CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 40 Chng 4: SN XUT ENZIM T THC VT Enzim t thc vt cng chim mt t l thích áng trong công ngh sn xut và s ng enzim nói chung. Mt s loi enzim ã c s dng nhiu trong y hc, thc phm và công nghip. c bit trong nghiên cu khoa hc ngi ta rt chú trng chit tách và xác nh c ch tác dng ca các enzim trong các mô thc vt nh nhóm enzim glycoxydaza, nhóm enzim oxy hoá kh polyphenoloxydaza (EPPO) ã mang li nhng giá tr lý thuyt và thc tin rt cao trong thi gian gn ây. 4.1. n xut ureaza tu ra: Chi hu Canavalia  châu phi,  Vit Nam có loài Canavalia ensifomis - c gi là cây u ra, u tc; ht dùng cha bnh lui hàn, nc ct, yu thn. Trong ht u ra, hàm lng ureaza có tht n 20% cht khô do ó ay là ngun nguyên liu quan trng  thu nhn ureaza. - V mt ng dng: ureaza c s dng trong y t xác nh hàm lng urê trong huyt, bàng quan, có trong thành phn ca thuc chng thn nhân to. Trong ch bin t s loi cá có mùi khai (i, nhám, mp) thì dùng ureaza  kh mùi khai rt hiu qu.Ureaza có th xúc tác thu phân urê c trong và ngoài t bào (có th). + Chit xut ly enzim: Nghin k bt u trong dung dch HCl 0,4% có thêm EDTA (trilon B, complexon III) 5.10 -3 M và L.cystein 5.10 -3 M. Sau ó ly tâm tách bã ly dch chit. + X lý nhit: Nâng nhit nhanh n 60 0 C, gi trong 30 phút em ly tâm tách b cn t ta. + Siêu lc: dch ly tâm c lc qua màng siêu lc  loi b peptit và polypeptit có trng lng phân t bé (M>500) + Kt ta bng axeton: ch lc c x lý bng axeton lnh (t l 1:1), ly tâm tách kt ta. Phn kt ta em hoà tan trong trisbuffer 0,1M, pH = 7 cha EDTA và L.cystein 5.10 -3 M. +Sc ký trao i ion ch enzim c chy sc ký trao i ion trên ct cha DEAE – xenluloza vi gradien ng  NaCl t 0 – 1M. Phân n cha enzim c sy thng hoa (ông khô) vi cht sacaroza làm cht n nh vi t l 2,5mg/1mg enzim. Ch phm thu c có hot tính tng 25 ln so vi ban u và hiu sut thu hi 43%. Xem bng 8 ca giáo trình (trang 186). Mt s thông s ca quá trình thu nhn ureza u ra. 4.2. Thu nhn bromelain t da: - Gii thiu qu da: tên latinh: Bromelia ananas-L: thuc chi da n qu. Ngoài ra còn có chi da di ( ly si ). (NH 2 ) 2 CO + H 2 O ureaza 2NH 3 + CO 2 CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 41 Bromelain có nhiu trong ph liu da nh v, lõi, chi, li u. Gii thiu c m ch phm Bromelain (Xem quá trình trang 187-189). Nguyên tc chung  thu nhn Bromelain. Ghi chú: kt ta bng (NH 4 ) 2 SO 2 lnh hay axeton lnh t l 1:1. - Thu nhn Bromelain bng phng pháp nhanh s dng CMC. Thu nhn Bromelain bng phng pháp mô t nh trên òi hi thi gian lâu, khó c, lng dch ln, khó bo qun. Hin nay mt s nhà nghiên cu ã dùng phng pháp nhanh tách Bromelain bng CMC. Cho phép thu c Bromelain bt trng có hot tính cao, thi gian nhanh, n gin nh sau: + Công ngh ch to CMC (xem giáo trình trang 191). Chú ý : có th thay vi màn (hay gt) bng bông nón ( Xenluloxa ~ 100%). + Tách chit Bromelain t dch chit da bng CMC. CMC c tm t bng dung dch m photphat 0,05 M, pH= 6,1. Cho dch chi da ( chi da  nghin  ép lc c dch) vào, thnh thong khuy trn. Emzim Bromelain s hp th lên b mt ca CMC. Sau 2 gi ly ra vt nc loi b cn bn bám vào CMC, ra trôi các prôtêin không phi enzim bng m photphat  pH=6,5. Sau ó cho phn hp th ln 1. Dung dch phn hp th là m photphat pH=7,1, NaCl 0,5 N khuy trn. Sau 2 gi ly ra vt c dung dch m dc cha bromelain. Tip tc phn p th nh ln th hai ri gp chung dch chit ca c hai ln kt ta enzim bng axeton hay còn lnh. i phng pháp này hiu xut