93 sinh sắc tố (khoảng 69,4%). Vi sinh vật ở biển phát triển tốt ở nồng độ muối 3,5%, có loài sống quen thì có thể phát triển mạnh nhất ở nồng độ 20%. Mặt khác các vi sinh vật ở biển chịu lạnh tốt hơn vi sinh vật ở đất và kém chịu nóng hơn; nhiệt độ thích hợp cho chúng là 20 – 25 o C, rất nhiều loài có thể phát triển ở 0 – 4 o C. 3. Sự phân bố của vi sinh vật trong không khí: Không khí là môi trường không thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật vì trong không khí thiếu chất dinh dưỡng, khô, luôn bị ánh sáng mặt trời chiếu sáng và mưa rửa trôi bụi bẩn trong không khí. Vi sinh vật trong không khí chủ yếu là từ đất, bay vào không khí cùng với hạt bụi, ngoài ra còn từ nước do bốc hơi nước, hay hơi thở của người và súc vật mang bệnh đường hô hấp. Hệ vi sinh vật trong không khí phụ thuộc vào nhiều yếu tố: - Hệ vi sinh vật trong đất dưới tầng không khí đó. - Tầng không khí: không khí càng gần mặt đất thì số lượng vi sinh vật càng lớn. - Sự hoạt động của con người, động vật và các phương tiện cần thiết cho sinh hoạt của con người. - Thời tiết khí hậu: nắng và mưa có tác dụng làm giảm vi sinh vật trong không khí. Trời khô hanh, nhiều gió sẽ tăng số lượng vi sinh vật trong không khí. B. PHẦN THỰC HÀNH ( 14 tiết) Bài 1. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM VI SINH VẬT (4 tiết) I. Chuẩn bị phiến kính và lá kính: Người ta sử dụng phiến kính và lá kính để làm các tiêu bản quan sát vi sinh vật. - Phiến kính (lame) thường có kích thước 76 x 26 x 1,1 – 1,4mm. 94 - Lá kính (lamelle) thường có kích thước 14 x 14mm hay 18 x 18mm, chiều dày không quá 0,15 – 0,17mm. Các phiến kính và lá kính cần phải rửa thật sạch. - Đối với loại mới mua thì làm sạch bằng cách đun sôi trong dung dịch NaOH 1% trong 10 phút rồi rửa bằng nước cất. Sau đó rửa lại bằng dung dịch HCl loãng và cuối cùng rửa kỹ bằng nước cất. - Đối với loại đã dùng rồi thì ngâm vào dung dịch rửa loãng sunfobicromat (hỗn hợp 100g H 2 SO 4 đậm đặc, 50g K 2 Cr 2 O 7 , 100ml nước cất) trong 2 giờ. Sau đó rửa bằng nước rồi đun sôi 20 phút trong dung dịch NaHCO 3 1% rồi rửa lại thật sạch bằng nước máy, cuối cùng tráng lại bằng nước cất. Các phiến kính và lá kính mỏng đã rửa sạch cần lau thật khô rồi ngâm vào trong các lọ có nút mài đựng cồn 96 O . Khi nào sử dụng lấy ra dùng khăn mềm lau khô hoặc hơ qua trên ngon lửa đèn cồn. II. Làm tiêu bản tạm thời: 1. Các đặc điểm của tiêu bản tạm thời: - Thao tác làm tiêu bản đơn giản, tiến hành nhanh. - Quan sát được trạng thái sống của tế bào như: sự chuyển động của tiên mao, sự sinh sản, sự hình thành bào tử . - Tiêu bản loại này chỉ sử dụng một lần rồi bỏ đi. 2. Cách lấy giống vi sinh vật để làm tiêu bản: Muốn làm bất kỳ một loại tiêu bản nào về vi sinh vật cũng phải thực hiện các thao tác lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi trên tiêu bản. Các thao tác đó như sau: - Đốt đèn cồn. - Đặt ống giống có vi sinh vật vào giữa ngón cái và ngón trỏ của bàn tay trái, lòng bàn tay ngửa ra. Ống nghiệm để hơi nghiêng nhưng không được để canh trường vi sinh vật chạm vào nút bông. - Tay phải dùng que cấy và vô trùng bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Để que cấy thẳng đứng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi đầu que cấy nóng đỏ rồi từ từ đặt và di chuyển que cấy theo chiều nằm ngang trên ngọn lửa. - Kẹp nút bông vào giữa ngón út và lòng bàn tay phải, xoay nhẹ nút bông 1 vòng và kéo nút ra. Giữ nguyên nút bông như vậy cho đến khi đậy nút vào. - Đốt