Đang tải... (xem toàn văn)
Đề tài là một hướng nghiên cứu phát triển của phương pháp lai phân tử trong điều kiện phòng thí nghiệm, mà bước đầu là hoàn thiện phương pháp Southern blot áp dụng trên vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
44 3.3.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB Bộ mẫu Pseudomonas fluorescens được giữ - 70oC, do các anh chị trước đã phân lập và giữ nguồn. Các dòng được chọn từ bộ mẫu này được đem ra rã đông và tăng sinh trên môi trường LB. Phần sinh khối thu được dùng cho việc ly trích và giữ làm bộ mẫu nguồn riêng phục vụ cho việc thiết lập qui trình. Sử dụng micropipette 10 – 100 µl, hút 10 µl dịch khuẩn cho vào ống nghiệm đựng 5 ml môi trường LB đã hấp vô trùng, đậy lại bằng nút bông. Các ống nghiệm này được gói lại thành bó và cho vào tủ lắc định ôn, nhiệt độ nuôi là 27oC, tốc độ lắc là 150 vòng / phút. Sau 48 giờ tăng sinh, dịch khuẩn thu được đem đi ly tâm để thu sinh khối. 3.3.2.2 Ly trích genomic DNA từ các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens * Qui trình ly trích Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tách chiết DNA theo phương pháp sử dụng CTAB / NaCl đã có cải tiến, qui trình thực hiện như sau: 1. Sử dụng sinh khối vi khuẩn đã được tăng sinh ở trên để tiến hành ly trích genomic DNA. 2. Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10000 vòng/5phút/4oC. Rửa sinh khối thu được với 1 ml nước cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex (3 lần). 3. Hoà tan sinh khối vi khuẩn thu được trong 567 µl dung dịch TE và đánh tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10 % và đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 - 2 giờ. 4. Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5M, hòa tan thật kỹ bằng vortex. 5. Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB / NaCl (khoảng 1 / 10 thể tích). Pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ ở 65oC trong 10 phút. 6. Thêm 780 µl dung dịch hổn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24 : 1 ; v/v). Hòa lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 10 phút ở 12000 vòng/ 4oC. 7. Thu hết dung dịch bên trên (dung dịch DNA) cho vào ống ly tâm mới (nếu không thể phân biệt mặt phân cách chung giữa các dung dịch, có thể ly tâm lần nữa ở tốc độ lớn hơn). 8. Chiết xuất dung dịch DNA với phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 : 24 : 1; v/v). Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14000 vòng/10 phút /4oC. 9. Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới (khoảng 500 µl). Kết tủa DNA với isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích cùa dung dịch (khoảng 300 µl) và 45 ủ ở tủ - 20oC / 30 phút. Sau đó ly tâm 12000 vòng/10 phút /4oC, lấy kết tủa sau khi ly tâm. 10. Rửa kết tủa bằng cồn 70% (khoảng 500 µl). Tốt hơn có thể dùng ethanol 70 % được làm lạnh ở - 20 oC, nghiêng nhẹ qua lại, ly tâm 13000 vòng/10 phút/4oC. Đổ cồn ra hết và làm khô bằng cách cho cồn bay hơi. 11. Hòa tan kết tủa trong 40 µl dung dịch TE 1X, đem mẩu giữ ở tủ 4oC trong suốt