thu hi t 0,1% so vi chi da ti, ch phm có hot tính 24 n v (mg ch phm enzim. So vi phng pháp kt ta t ban u bng (NH 4 ) 2 SO 4 thì  sch cao hn hai ln, thi gian nhanh hn, tin hành thun li hn. - Mt sng dng ca ch phm bromelain: + Thu phân gan bò: Gan bò c x lý bng ch phm bromelain trong10 gi 1-55 0 C, sau ó vô hot enzim  100 0 C trong 3-4 phút. Dch oc lc và ông khô thành dng bt là ch phm hn hp axit amin y t (sn xut các dch truyn m y t). Thành phn axit amin a ch phm thu phân gan bò bi bromelain c trình bày  bng 12 (trang 193 ca giáo trình). +S dng bromelain làm ông sa:  làm ông sa trong phng pháp truyn thng (trong CN-SX photphat) ngi ta s ng renin thu c t ngn th 4 ca d dày bê. Hin nay, lng renin cha áp xng  nhu cu ca công ngh. Trong nhng nm gn ây xu hng s dng proteaza thc t  thay th mt phn renin trong ch bin phomat ang c phát trin. Trong ó Ph liu da làm dp chit lc ly tâm kt ta ly tâm lc ch phm k thut Sc ký trao i ion sy thng hoa sn phm tinh khit . CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 42 áng k nht là 2 loi ch phm: ficin t cây c ficus và bromelain t da. Kt qung ng xem bng 13 (trang 194 ca giáo trình) + S dng bromelain  thu nhn các cht c ch proteaza. Trong mt s loi c quan ng vt, thc vt tn ti các cht c ch enzim, trong ó có cht c ch proteaza, chúng có bn cht protein nh enzim. n hình nh trong các ht hu: u tng, u xanh, u ván, ht mít, ni tng ca mc nang, a, trong a (tn ti song song vi bromelain). Các cht c ch thng tác ng mnh lên mt s enzim, trong ó có c enzim trong ng tiêu hoá (ca ngi và ng vt) nh: ficin, bromelain, tripxin.  thu hi c các cht c ch này, ngi ta dùng phng pháp hin i, hin nay là dùng enzim cnh. Bromelain sau khi thu nhn bng CMC nh trên c cnh trong gel sepharoza ri nhi vào to ra ct phn ng. Dch nghin, lc ph liu da c cho chy qua ct này: u tiên  pH photphat 4,6, sau ó pH = 7,6 – 7,8, tip ó xy ra quá trình liên kt gia bromelain vi các cht c ch. Thu hi cht c ch ng NaOH 0,01N + NaCl 0,1N vi pH = 11,5 – 12; có tinh sch, hot tính cao (xem ng 14 trang 195 ca giáo trình). Ngoài ra bromelain có s dng trong quá trình làm m tht, sn xut nc mm ngn ngày, bt cá. - Thu nhn papain t nha u : Cây u  (carica papaya.L), qu dùng làm thc phm. nha qu u  làm thuc giun, chai chân, mn cm, sng khp, eczema. R làm thuc cm máu, si thn. Hoa cha ho, viêm cung phi, lá cha ung th phi. Papain có M = 20.700, t op = 80 0 C, pH op = 5 – 5,5. Bc ch và mt hot tính bi H 2 O 2 , Iodoaxetat, I 2 , fericianua. c hot hóa i -CN, cystein, H 2 S và glutation. + Thu nhn papain thô: Dùng các loi quu  còn non, u  già (cha chín), dùng khn lau sch v, ly dao co sch nhng ng không quá sâu, hng nha (catex) vào cc ri làm khô bng các phng pháp khác nhau, ta thu c ch phm papain thô có hot tính nh bng 15 (trang 196 ca giáo trình). t qu cho thy hot tính papain sau khi chit tách cao hn khi ã  3 tháng. Phng pháp phi nng cho kt qu hot  enzim thp nht, sy chân không dung môi (axeton hay ru etylic lnh) cho hot tính cao nht. Ch phm cn bo qun lnh 6 – 10 0 C mi duy trì hot tính. + Thu nhn papain thng phm: Ngâm papain thô hoà tan nha ti (catex) trong nc ct có b sung glyxerin  tng  hoà tan, lc qua vi màn. Kt ta bng axeton lnh vi t l 2:1 so vi th tích dch c. Ly tâm lnh ly kt ta, sy 45 – 50 0 C (sy chân không hay phi khô), em nghin thành bt.  nc ta hin nay vin công ngh sinh hc ã sn xut thành công ch phm papain thng mi dng ông khô. Bng 16 so sánh hot