUTRA PMSG cho kết quả tốt hơn. Tuy nhiên kết quả cũng không làm giảm đợc sự biến động về phản ứng của bò đối với gây rụng nhiều trứng hoặc làm tăng kết quả về số lợng phôi đạt tiêu chuẩn cấy so với gây rụng nhiều trứng bằng sử dụng FSH tiêm nhiều lần. Xử lý kết hợp PMSG và NEUTRA PMSG để gây rụng nhiều trứng có thể tiến hành khi mà khả năng tiêm FSH hoặc các hócmôn khác không thực hiện đợc. 172 So sánh kết quả nghiên gây rụng nhiều trứng trên bò từ 1995 - 1997 Tất cả các thí nghiệm tiến hành đối với bò hậu bị Friseian 14 tháng tuổi tại trại nghiên cứu thú y của Trờng đại học Queensland. Thí nghiệm 1 : Liều tiêm 1800 UI PMSG Tổng số Trung bình Dao động Thể vàng 66 5.5 0-12 Trứng không rụng 13 0.92 0-5 Trứng/phôi 33 - - Phôi đủ tiêu chuẩn cấy 32 2.67 - Tỷ lệ bò cho 0-1 phôi không có số liệu Trọng lợng bò (kg) không có số liệu n = 12 Thí nghiệm 2 : 2400 I.U. PMSG + nPMSG sau khi tiêm PGF2 46 giờ Tổng số Trung bình Dao động SD Thể vàng 62 5.2 0-9 2.41 Số trứng không rụng 83 6.91 4-20 4.98 Trứng/phôi 41 3.41 0-12 3.82 Phôi đủ tiêu chuẩn cấy 32 2.67 - - Tỷ lệ bò cho từ 0-1 phôi 58% Trọng lợng bò (kg) Không có số liệu n = 12 Thí nghiệm 3 : (i) 2250 I.U. PMSG +nPMSG sau khi tiêm PGF2 60 giờ (ii) Tổng số 11,6 ml FSH, tiêm 2 lần /ngày Nhóm PMSG Nhóm FSH Tổng số Trung bình Biến động SD Tổng số Trung bình Biến động SD Thể vàng 28 7,0 4-9 4-9 58 11,6 5-18 5.26 Số trứng không rụng 45 11,25 2-19 2-19 11 2,2 0-8 3.49 Trứng/phôi 30 7,5 2-17 2-17 27 5,4 0-17 6.80 Phôi đủ tiêu chuẩn cấy 23 5,75 0-16 0-16 25 5,0 0-16 6.40 Tỷ lệ bò cho 0 - 1phôi 25% 40% Trọng lợng bò (kg) 367.5 (335-400) 368,5 (315-360) n = 4 n = 4 173 [...]... phần gây nên biến động cá thể gia súc, nhng chỉ có một vài yếu tố đó đợc xác định Các yếu tố này bao gồm giai đoạn của chu kỳ động dục mà ở thời điểm đó hormon đợc sử dụng, phơng pháp gây động dục đồng pha, trạng thái dinh dỡng, thời gian trong năm (ở các loài sinh sản theo mùa) và các yếu tố môi trờng khác, sự khác biệt di truyền và thời gian bán sinh (tốc độ đào thải trao đổi chất) của chế phẩm hormon... Tỷ lệ bò cho 0 - 1phôi Trọng lợng bò (kg) 71.4% 62.5% 384,3 (311-429) 385,5 (358-420) n=8 Cấy truyền phôi ở bò và sử dụng neutra PMSG Giới thiệu Cấy truyền phôi (ET) đã trở thành một biện pháp thông thờng và quan trọng trong nhân giống động vật, đặc biệt là ở bò, nh là một biện pháp có hiệu quả của việc tăng số đời con của một con cái có giá trị di truyền cao vì vậy tăng phần đóng góp của nó vào nguồn... có thời gian bán huỷ sinh học khoảng 57 ngày ở bò vì vậy chỉ cần một lần tiêm là đủ Hiện nay, phơng pháp gây rụng nhiều trứng ở bò đợc chấp nhận rộng rãi nhất là tiêm một liều duy nhất PMSG (2000-3000 U.I) vào giữa pha thể vàng của chu kỳ động dục Sau 48-72 giờ tiêm thêm một liều prostaglandin để làm tiêu thể vàng Sử dụng kháng huyết thanh PMSG Nh kết quả của nhiều nghiên cứu về PMSG trong những năn... trứng Neutra PMSG Dựa vào các tác dụng có lợi thấy khi sử dụng kháng PMSG trong việc xử lý gây rụng nhiều trứng, ngời ta đã sảnt xuất một loại