thời gian thử nghiệm. * Kiểm tra kết quả ly trích genomic DNA Chuẩn bị gel agarose 0,8% Cân 0,1 g agarose cho vào 12,5 ml TAE 0,5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đem đun trong lò viba ở 650 W, 2 phút. Để nguội, đổ vào khuôn có gắn lược với số giếng mong muốn. Chờ gel đông (thường 30 phút), rút lược ra và bắt đầu tiến hành nạp mẫu. Nạp mẫu, xác lập các thông số điện di và đọc kết quả Hút 2 µl genomic DNA đã ly trích ở trên, trộn đều với 2 µl đệm tải mẫu (loading buffer) 6X, sau đó hút hỗn hợp dung dịch bơm vào giếng tương ứng với số mẫu đã xác lập trước của gel agarose 0,8 %. Gel được đặt trong đệm TAE 0,5 X, hiệu điện thế 100 V, 250 mA và thời gian chạy là 15 phút. Sau đó, gel được lấy ra và nhuộm trong ethidium bromide 10 phút, rửa sạch và xem kết quả ly trích bằng máy Gel Doc 2000, sử dụng phần mềm Quatity One 2000 (Bio - Rad). 3.3.2.3 Hiệu chỉnh nồng độ và định lượng DNA bằng phân tử Mass * Hiệu chỉnh nồng độ Từ các mẫu DNA đã được ly trích, chọn một mẫu DNA có nồng độ loãng nhất trong các mẫu còn lại dựa trên kết quả kiểm tra sản phẩm ly trích genomic DNA bằng điện di làm mẫu chuẩn. Cũng từ đó, ta tính được số lần cần pha loãng của các mẫu có nồng độ cao so với mẫu chọn làm chuẩn. Mẫu được chọn làm chuẩn phải có nồng độ sử dụng được, không nên quá loãng, vì như thế sẽ gây khó khăn trong quá trình tiến hành các thử nghiệm đòi hỏi phải sử dụng nồng độ DNA tương đối lớn như thực hiện phản ứng cắt genomic DNA. * Định lượng DNA bằng phân tử Mass Chuẩn bị gel agarose 2% 46 Cõn 0,2 g agarose cho thờm vo 10 ml TAE 0,5X, lc cho agarose phõn tỏn u, em un trong lũ viba 500 W, c mi phỳt em ra xem agarose tan hon ton cha. Khi agarose tht s tan ht trong TAE, ngui, vo khuụn vi lc 6 ging. Ch gel ụng khong 30 phỳt, sau ú tin hnh np mu. Thit lp phng phỏp nh lng bng phõn t Mass Ging u tiờn v ging cui cựng s dng Mass, cỏc ging cũn li theo th t s dng mt mu genomic DNA bt kỡ ó hiu chnh nng c pha loóng theo cỏch sau: 4 àl DNA ó hiu chnh nng + 4 àl nc ct hai ln vụ trựng 4 àl DNA ó hiu chnh nng + 8 àl nc ct hai ln vụ trựng 4 àl DNA ó hiu chnh nng + 12 àl nc ct hai ln vụ trựng 4 àl DNA ó hiu chnh nng + 16 àl nc ct hai ln vụ trựng 4 àl DNA ó hiu chnh nng + 20 àl nc ct hai ln vụ trựng 4 àl DNA ó hiu chnh nng + 24 àl nc ct hai ln vụ trựng Np mu, xỏc lp cỏc thụng s in di v c kt qu Ging 1: hỳt 2 àl phõn t Mass, trn u vi 2 àl loading dye 6X, hỳt hn hp dung dch bm vo ging 1. Ging 2: hỳt 1 àl phõn t Mass, trn u vi 2 àl loading buffer 6X, hỳt hn hp dung dch bm vo ging cui cựng. Cỏc ging cũn li theo th t l mu DNA gc trc khi pha loóng, k n l cỏc mu pha loóng 1 ln, 2 ln, 3 ln, 4 ln , 5 ln , 6 ln, 7 ln, 8 ln vi th tớch nh sau: 2 àl mu + 2 àl loading buffer, trn u v bm vo vi ging tng ng. iu kin chy trong m TAE 0,5X, hiu in th 70 V trong 60 phỳt. Sau ú, gel c nhum ethidium bromide trong 15 phỳt v em ra ra tht k bng nc sch. c gel bng mỏy Gel Doc 2000 v phõn tớch kt qu. 3.3.2.4 Thit lp phn ng ct genomic DNA bng enzyme gii hn * Thit lp phn ng S dng enzyme ct gii hn BamH I, Eco RV v Hind III ct