tính (trang197) ca papain thng mi quc t vi papain ti và ông khô Vit Nam. Kt qu n di ó (trên gel CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 43 polyacrilamit), th hin trên hình 56 (trang 198). Hot tính thành phn các enzim trong ch phm papain c trình bày  bng 17 (trang 199). + ng dng ca papain: làm ông sa, thu phân protein nh sn xut bt cá thc phm, sn xut nc mm ngn ngày, làm mm tht. - Gii thiu kt qu nghiên cu ch phm EPPO (bt axeton) trong lá chè và ht ca cao CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 44 Chng 5: ENZIM CNH 5.1. Gii thiu chung: Enzim cnh (hay enzim không tan) là enzim có s tham gia hot ng trong mt không gian b gii hn. S gii hn hot ng vn linh hot ca enzim bng cách gn nó vào mt pha cách ly tách ri khi pha lng t do và ó nó vn có kh nng tip xúc c vi các phn t c cht, effector hay inhibitor (cht c ch ). Pha gn enzim thng không tan trong nc nhng cng có th là các polyme a nc. Enzim không tan c nghiên cu và ng dng t nhng nm 1950.  ch to enzim nh có th dùng các phng pháp hp ph, liên kt hoá tr gn kt enzim. Cht dùng  gn kt enzim gi là cht mang (enzim), hin nay ngi ta thng dùng xenluloza, tinh bt, rephadex, agaroza, alghinat canxi, gel polyacylamit, bt thu tinh, nilon… Ch phm enzim không tan có th dng bt, ht, phin, màng mng. Trong mt s trng hp không cn thit phi gn enzim vào cht mang mà có th gi nó  bên trong mng li polyme bao quanh ly phn t enzim. Mng li ó có mt nh không cho phép enzim thoát ra khi mng nhng vn  ln  c cht và sn phm to ra qua li d dàng. Theo thng kê, u nm 1995 ngi ta ã ch to c trên 100 ch phm enzim c nh . i ích ca vic s dng enzim cnh: - Gim giá thành do enzim c s dng lp li nhiu ln vi cùng mt kiu phn ng xúc tác, ch phm bn hn trong các u kin pH, nhit , áp xut thm thu ti u, tc  phn ng ln, d t chc sn xut  mc  tng hoá cao. - Ch to enzim tng i d, u t xây dng và sn xut tng i ít, sn phm phn ng không ln ln vi enzim (ch mt s ít b ra trôi theo dòng chy ca tác nhân), có th d dàng t chc sn xut các sn phm lên men bng enzim ngoi bào nh: ru etylic, axit hu c, axit amin, vitamin. 5.2. t s phng pháp ch yu ch to enzim cnh : 5.2.1. Microencapsulation ( gói enzim trong bao cc nh ) c nghiên cu bi Chang et al(1967-1968) Cái màng polymer thm thu dày 200A 0 (xenluloza, polysacarit, phi tinh bt ) to thành ht ng vng 10-12M cha các phn t enzim bên trong. Lp màng này cho phép  cht và sn phm phn ng enzim c qua li t do nhng các phn t enzim không th qua li c vì các phn t quá ln. Nh vy nu c cht có phân t lng quá ln nh: poly saccarit, protein cng không th qua li màng c do ó không th thc hin phn ng enzim c. 5.2.2. Liên kt enzim vào cht mang không tan (silman và katchalski-1966) Các cht mang nay thng là: CMC, silicagen. Lúc ó enzim c gn vào cht mang o mt s v trí xa vi trung tâm hot ng ca nó. Nh vy c tính ca enzim phn nào  thay i không còn nh khi nó  trng thái hoà tan t do trong h nh:  pH op , t op . n n s thay i các tr s K m , V m CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 45 5.2.3. nh v enzim trong pha lng ca h thng 2 pha (Reese and Mandels.1958) Enzim c hoà tan trong pha lng và c gi li trên ct ca cht rn không tan nh xenluloza. C cht nm trong pha lng khác (pha dung môi) khuch tán vào pha lng cha enzim và xy ra phn ng vi enzim. Các sn phm phn ng khuch tán ngc li i ra ngoài ct. H thng này gn ging vi phng pháp microen capsule mà pha dung môi óng vai trò nh mt màng bán thm. 5.2.4. Gi enzim bng màng siêu lc: Enzim c hoà tan t do trong dung dch và tin hành phn ng enzim ngay trong dung dch này. Sn phm phn ng c tách ra nh màng siêu lc chn lc còn c cht và enzim c gi li  phía bên kia ca màng. (Xem hình v trang 204 và gii thích trang 205 ca giáo trình) 5.3. t s liên kt trong vic cnh enzim. 