Đang tải... (xem toàn văn)
Bài tập tin sinh học Tách dòng gen nấm Trichoderma. Sử dụng công cụ tin sinh học để tra cứu dữ liệu cho thí nghiệm tách dòng gen của nấm Trichoderma. Chitinase là một enzyme glycosyl hydrolase xúc tác thủy phân chitin, có trong nhiều loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật không xương sống, thực vật và động vật có xương sống. Chitinase thực vật là các enzyme xúc tác thủy phân chitin của nấm bệnh. Tuy nhiên, không phải cây trồng nào cũng có khả năng sản xuất chitinase, hoặc hoạt tính chitinase của chúng đủ cao để kháng lại nấm bệnh, vì vậy việc tạo ra một chủng sinh vật có khả năng sản xuất enzyme này với lượng lớn và hoạt tính cao là có ý nghĩa rất lớn, trong khi đó, Trichoderma là loại nấm hết sức thông dụng, tốt cho cây trồng, có mặt trong hầu hết các loại đất và có cơ chế tiêu diệt các loại nấm gây bệnh khác bằng cách tiết ra các loại enzym thủy phân như cellulase, chitinase,…vậy nên sản xuất chitinase từ nấm Trichoderma là một hướng đi rất được quan tâm
TẠO DÒNG GEN CHITINASE TỪ NẤM TRICHODERMA I Tổng quan Cây trồng nông nghiệp bao gồm loại rau ngũ c ốc nh ư: rau ăn lá, ăn quả, củ, đậu đỗ, lúa, ngơ, khoai, sắn giữ vai trị quan tr ọng b ữa ăn hàng ngày gia đình nguồn hàng xuất có giá tr ị Tuy nhiên, loại trồng có đặc điểm hình thái sinh tr ưởng thu ận l ợi cho loại sâu nấm bệnh sống ký sinh Sức tàn phá lo ại sâu nấm bệnh nhiều lớn, gây tổn thất nghiêm trọng su ất chất lượng trồng Việt Nam nước có khí hậu nhiệt đ ới, th ế thích hợp cho nhiều loại sâu nấm bệnh gây hại trồng nông nghiệp phát triển Các loại nấm bệnh gây hại thường gặp trồng Rhizoctonia gây bệnh thối gốc (lở cổ rễ), Fusarium gây bệnh héo rũ, thối khơ, Alternaria gây bệnh đốm vịng Để hạn chế tác hại nấm bệnh, phương pháp có hiệu sử dụng hóa chất thuốc trừ sâu bệnh Tuy nhiên, việc làm gây tác hại lâu dài với môi trường sức khoẻ cộng đồng Hiện nay, công nghệ sinh học ngày phát triển mở hướng m ới việc ngăn ngừa tác hại sâu bệnh hại trồng v ẫn bảo vệ môi trường tạo thể tái tổ hợp có khả kháng lại loại sâu bệnh Chitinase enzyme glycosyl hydrolase xúc tác thủy phân chitin, có nhiều loại thể sống khác bao gồm vi khuẩn, n ấm, đ ộng v ật khơng xương sống, thực vật động vật có xương sống Chitinase th ực v ật enzyme xúc tác thủy phân chitin nấm bệnh Tuy nhiên, không ph ải trồng có khả sản xuất chitinase, ho ạt tính chitinase chúng đủ cao để kháng lại nấm bệnh, việc tạo m ột ch ủng sinh vật có khả sản xuất enzyme với lượng l ớn ho ạt tính cao có ý nghĩa lớn, đó, Trichoderma loại n ấm hết s ức thơng d ụng, t ốt cho trồng, có mặt hầu hết loại đất có c ch ế tiêu di ệt loại nấm gây bệnh khác cách tiết loại enzym th ủy phân nh cellulase, chitinase,…vậy nên sản xuất chitinase từ nấm Trichoderma m ột hướng quan tâm II Các bước thực Bước : tìm NCBI từ khóa “ chitinase Trichoderma” Chọn vài kết để so sánh, xin chọn kết sau 1> [Trichoderma harzianum] Hypocrea lixii isolate iihr chitinase mRNA, complete cds GenBank: FJ210648.1 2> [Trichoderma viride] Trichoderma viride strain T1#3 chitinase gene, complete cds GenBank: GU187942.2 3> [Trichoderma atroviride] Trichoderma atroviride isolate GAUT1-4 chitinase (ech-42) gene, partial cds GenBank: FJ603061.1 4> [Trichoderma sp.w512] Trichoderma sp w512 chitinase (ech-42) gene, complete cds GenBank: DQ462415.1 5> [Trichoderma longibrachiatum] Trichoderma longibrachiatum chitinase (Chi18-5) gene, complete cds GenBank: GU180607.1 Bước : so sánh trình tự cơng cụ ClustalW2 -> javaview Bước : Chọn gen mã hóa từ Trichoderma harzianum làm mạch khuôn để thiết kế mồi Sử dụng công cụ Primer3 Thiết lập thông số sau : Ta thu kết sau Bước : Kiểm tra khả tự bắt cặp mồi http://www.finnzymes.com/java_applets/multiple_primer_analyzer.html Ta có cặp mồi LEFT PRIMER RIGHT PRIMER TGCCTACGCCGATTATCAGA CTCCCAGCTTCCAGATCCAA Giả sử sau tiến hành PCR với cặp mồi trên, ta nhân đoạn gen mã hóa protein chitinase T harzianum , có trình tự sai khác 50 nu v ị trí nucleotide thứ 30 so với gen ban đầu Ta dự đốn tính ch ất protein cách so sánh độ tương đồng sử dụng công cụ Blast Kết Blast Từ bảng ta thấy trình tự chuỗi sản phẩm PCR giả định so với chuỗi gốc ( chuỗi ) cần khuyếch đại giống 99% Bước : Xác định cấu trúc 3D protein chitinase từ nấm Trichoderma harzianum Tìm mục Structure NCBI từ khóa “chitinase trichoderma” Ta thấy hiển thị kết khơng có kết ta mong muốn => chưa có cấu trúc 3D protein chitinase tách từ nấm Trichoderma harzanum sở liệu ... viride] Trichoderma viride strain T1#3 chitinase gene, complete cds GenBank: GU187942.2 3> [Trichoderma atroviride] Trichoderma atroviride isolate GAUT1-4 chitinase (ech-42) gene, partial cds GenBank:... FJ603061.1 4> [Trichoderma sp.w512] Trichoderma sp w512 chitinase (ech-42) gene, complete cds GenBank: DQ462415.1 5> [Trichoderma longibrachiatum] Trichoderma longibrachiatum chitinase (Chi18-5) gene,... NCBI từ khóa “ chitinase Trichoderma? ?? Chọn vài kết để so sánh, xin chọn kết sau 1> [Trichoderma harzianum] Hypocrea lixii isolate iihr chitinase mRNA, complete cds GenBank: FJ210648.1 2> [Trichoderma