miệng ống nghiệm trên ngọn đèn cồn. - Khéo léo đưa que cấy (đã nguội) vào ống giống để lấy giống và nhẹ nhàng đưa que cấy ra. + Nếu ống giống là môi trường lỏng chỉ cần nhúng đầu que cấy vào canh trường rồi rút ra. + Nếu ống giống là môi trường đặc thì dùng que cấy lấy một chút sinh khối vi sinh vật trên mặt thạch và hoà đều vào giọt nước cất vô trùng trên phiến kính. Chú ý thao tác hết sức nhẹ nhàng để lấy giống mà không cầy mặt thạch lên. - Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm, đậy ống nghiệm nghiệm lại và để ống vào giá. 95 - Đưa giọt canh trường (hoặc sinh khối) vi sinh vật ở đầu que cấy đặt vào giữa phiến kính để làm vết bôi. - Khử trùng lại que cấy trên ngọn đèn cồn rồi cất vào giá. 2. Cách làm tiêu bản giọt ép: - Nhỏ một giọt nước cất lên phiến kính sạch. Dùng que cấy hay pipet lấy một ít tế bào (ở khuẩn lạc) hay một giọt dịch nghiên cứu đặt vào giọt nói trên. Huyền phù vi sinh vật tạo nên trong giọt nước phải không quá đục, vì nếu đục thì rất khó quan sát. - Sau đó lấy một lá kính mỏng đặt lên giọt dịch đó thật cẩn thận sao cho không tạo thành bọt khí. Muốn quan sát lâu thì dùng vazơlin bôi quanh mép lá kính để cho giọt dịch khỏi khô. - Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi. 3. Cách làm tiêu bản giọt treo: Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích. - Dùng một loại phiến kính đặc biệt có một chỗ lõm hình tròn ở chính giữa. - Lấy vazơlin bôi quanh phần lõm của phiến kính. - Sau đó lấy pipet nhỏ một giọt dịch nghiên cứu lên chính giữa lá kính rồi lật ngược nhanh xuống để cho giọt dịch nằm ở phía dưới lá kính. Đặt nhẹ nhàng lá kính lên trên chỗ lõm của phiến kính tránh không cho giọt dịch nghiên cứu chạm vào thành hoặc đáy chỗ lõm. Vazơlin giúp cho lá kính đỡ xê dịch và giữ cho giọt dịch khỏi khô. 4. Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm: Tế bào vi sinh vật rất nhỏ bé và trong suốt nên quan sát ở trạng thái sống không màu sẽ không rõ, rất khó nhận xét được một cách tỷ mỉ. Do đó người ta có thể nhuộm màu vi sinh vật sống để quan sát được dễ dàng hơn. Để vi sinh vật vẫn sống và hoạt động được người ta dùng dung dịch thuốc nhuộm loãng. Đối với tế bào chết thì bắt màu ngay, còn đối với tế bào sống thì vài phút sau mới bắt màu. Cho nên bằng phương pháp này người ta cũng phân biệt được tế bào sống hay tế bào chết. Các loại thuốc nhuộm thường dùng là: - Dung dịch xanh metylen hay fuschin (1: 1000). - Dung dịch đỏ Congo bão hoà 5%. - Dung dịch đỏ trung tính (0,001 – 0,00001%). a. Nguyên tắc: Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm. b. Cách nhuộm: - Cho một giọt thuốc nhuộm lên phiến kính (dùng xanh mêtylen 0,001%). - Dùng que cấy đưa vào đó một ít vi sinh vật lấy từ khuẩn lạc hay 1 giọt dịch nuôi cấy. - Đậy lá kính lên giọt dịch. 96 - Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính (X10) rồi (X40). III. Quan sát vi sinh vật trên tiêu bản cố định. Phương pháp nhuộm đơn, nhuộm Gram: 1. Các đặc điểm của tiêu bản cố định: Quan sát tiêu bản cố định là là một phương pháp phổ biến trong nghiên cứu vi sinh vật vì nó có những ưu điểm sau: - Thao tác tuy phức tạp nhưng tiêu bản có màu sắc đẹp, giữ được lâu. - Không sợ lây nhiễm khi làm việc với vi sinh vật gây bệnh. - Cho phép ta quan sát rõ ràng hình dạng, cấu tạo của tế bào cũng như dễ dàng đếm số lượng tế bào. 2. Cách làm tiêu bản: a. Làm vết bôi: Đặt một giọt nước sạch vào giữa phiến kính, sau đó dùng que cấy đã khử trùng lấy một vòng que cấy vi sinh vật cho vào giọt