5.3.1. Liên kt hoá tr: (cng hoá tr) Cht mang trong phng pháp này là các polyme t nhiên và các sn xut ca chúng nh: xenluloza, agaroza, alginic acid, chitin, collagen, keratin, các polyme tng hp: axit acrylic, polyme tan, N – Vinylpyrolidon . n cht ca phng pháp cnh enzim bng kiên kt cng hoá tr là enzim c ni i cht mang thông qua “cu ni có cc” nào ó. Cu ni này có kích thc va phi, t u gn vi cht mang polyme, u kia gn vi enzim. Ví d: cyanuric chloride (tricloro triazin) có 3 nhóm có kh nng to liên t áp ng c yêu cu trên, trong ó có mt nhóm s liên kt mnh vi polyme, nhóm th 2 vi enzim, nhóm th 3 có th liên kt vi c 2 u thc bit ca cht này là  ch din tích ca nó quyt nh các tính cht ion ca phc enzim – xenluloza. Phc này có th trung tính, âm (anion), dng (cation) ph thuc vào bn cht ca cht gn vi th 3 Trong khi ó mt s các phng pháp cnh enzim khác ch do phc mono – ion (cation hoc anion). - Glutaraldehyt cng hay c s dng làm cu ni  gn enzim vì nó cha 2 nhóm – CHO  hai u,  pH trung tính s kiên kt c vi các nhóm amin – NH 2 t do. Nh vy mt u s gn vào cht mang, còn u kia gn vào enzim. 5.3.2. p ph vt lý: Cht hp ph và enzim c trn ln vi nhau trong mt khong thi gian nht nh  s hp ph xy ra nh tng tác b mt nh: liên kt ion, liên kt a béo (k nc), liên kt hidro, lc Vandewaals. Nhc m ca phng pháp này chính là quá trình hp ph enzim có th xy ra do s thay i pH, nhit , thành phn ion. - Các cht mang hu c dùng cho hp ph vt lý: dn xut polyme t nhiên, DEAE – xenluloza, DEAF – sephadex. ây là các amonit (mang n (-)) - Cht st ký xotein - k nc nh: agaroza ci bin có gn các nhóm mang n  u chui cacbon hydrat ca nó (hai loi lc hp ph là lc tnh n và lc k nc gn CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 46 t không thun nghch vi nhiu enzim). Nhóm enzim thích hp nht cho c cht loi này là lipaza (c cht k nc, không tan trong nc (a béo). - Các cht mang vô c: kim loi kim th, Al 2 O 3 , TiO 2 nh: thu tinh xp, silicagel, silochrom. u m ca loi cht mang này là  xp ln, tính hp ph cao, ch to  ng ht  to reactor ct (ct phn ng). 5.3.3. Nhng u cn lu ý khi thc hin vic cnh enzim: Khi la chn phng pháp và th nghim cnh enzim cn lu ý các u sau: - Enzim phi n nh trong nhng u kin xy ra phn ng: quan trng nht là hot lc enzim và  bn ca nó theo thi gian phn ng, u này quyt nh hiu sut phn ng, hiu sut tng thu hi và hiu qu ca toàn b quá trình (giá thành, giá tr khoa c và thc tin, giá tr kinh t - xã hi) - u có thc thì các hp cht tham gia phn ng to liên kt ngang (gia cht mang và enzim) s ch yu ch tng tác vi nhng nhóm chc nng nm ngoài tâm hot ng ca enzim. Nu u kin này không thc hin c hoàn toàn thì cht tham gia phn ng to liên kt ngang phi có kích thc ln không cho phép nó xâm nhp, nh ng n trung tâm hot ng ca enzim. - Trung tâm hot ng ca enzim phi luôn luôn c bo v (nu thc hin c) ng các phng pháp khác nhau. Chng hn nu enzim vi tâm hot ng có nhóm – SH thì cn phi x lý s b bng glutation hay systein và ch tái hot hoá enzim sau khi ã gn nó vào cht mang. Hoc có th che chn tâm hot ng bng cách b sung vào n hp phn ng c cht ã c bão hoà bi enzim (nng  c cht cao nht mà enzim có th