genomic DNA, chỳng tụi ó thit lp phn ng ct hai th tớch khỏc nhau 25 àl v 50 àl nh sau: 47 Bảng 3.1 Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 25 µl. BamH I Eco RV Thể tích DNA DNA 5 µl 10X đệm BamH I 10X đệm Eco RV 2.5 µl Enzyme BamH I Enzyme Eco RV 0.1 µl Nước Nước 17.4 µl Tổng cộng 25 µl Phản ứng được ủ ở 37oC trong 2 giờ. Thể tích các thành phần phản ứng cắt ở bảng 3.1 được thực hiện theo khuyến cáo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Bảng 3.2 Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl. BamH I Eco RV Hind III Thể tích DNA DNA DNA 30 µl 10X đệm BamH I 10X đệm Eco RV 10X đệm Hind III 5 µl Enzyme BamH I Enzyme Eco RV Enzyme Hind III 1 µl Nước Nước Nước 14 µl Tổng cộng 50 µl Phản ứng được ủ ở 37oC qua đêm. Thể tích các thành phần phản ứng cắt ở bảng 3.2 đã được thay đổi. Các thành phần trên đã được khảo sát và hiệu chỉnh cho phản ứng cắt tốt nhất. * Trộn phản ứng cắt Đầu tiên cần xác định lượng sản phẩm cắt cần sử dụng, tính toán thể tích hút, số phản ứng và điều chỉnh nhiệt độ ủ ở bồn ủ water bath. Thông thường, người ta hay trộn các thành phần chung trong một hỗn hợp rồi mới phân chia thành các phản ứng riêng lẻ. Tiến hành trộn phản ứng cắt theo thứ tự sau: - Hút nước - Hút dung dịch đệm của enzyme - Hút enzyme 48 - Trộn các thành phần trên thật nhẹ và đều, phân chia ra các eppendorf dùng để thực hiện phản ứng cắt. - Bơm mẫu DNA vào các eppendorf đã trộn ở trên, đậy nắp kỹ và đem đi ủ ở nhiệt độ thích hợp. * Kiểm tra kết quả phản ứng cắt Bố trí mẫu Bố trí giống như phương pháp định lượng DNA bằng phân tử Mass, giếng đầu tiên và giếng cuối cùng là genomic DNA lúc chưa thực hiện phản ứng cắt, các giếng còn lại là sản phẩm cắt của các mẫu. Cũng có thể bố trí theo kiểu xen kẻ, liên tiếp nhau mẫu DNA chưa cắt, đến mẫu sản phẩm cắt. Nạp mẫu, chạy điện di, đọc kết quả Hút 4 µl mẫu, trộn đều với 2 µl loading buffer 6X, bơm vào giếng tương ứng đã bố trí. Thực hiện điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50 V trong 90 phút. Xem kết quả cắt bằng cách nhuộm gel trong ethidium bromide 10 phút, rửa sạch và đọc kết quả bằng phần mềm Quatity One của máy Gel Doc 2000 (Bio- Rad). 3.3.2.5 Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen phlD trên hai cặp primer B2BF, BRR4 và phl- 2a, phl- 2b. Trong vi khuẩn có lợi, gen mã hóa các đặc tính thường là một tổ hợp các gen có chức năng khác nhau, trong đó một số gen đóng vai trò quan trọng trong quá trình mã hóa các chất kháng sinh chính và một số gen có vai trò mã hóa các chất phụ như là các chất xúc tác phản ứng tổng hợp chất kháng sinh chính. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các kết quả nghiên cứu đã được công bố để thiết lập các primer chuyên biệt dùng để phát hiện các gen mã hóa các chất kháng sinh và dùng dòng vi khuẩn P. fluorescens 2P24 cung cấp bởi tiến sỹ Zhang, Liqui Đại học Nông Nghiệp Bắc Kinh, Trung Quốc làm dòng vi khuẩn đối chứng. - Cặp primer ngoài: Khuếch đại trình tự 745 bp Phl - 2a: GAGGACGTCGAAGACCACCA Phl - 2b: ACCGCAGCATCGTGTATGAG - Cặp primer trong: Khuếch đại trình tự 629 bp B2BF: ACCCACCGCAGCATCGTTTATGAGC BRR4: CGCCGGTATGGAAGATGAAAAAGTC 49 Trình tự primer được thiết kế trên gen phlD * Thực hiện phản ứng PCR DNA 1 µl 10X PCR buffer 2,5 µl dNTP 2,5 µl MgCl2 0,75 µl Primer 1 1 µl Primer 2 1 µl iTaq 0,1 µl H2O 16,15 µl Tổng thể tích 25 µl Các thành phần trên đã được khảo sát và làm tối ưu các điều kiện để tạo ra kết quả ổn định và lượng sản phẩm khuếch đại thu được nhiều. Hình 3.2 Tổ hợp 6 gen sinh tổng hợp chất 2,4 – DAPG Trong đó gen phlD tổng hợp monoacetylphloroglucinol (MAPG) và các gen phlA, phlC, phlB cần thiết cho quá trình chuyển đổi MAPG thành DAPG. Sử dụng cặp primer Phl2a và Phl2b phát hiện 2,4 – DAPG. 50 * Chương trình khuếch đại PCR Thực hiện theo các bước sau: Biến tính hoàn toàn DNA khuôn ở 94oC trong 3 phút; lặp lại 30 chu kỳ với các bước: biến tính ở 94oC trong 1 phút, bắt cặp giữa primer và khuôn ở 56oC trong 45 giây, kéo dài sợi DNA ở 72oC trong 1 phút. Sau khi kết thúc các chu kỳ, mẫu được giữ ở 72oC trong 10 phút để Taq DNA polymerase tổng hợp hoàn chỉnh các đoạn còn dang dở. Giữ mẫu ở 4oC cho đến khi phân tích. * Điện di và phân tích kết quả Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tích trên gel agarose 0,8 %. Quá trình thực hiện như sau: 4 µl sản phẩm khuếch đại được nhuộm với 2µl đệm tải mẫu (loading buffer), trộn thật đều và bơm hỗn hợp vào giếng trên gel. Quá trình điện di được thực hiện với hiệu điện thế 100 V, 250 mA trong 20 phút. Nhuộm gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 – 10 phút, rửa thật kỹ bằng nước sạch, đem đọc kết quả trong hệ thống máy GELDOC 2000 (Bio - Rad). Mẫu được coi là dương tính khi xuất hiện sản phẩm khuếch đại với kích thước 745 bp với cặp primer phl – 2a, phl – 2b và 629 bp với cặp primer B2BF, BRR4; Mẫu được coi là âm tính khi không có sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm không có kích thước tương ứng như trên. 3.3.2.6 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel * Qui trình thực hiện 1. Mẫu cần được tinh sạch (thường là sản phẩm PCR) được đem chạy điện di trên gel agarose 0,8 % tan ở nhiệt độ thấp. Gel sau khi chạy điện di, được nhuộm ngắn (1 - 2 phút) trong ethidium bromide nồng độ thấp, sau đó rửa gel bằng nước sạch và rửa lại bằng nước cất vô trùng, gel được đặt trên máy chiếu UV đã được bọc kỹ bằng saran wrap và phủ lên trên bởi giấy bạc được cắt một lổ có kích thước bằng miếng gel. 2. Bật UV, định vị band cần lấy, dùng dao lam cắt gel chứa band DNA cần được tinh sạch, cho vào eppendorf 1,5 ml. Sử dụng cân phân tích để xác định trọng lượng gel chứa band vừa cắt ở trên. 3. Dùng micropipette hút capture buffer theo mg/v (10 mg gel ≈ 10 µl capture buffer), đậy nắp eppendorf đem ủ ở 60oC trong 5 phút, lấy ra vortex nhẹ và tiếp tục ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết (5 - 15 phút). 4. Đem ly tâm 3000 vòng / 30 giây để tập trung mẫu ở đáy eppendorf. 