nước và dàn đều ra. Trường hợp nuôi cấy trên môi trường lỏng thì dùng pipet để lấy dung dịch nghiên cứu. Hơ khô phiến kính đã có vi sinh vật trên ngọn lửa đền cồn hoặc để khô tự nhiên ta được một vết mờ trên phiến kính gọi là vết bôi. Chú ý: - Lượng vi sinh vật lấy vừa phải. - Vết bôi tròn, gọn, thật mỏng. - Các tế bào vi sinh vật được dàn đều, dễ quan sát. b. Cố định vết bôi: - Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau: + Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu và an toàn khi tiếp xúc (nếu là vi sinh vật gây bệnh). + Gắn chặt vi sinh vào phiến kính để lúc nhuộm không bị rửa trôi. - Các cách cố định: + Cố định bằng nhiệt: dùng kẹp gỗ để kẹp phiến kính, hơ mặt dưới của phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần (chừng vài ba giây), tránh không để tiêu bản quá nóng. + Cố định bằng hoá chất: * Nhúng vết bôi vào cồn 95 o khoảng 10 – 15 phút rồi sấy khô. * Ngâm trong axeton 5 phút. * Sấy bằng hơi formol 10 – 15 giây. 3. Phương pháp nhuộm đơn: Nhuộm đơn là dùng 1 loại thuốc nhuộm để nhuộm. Các loại thuốc nhuộm thường dùng để nhuộm đơn là: - Fuchsin kiềm. - Xanh metylen. - Tím gentian. - Đỏ trung tính. 97 Phương pháp nhuộm: đặt tiêu bản đã cố định lên giá rồi nhỏ vài giọt thuốc nhuộm phủ kín vết bôi. Sau 1 – 2 phút, đổ thuốc nhuộm đi và rửa nhẹ bằng nước sạch tới khi nào thấy nước rửa chảy qua vết bôi không còn màu nữa là được. Để tiêu bản khô dần hoặc thấm khô bằng giấy thấm. Khi tiêu bản khô hẳn đem quan sát dưới kính hiển vi. 4. Phương pháp nhuộm Gram: Đây là phương pháp thường được dùng trong thực nghiệm vi sinh vật học. Phương pháp nhuộm kép do nhà bác học người Đan mạch là Christian Gram và những người cộng tác đưa ra năm 1884. Với phương pháp nhuộm này người ta có thể phân biệt vi sinh vật thành 2 nhóm: Gram dương (G + ) và Gram âm (G - ). Vi sinh vật bắt màu tím sau khi nhuộm gọi là vi sinh vật Gram dương (bao gồm hầu hết xạ khuẩn, trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí, nấm mốc, nấm men, cầu khuẩn). Còn những vi sinh vật bắt màu hồng gọi là Gram âm như trực khuẩn sinh bào tử kỵ khí, một số cầu khuẩn như lậu cầu khuẩn, não mô cầu khuẩn . a. Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau: - Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương. - Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi bị xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm. b. Cách tiến hành: - Làm vết bôi từ ống giống đã nuôi cấy 24 giờ. Để khô và cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. - Đặt giấy lọc lên trên vết bôi. - Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút. - Nhỏ dung dịch lugol lên trên vết bôi, giữ 1 phút rồi đổ đi. - Rửa tiêu bản bằng nước rồi tẩy bằng cồn 95 0 trong 0,5 phút, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu. - Rửa tiêu bản bằng nước. - Nhuộm bổ sung Fuchsin lên vết bôi 10 – 30 giây. - Rửa bằng nước, để khô tự nhiên hoặc hơ trên ngọn lửa đèn cồn và đem quan sát dưới kính hiển vi. 1. Thuốc nhuộm Fuchsin kiềm: (1) Cồn 96 o 10 ml Fuchsin kiềm 0,3 gam (2) Phênol (axit phênic) 5 gam Nước cất 95 ml Trộn dung dịch (1) với (2) và pha loãng 5 lần. 2. Thuốc nhuộm xanh mêtylen 0,001%: . sát dưới kính hiển vi. 4. Phương pháp nhuộm Gram: Đây là phương pháp thường được dùng trong thực nghiệm vi sinh vật học. Phương pháp nhuộm kép do nhà bác. Với phương pháp nhuộm này người ta có thể phân biệt vi sinh vật thành 2 nhóm: Gram dương (G + ) và Gram âm (G - ). Vi sinh vật bắt màu tím sau khi nhuộm