thc hin c phn ng xúc tác) - Khi ra thit b phn ng  phc hi enzim, không c làm nh hng xu n hot tính enzim ã c gn vào cht mang. - Khi la chn cht mang (h c nh) cn phi  ý n phn ng enzim s din ra  th sao cho không làm nh hng thm chí hu hoi ngay bn thân cht mang và sn phm phn ng không c c ch hot ng ca enzim. Chng hn không th gn enzim xenluloza vào chính cht mang là xenluloza và các dn xut ca nó cng không th tin hành phn ng thu phân xenluloza trên chính cht mang này. -  ý n  bn ca cht mang (bn c hc, thu lc hc (ra trôi), bn nhit, bn gel) nht là khi phn ng trong nhng ct công sut ln. 5.4. nh hng ca s cnh n hottính ca enzim. Khi gn vào cht mang, enzim s b gii hn hot ng trong mt phm vi môi trng xác nh, lúc ó cu trúc không gian ca phân t enzim (và ca c t hp) có th b thay i do ó có th làm bin i mt s tính cht ca enzim ban u. Ví d có th thay i khong pH hot ng, nhit  hot ng (và do ó có th thay i pH op , t op ), tính c CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 47 hiu ca enzim cng nh hng s Michoelis. Tt nhiên nhng thay i này ph thuc nhiu vào bn cht ca cht mang, nói chung enzim cnh thng tro nên bn vi các u t gây bin tính hn (vì nó ã c “làm bn” phn nào bi cht mang) nhng  hot ng riêng thng thp hn enzim ban u. 5.4.1. Hot tính ca enzim cnh ph thuc vào bn cht ca cht mang: Khi enzim c gii hn trong phm vi môi trng cht mang xác nh s xy ra mt  kiu tng tác khác nhau ca cht mang lên môi trng hot ng vi mô bao xung quanh phân t enzim cnh - Kiu th nht c gi là “hiu ng phân phi” (hay “hiu ng y – kéo”) trong ó cht mang polyme nh nhng tính cht c trng s lôi kéo ti b mt ca nó, hoc y khi có c cht,sn phm phn ng và các cht khác làm tng hay gim tng i ng  ca chúng trong phm vi môi trng vi mô nm sát cnh enzim. - Kiu th hai c gi là “hiu ng ngn chn” tc là bn thân cht mang polyme ngn cn s khuch tán t do ca các phân t hng ti enzim (trong ó có c cht) cng nhi khi enzim (trong ó có sn phm phn ng). Tó nh hng trc tip hay gián tip n hiu qu xúc tác ca enzim. Ví dn hình là trng hp enzim c cnh bng cht mang polyanion (poly ion mang n (-)), lúc ó cht mang s tác ng mnh n c cht cation (mang n (+)). Khi ó c cht kiu này s tp trung xung quanh trng tác dng vi mô ca cht mang làm cho mt  (nng ) ca nó s cao hn so vi mt  trung bình trong toàn h. ng thi cht mang cng s lôi kéo bt k cation nào khác, chng hn nh các proton H + hay hidroxoni H 3 O + (do nc có tính n ly yu ). Ngha là ng  H + tng lên xung quanh trng tác dng ca cht mang (và cng là ca enzim) làm cho pH gim xung thp hn so vi pH trung binh trong toàn h. Trong trng hp polyme cht mang và c cht mang n ging nhau thì quá trình trên li xy ra hoàn toàn ngc li. Ngha là nng  H + li gim i xung quanh trng tác dng ca cht mang (và cng là ca enzim) làm cho pH tng lên cao hn so vi pH trung bình trong toàn h. Nh vy ta nhn thy là khi s dng polyme dng polyion làm cht mang s không có  phân bu các ion trong h, lúc ó nng  ion trong môi trng vi mô xung quanh enzim s khác vi nng  ca chúng trong h. u ó làm cho quá trình ng hc ca enzim s rt phc tp, s có s sai khác (nhiu khi là áng k) các thông s liên quan nh: nng  c cht, sn phm phn ng, pH, t 0 . t ví d khi kho sát s c nh papain trên màng xenluloza nitrat  thu phân gelatin cho kt qu tn hn so vi khi enzim  dung dch t do (hot  enzim cnh thp hn hot  enzim t do). ó là do có cht mang xenluloza nitrat ã hp th gelatin, bin tính s b nó  to u kin thun li cho s thu phân ca enzim