51 5. Hỳt mu cho vo ct GFX, nhit phũng 1 phỳt. 6. em ly tõm 10000 vũng / 30 giõy. 7. Cho thờm vo ct 500 àl wash buffer, ly tõm 10000 vũng / 30 giõy. 8. Ly ct ra v t vo eppendoft 1,5 ml mi. 9. Hỳt 20 àl elution buffer nh vo ct GFX, nhit phũng 1 phỳt. 10. Ly tõm 10000 vũng / 1 phỳt, ly ct GFX ra, y np eppendorf v em mu gi 4oC. Nhng iu cn lu ý khi tinh sch sn phm t gel - Khi nh elution buffer phi nh gia ct, tng git mt. - Khi ra ct bng wash buffer hoc khi thờm capture buffer phi nh t t trờn thnh ca ct. - Cõn eppendorf trc khi tin hnh ct gel. - S dng low melting agar. - Sau quỏ trỡnh 60oC agarose phi tan ht. - Mỏy in di cn c ra sch trc khi s dng - Bng gel cn c ra sch bng nc ct vụ trựng. - S dng ethidium bromide loóng hn ẵ nng thng dựng (15 àl ethidium bromide + 300 ml TAE 0,5), phi ng hp riờng, phi thay mi khi nhum mu. Thi gian nhum mu ngn. - Thi gian mu tip xỳc di tia UV trong quỏ trỡnh ct ngn (< 40 giõy). 3.3.2.7 Thc hin ỏnh du sn phm PCR ca cp primer B2BF, BRR4 Chỳng tụi s dng sn phm PCR ó c tinh sch cú trỡnh t l 629 bp to probe, trỡnh t ny l sn phm khuch i ca cp primer trong B2BF v BRR4. Trc khi thc hin phn ng ỏnh du cn phi pha loóng dung dch cross - linker thnh dung dch cú nng s dng, dung dch ny cú th bo qun lnh 2 8oC trong mt tun. Bờn cnh ú, DNA cng cn phi c pha loóng vi nc ti nng 10 ng / àl dựng ỏnh du (nng mui trong mu DNA nờn c gi mc thp nht, khụng quỏ 50 mM). Thc hin phn ng ỏnh du theo kit ca Amersham gm cỏc bc nh sau: 1. Cho 10 àl DNA ó pha loóng vo eppendorf 200 àl v lm bin tớnh hon ton bi nhit bng cỏch un 5 7 phỳt trong nc ang sụi mnh. 52 2. Làm lạnh nhanh trên đá trong 5 phút, đem ly tâm nhanh ở tốc độ 4000 vòng/30 giây để dồn dung dịch xuống đáy ống. 3. Thêm 10 µl dung dịch đệm phản ứng reaction buffer (có sẵn trong bộ kit) vào DNA đã được làm lạnh. Đảo trộn nhẹ cho đều, phản ứng nên giữ trên đá. 4. Thêm 2 µl chất đánh dấu labelling reagent (có sẵn trong bộ kit), trộn nhẹ, đều. 5. Thêm 10 µl dung dịch phản ứng cross - linker. Trộn đều, ly tâm nhanh 4000 vòng / 30 giây để dồn hỗn hợp xuống đáy. 6. Ủ 30 phút ở 37oC cho phản ứng xảy ra. 7. Probe có thể được dùng ngay hoặc giữ trên đá đến 2 giờ. Trong trường hợp muốn bảo quản lâu hơn, probe đã đánh dấu được giữ trong 50 % glycerol ở - 15oC đến - 30oC trong 6 tháng (không cần xử lý gì thêm dung dịch probe này sau khi bảo quản). 3.3.2.8 Tạo mẫu lai * Điện di sản phẩm cắt DNA bằng enzyme giới hạn Chúng tôi thực hiện điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 0,5X, với kích thước gel 6 cm x 6 cm, gel được gắn lược 6 giếng, thực hiện bố trí như sau: Giếng 1: Hút 4 µl 100 bp PCR Molecular Ruler (Bio - Rad) + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng. Giếng 2: Hút 4 µl sản phẩm PCR dùng tạo probe sử dụng như một đối chứng dương + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng. Giếng 3, 4, 5, 6: Hút 18 µl mẫu (sản phẩm của enzyme cắt) + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng. Tiến hành điện di ở hiệu điện thế là 50 V, trong 90 phút. Sau đó, gel được đem nhuộm ngắn trong ethidium bromide trong 1 - 2 phút, rửa sạch và chụp gel lấy lại hình ảnh để biện luận kết quả. Miếng gel đó sẽ được làm biến tính trước khi chuyển lên màng (chú ý miếng gel trước khi chuyển lên màng không nên để lâu trong không khí vì như thế sẽ làm cho bề mặt miếng gel bị khô và ảnh hưởng không tốt đến quá trình chuyển lên màng. Thời gian giữ gel là 15 - 30 phút khi nó được ngâm trong dung dịch đệm) * Chuyển DNA từ gel lên màng bằng hiện tượng mao dẫn hướng lên Làm biến tính gel trước khi chuyển lên màng 53 Sau khi hoàn thành giai đoạn điện di, gel được giữ trong dung dịch đệm TAE 0,5X. Chúng tôi thực hiện biến tính gel như sau: 1. Đổ bỏ đệm TAE 0,5X, rửa lại miếng gel bằng nước cất và đổ bỏ phần nước rửa. 2. Đổ vào khoảng 150 ml dung dịch đệm biến tính (NaOH 0,5 M; NaCl 0,15 M), phải xem kỹ đảm bảo rằng miếng gel đã được phủ hoàn toàn bởi dung dịch, đem lắc nhẹ 15 phút ở nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần dung dịch đó đi. 3. Lặp lại bước trên. 4. Rửa lại gel bằng nước cất vô trùng, đổ bỏ phần nước rửa. 5. Đổ vào khoảng 150 ml dung dịch đệm trung tính (Tris – HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0), miếng gel cũng phải được ngấm hoàn toàn trong dung dịch, đem lắc nhẹ 15 phút ở nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần dung dịch đó đi. 6. Lặp lại bước trên. Trong thời gian này chuẩn bị màng, dung dịch chuyển, giấy thấm, hệ thống mao dẫn và các dụng cụ cần thiết khác. Thực hiện chuyển lên màng bằng phương pháp mao dẫn (thiết bị chuyển lên màng đã được cải tiến) Khi đã hoàn thành giai đoạn biến tính, tiến hành chuyển lên màng theo các bước sau: 1. Dùng hộp nhựa hình chủ nhật (20 cm x 10 cm) có chứa 250 ml đệm SSC 6X, phía trên có đặt một tấm mica (12 cm x 11,5 cm) làm bệ của hệ thống mao dẫn. 2. Cắt một tấm giấy lọc có kích thước phù hợp (17 cm x 8 cm) được làm ướt bằng dung dịch SSC 2X, phủ đều trên tấm mica (tránh có bọt khí, nếu có bọt khí dùng Hình 3.3 Hệ thống mao dẫn chuyển DNA lên màng Hybond N chưa hoàn chỉnh Hình 3.4 Hệ thống chuyển DNA lên màng Hybond N hoàn chỉnh [...]... hành lai) 3.3.2.9 Lai Southern * Thực hiện phản ứng lai Trước khi thực hiện phản ứng lai, xác lập nhiệt độ của buồng lai là 55oC, đồng thời làm nóng dung dịch đệm lai ở 55oC Song song đó, chúng tôi tính toán các thông số sau: Diện tích màng: 6 x 6 x 2 = 72 (cm2 ) Thể tích đệm lai: 0.25 x 72 = 18 (ml) Nồng độ probe cần: 10 x 18 = 180 (ng) Thể tích probe: 180 / 10 =18 (µl) * Qui trình thực hiện phản ứng... wrap khác phủ bề mặt màng, trải đều chất phát hiện bằng que thủy tinh, tránh để lại bọt khí 5 Sau đó màng lai được lấy ra, và đặt ở giữa hai miếng saran wrap mới với kích thước phù hợp (chú ý trong quá trình thao tác với màng không để màng bị khô) Ủ màng với phim trong cassette Màng được đặt giữa Cassette 30 x 40 Konica, sau đó đặt một tấm phim Konica 30 x 40 cm lên trên màng tránh sự dịch chuyển của . dùng cho việc ly trích và giữ làm bộ mẫu nguồn riêng phục vụ cho việc thiết lập qui trình. Sử dụng micropipette 10 – 100 µl, hút 10 µl dịch khuẩn cho vào. primer trong: Khuếch đại trình tự 629 bp B2BF: ACCCACCGCAGCATCGTTTATGAGC BRR4: CGCCGGTATGGAAGATGAAAAAGTC 49 Trình tự primer được thiết kế trên gen phlD