kháng thể đơn dòng kháng PMSG Kháng thể đơn dòng kháng PMSG đợc tạo ra trong ống nghiệm có nhiều u điểm hơn so với kháng huyết thanh phức và so với kháng thể đơn dòng đợc tạo ra trong cơ thể - Chế phẩm tinh khiết hơn - Chế phẩm có một hoạt tính sinh học đợc tiêu... sẽ cho kết quả trung hoà hormôn ngoại lai tồn tại trong hệ tuần hoàn ở giai đoạn sau rụng trứng Với cách xử lý này các tác động bất lợi có thể có do tác động kéo dài của PMSG sau rụng trứng sẽ bị ngăn chặn Các ảnh hởng này bao gồm sự lớn lên của buồng trứng tiếp tục kích tích tạo ra steroid gây mất cân bằng nội tiết, gây nên khuyết tật trong sự phát triển hay di chuyển của phôi trong giai đoạn trớc... không rụng Tỷ lệ bò cho 0 - 1phôi 12,5% 36715 (335-380) 332 (315-360) n=8 Trọng lợng bò (kg) 62,5% n=7 (Chú ý: Thí nghiệm này đã tiến hành vào tháng 5 năm 1996) Thí nghiệm 5: (i) 2250 I.U PMSG (ii) nPMSG sau khi tiêm PGF2 60 giờ Nhóm PMSG Nhóm FSH Tổng số Trung bình Biến động SD Tổng số Trung bình Biến động SD Thể vàng 34 4,85 1-8 2,54 51.5 6,43 0-12 4,49 Số trứng không rụng 38 4,80 3-10 1,70 41 5,12... cao vì vậy tăng phần đóng góp của nó vào nguồn gen của quần thể Gây rụng nhiều trứng bằng các loại hormôn kích dục là một yếu tố then chốt của việc cấy truyền phôi hiện nay Tuy nhiên, mặc dầu đợc sử dụng rộng rãi, vẫn còn có sự biến động lớn về tỷ lệ rụng trứng và số lợng phôi có chất lợng tốt do việc áp dụng các phơng 174 n=8 pháp gây rụng nhiều trứng hiện nay Có hai nguyên nhân chính của sự biến... FSH/LH, liều lợng, lịch trình tiêm Kỹ thuật gây rụng nhiều trứng Bớc đầu tiên của hầu hết phơng pháp gây rụng nhiều trứng là tiêm một loại kích dục tố dạng FSH thích hợp 3-4 ngày trớc động dục (động dục tự nhiên hay động dục chỉ định) Hai loại kích dục tố quan trọng nhất hiện nay đợc sử dụng là chất chiết xuất tuyến yên FSH và PMSG (Kích dục tố huyết thanh ngựa chửa) Các chế phẩm FSH đợc xem là có thời...Thí nghiệm 4: (i) 2250 I.U PMSG + nPMSG sau khi tiêm PGF2 60 giờ (ii) Tổng số11,6 ml FSH, tiêm 2 lần /ngày Nhóm PMSG Nhóm FSH Tổng số Trung bình Biến động SD Tổng số Trung bình Biến động SD 65 8,1 0-12 4,19 33 4,7 0-9 3,04 - - - - - - - - Trứng/phôi 72 9,0 0-18 5,21 19 2,7 0-5 1,97 Phôi đủ tiêu chuẩn cấy 54 6,7 0-12 3,95 13 1,85 0-3 1,77 Thể vàng Số trứng không rụng Tỷ lệ bò cho 0 - 1phôi 12,5%... một số nhà khoa học cho rằng sự có mặt của PMSG trong hệ tuần hoàn của bò sau thời gian gây rụng nhiều trứng có thể có một ảnh hởng có hại, đặc biệt là ảnh hởng đến chất lợng của trứng thụ tinh đang phát triển Nhằm cắt đứt tác động kéo dài của PMSG, gia súc đợc xử lý huyết thanh có kháng thể kháng PMSG gần thời điểm động dục Từ các nghiên cứu này, ngời ta cho rằng sử dụng kháng PMSG đã cải thiện chất . biệt về giải phẫu và sinh lý của hệ thống sinh sản giữa 2 loại bò này. Cổ tử cung ở một số bò Bos indicus dài, xoắn và việc này làm cho khó dẫn tinh và thu. di truyền cao hay nó có thể bị vô sinh. Phải ít nhất 2 tháng từ khi sinh bê lần cuối mới có thể thu phôi. Bò cái phải có cấu trúc và chức năng sinh sản