ính kèm.  th mô t hiu ng phân b li proton làm gim pH xung quanh enzim c nh (cht mang là polyanion) nh sau: Gi s pH op ca enzim t do trong dung dch phn dng là 8 và ng cong 1 mô t n tc phn ng ph thuc vào pH có dng hình chuông nh trên. ng cong 2 mô t n tc phn ng ph thuc vào pH khi enzim cnh t bào trên poly polianion. Trong 2H 2 O H 3 O + + OH CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 48 khi  pH = 8 ta có vn tc phn ng bng 50%V max , t c giá tr này giá tr pH bên trong (pH xung quanh môi trng vi mô ca enzim) ch cn là 7. Nh vy mc dù  pH  thng bng 8 nhng thc t enzim ã hot ng ôh pH thp hn (=7) mà ó hot tính ca nó bng 50% giá tr cc i (m A). Do vy phi tng giá tr pH e (pH of effect) i 9  khi ó pH i = 8 thì enzim s th hin hot tính ti a ca nó (m B) Nh vy ta ã thy có hin tng xê dch (sai khác) giá tr trong h.  khc phc ngi ta thêm vào h nhng phn ng trao i ion n hình (lc ion,  phân ly cao)  ngn cn nh hng ca các nhóm ion nh hng n cht mang và làm dch chuyn pH hot ng cng nh pH op . Cng có th dùng dung dch m nng  cao  khc phc c hin tng này. Cht mang phân t lng càng ln thì càng gim áng k hot tính enzim gn voà ó so vi cht mang có phân t lng càng nh. u này c gii thích bi s cn tr không gian ca phân t cht mang i vi phân t c cht trong vùng trung tâm hot ng ca enzim. 5.4.2. Hot tính enzim c nh ph thuc vào s khuch tán ca c cht, sn phm và các phân t khác: c  khuch tán ca c cht, sn phm và các cht khác ph thuc vào các yu t: kích thc l gel ca cht mang polyme; trng lng phân t ca c cht; s sai khác do “hiu ng phân phi” (sai khác v nng , pH, t 0 hot ng .). Trong ó ng kính l gel ca cht mang polyme và trng lng phân t ca c cht óng vai trò quan trng nht. Hiu ng phân phi làm xut hin gradien nng  c cht và sn phm trong khi tin hành phn ng, có tho c và vit các phng trình ng hc cho chúng. Nhng gii n khuch tán có th c th hin hai dng hàng rào khuch tán bên ngoài và bên trong. Hàng rào khuch tán bên ngoài có c do có s tn ti ca lp mng dung môi không  pha trn bao xung quanh ht polyme. S hình thành nó nh có s kt hp ca khuch tán phân t thng (chuyn ng Brown) và si lu (do s xut hin gradien nng  hay gradien nhit ).  dày ca lp khuch tán bên ngoài ph thuc rt nhiu vào c  khuy trn dung môi, ây là yu t ht sc quan trng khi tin hành phn ng enzim cnh. Hàng rào khuch tán bên trong do chính cht mang to ra và ch có s khuch tán phân  thng (chuyn ng Brown), không bnh hng bi tc  pha trn. Hàng rào này  t ra có nh hng to ln hn nu enim c cnh vào trong lòng cht mang ch không phi gn nó vào b mt ca cht mang. Nhng gii hn khuch tán này cùng vi hiu ng phân phi làm cho các thông s công ngh thay i (có khi là khá ln) so vi khi tin hành vi enzim t do, ây là u n chú ý khi mô hình hoá, thit lp quy trình công ngh. 5.5. Các reactor cha enzim cnh: Reactor (ct phn ng) cha enzim c s dng  to tip xúc gia enzim và c cht trong mt khong thi gian  ln  tin hành phn ng xúc tác, ng thi tách sn phm phn ng -  li enzim. CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 49 5.5.1. Reactor hot dng theo chu k. Thc tó là nhng b ln hay bn cha enzim và c cht có trang b máng khuy. Nh vy dung tích làm vic, hiu sut chuyn hoá c cnh và ngi ta cho phn ng tin hành trit  theo tính toán. Sau ó tháo cn toàn b tách sn phm khi enzim (nh vy là xong 1 chu k làm vic) ri li chun b tin hành m khác. Trong trng hp enzim tan (ln ln c cht còn d, sn phm phn ng vi enzim) thì  tách sn phm ngi ta thng làm bin tính enzim (ví d bng cách x lý nhit). Phng cách s dng này có hiu qu kinh t nu dùng enzim r tin mà sn phm phn ng li có giá tr, enzim dùng xong không thu hi li c.  reactor kiu này có th dùng enzim t tin có th thu hi ê dùng li trc ht cn phi cnh nó thành enzim không tan. Sau chu  phn ng, ch phm enzim không tan c tách ra bng ly tâm hay lc. Mà trong thc  quy trình thu hi enzim này có th làm phá hu cu trúc ca ch phm enzim không tan, ngha là phá hu enzim. Vì vy reactor hot ng theo chu k thng c s dng i enzim tan r tin, không cn thu hi enzim, chi phí sn xut thp hn so vi các phng pháp khác. 5.5.2. Reactor hot ng theo kiu dòng chy: Nguyên tc hot ng ca reactor dòng chy là s b sung c cht (liên tc hay gián n, theo chu k) theo dòng nht nh (tc  np, dung tích np) và sn phm phn ng ng c ly ra theo hình thc tng t vi quá trình np c cht.Ngi ta chia ra 2 nhóm reactor dòng chy: nhóm có khuy trn và nhóm không khuy trn khi hot ng. - Reactor dòng chy có khuy trn là mt b (bn hay thit b) có máng khuy, có ng dn np c cht và ng ly hn hp hay sn phm phn ng ra khi b (nguyên c chemistat trong nuôi cy vi sinh vt). Các thông s hot ng ca thit b nh: dung tích, tc  b sung c cht, hot tính enzim, tc  tháo sn phm, thi gian duy trì phn ng và chu k làm vic thng c ti u hoá theo nhng mc tiêu ã nh. Tuy nhiên do s khuy trn nên các ht enzim cnh phân b trong toàn dung tích làm vic ca thit b và c tháo ra ngoài cùng vi sn phm phn ng.  duy trì enzim cnh cn phi liên tc hay nh k b sung mt lng ch phm enzim cnh ng cách: tách enzim ra khi sn phm bng cách lc, hot hoá tr li ri a vào thit ; hoc cnh enzim trc tip trên cánh khuy, nh k b sung, thay th mi. Reactor dòng chy có khuy trn có th kt hp vi quá trình siêu lc, u này cho phép s dng enzim cnh  dng tan trong các reactor, c bit thích hp vi c cht không tan hay  dng keo. - Reactor dòng chy không khuy trn (xem hình 63 trang 218 ca giáo trình). Enzim cnh c nhi vào ct, dch c cht chy t trên xung ngm qua lp enzim và u di s nhn c dch sn phm xúc tác. Mt reactor dòng chy lý tng khi lp  cht chy qua toàn b din tích mt ct ngang ca ct vi tc  không i - ây là h thng reactor tách - y lý tng. Trong thc t dch c cht cng có tha t di lên, chy trên qua ct còn sn phm ly ra t trên. S và nguyên tc làm vic xem hình 63. [...]... NGH ENZIM 5.6 S d ng enzim c GVC: Ths Tr n Xuân Ng ch nh trong y h c và trong công nghi p: Vi c ng d ng enzim c nh ã cho phép t o ra môt s công ngh hoàn toàn trong y c và công nghi p - Trong y h c + S d ng enzim c nh làm các n i quan gi nh : bàng quan, niêm m c + S d ng enzim d i d ng micro capsul a enzim vào ch a b nh thi u enzim nh ng không gây nên các ph n ng ph + Ngiên c u c u trúc phân t enzim, ... Tanabe Seizaku (Nh t B n) s d ng enzim c nh amino acylaza (AACD: enzim ng phân hoá chuy n t d ng D sang d ng L c a axit amin) chuy n hoá h n h p D,L axit amin Trong ó enzim aminoacylaza c c nh trên DEAE Sephadex b ng liên k t ion v i th i gian bán hu là 65 ngày 500C - Ph ng pháp c nh: 1000-1700 lít d ch enzim l c u v i DEAE Sephadex trong 0 35 C, pH=7.0 sau ó l c và r a s ch, enzim sau khi g n vào ch t mang... ho t tính 50-60% ho t tính enzim t do Ch ph m enzim c nh sau ó c nh ivào c t ph n ng (bioreactor) sau 65 ngày làm vi c s c tái sinh v i d ch enzim m i, c nh v y sau 8 n m m i ph i thay ch t mang m i công ngh s n xu t L axit amin c a hãng TANABE SEIZAKY Raxemat hoá Acyl-D-axitamin n h p acylL,D-axit amin c L, axit amin tinh lý nhi t Ly tâm th t c i Trang: 50 tinh CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths Tr n Xuân Ng... enzim, c u t o màng t bào, mô hình hoá h th ng enzim trong t bào - Trong côncg nghi p + S d ng reactor dòng ch y không khu y tr n: Nakhapetian (1976) ã cho dung d ch tinh b t h hoá 35% liên t c qua c t ch a glucoamylaza không tan ng hoá Sau 22,6 ngày ph n ng t = 450C, ho t enzim trong c t v n còn 50% Hi n nay là tho mãn nhu c u v m ch nha c a c n c + Các ch ph m enzim không tan dùng trong công ngh th c ph... i qui trình c s d ng enzim hoà tan Qui trình t ng t c hãng SNAM-Progetti(Italy) ng d ng trên c s c nh enzim aminoacylaza trong s i triaxetat xenluloza Ch ph m ho t ng liên t c 50 ngày ch m t t i a 30% ho t tính C 1Kg enzim c nh cho phép s n xu t c 400Kg Ltriptofan 5.6.2 n xu t L-axit aspartic b ng enzim asparza c nh HOOC – CH2 – CH – COOH Axit L-aspatic NH2 Là c ch t trung gian c a r t nhi u quá trình... ch hoá sinh c a s t o thành axit aspartic là quá trình t o liên k t ng hoá tr gi a NH3 v i axit fumaric b i enzim aspartaza: HOOC – CH = CH – COOH + NH3 E.aspartaza HOOC – CH2 – CH – COOH NH2 Trang: 51 CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths Tr n Xuân Ng ch T n m 1973, hãng TANABE SEIZAKY ã s d ng t bào có ch a enzim aspartaza (nòi vi khu n Brevibacterium flavum nuôi c y trên môi tr ng r ng giàu biotin) và gói nó trong... SEIZAKU Enzim fumaraza cc nh trong gel polyacriamit, c ch ph n ng ph t o axit suxinic, t bào c nh c x lý b ng axit uric 0,2% 370C, pH = 7,5 trong 20h Ch ph m có bán chu k ho t ng là 55 ngày 370C C ch t c s d ng là mu i Na 0 fumarar n ng 1mol/lit, pH = 7, t=37 C, v n t c dòng ch y 0,2 th tích bioreactor/h Trang: 52 CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths Tr n Xuân Ng ch Hãng SNAM Progetti l i s d ng tr c ti p enzim fumaraza... sinh h penicillin Hi n nay toàn b 6 – APA c a th gi i u cs n xu t b ng ph ng pháp s d ng enzim penicillinamidaza c nh ây là enzim n i bào khi sinh t ng h p b i vi khu n Esterichia-Coli, Bacterium faecalic, alacaligus v i môi tr ng cazein thu phân, cao ngô, glucoza, axit phelnylaxetic làm ch t c m ng Ph ng pháp gói enzim c a hãng SNAM Progetti (Italy) nh sau: 10 lit dung d ch penicillinamidaza pH=8 tr... M t s lo i axit amin s n xu t b i enzim c nh aminvacylaza trên PEAESephadex (c t dung tích 1m3) c a hãng TANABE SEIZAKU Axit amin v n t c n p 1000lit/h n ph m axit amin/24h-Kg L-Alanin 1,0 214 L-metionin 2,0 715 L1,5 594 phenylalanin 0,9 441 L-triptofan 1,8 505 L-valin Hi n nay hãng này s n xu t 700-1000 Kg axit amin/ngày v i chi phí 60% so v i qui trình c s d ng enzim hoà tan Qui trình t ng t c hãng... thu h i b ng cách k t t a v i CaCO3 5.6.4 n xu t nhóm penixilin-axit 6 amino penicillinic (6-APA) b ng enzim c nh penicillinamidaza Penicillin là m t nhóm ch t có tính kháng sinh, c u t o chung là: V i R là g c axyl thì ta có penicillin G – là penicillin th ng m i và sinh ho t ph bi n nh t hi n nay Enzim penicillinamidaza xúc tác thu phân benzyl penicllin (penicillin G) t o thành nhóm penicillin 6-APA . CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 44 Chng 5: ENZIM CNH 5.1. Gii thiu chung: Enzim cnh (hay enzim không tan) là enzim có s. S dng enzim cnh  làm các ni quan gi nh: bàng quan, niêm mc. + S dng enzim di dng micro capsul  a enzim vào cha bnh thiu enzim nhng