CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 68 Chng 7: PHNG PHÁP XÁC NH HOT  MT SÔ LOI ENZIM (Copfacto: cht phi hp hay cht cng tác ca enzim DEAE – celluloza: diethylamino – athylcelulose) 7.1. n vo hot : c  hot ng ca enzim trong ch phm là thông tin quan trng v lng enzim trong i tng nghiên cu, vì rng trong nhng u kin xác nh, tc  phn ng enzim t l vi lng enzim trong hn hp phn ng. Lng enzim theo quy c quc t c biu din bng n v enzim: n v tiêu chun enzim là lng enzim có kh nng xúc tác chuyn hóa 1 micro mol  cht sau 1 phút  nhng u kin xác nh cho trc - Trong trng hp enzim ch phân gii mt s liên kt ca phân t c cht (ví d proteinaza vi c cht protein, amilaza vi c cht tinh bt) thì n v hot  tiêu chun a enzim không tính micromol c cht b chuyn hoá mà tính bng micromol ng ng ca các nhóm tng ng c to thành. Tc là tính theo s liên kt (peptit hay glucozit) b phân gii. - Trong trng hp phn ng gia 2 loi phân t theo kiu thì n v enzim là lng enzim xúc tác chuyn hóa 1 micromol c cht A hoc B, hoc 2 micromol c cht A (hoc B) nu A=B sau 1 phút. - Khi xác nh hot  enzim trong pha lng (dch th) thì tính sn v enzim trong 100 ml. -  cht dùng các n v dn xut ca n v biu din: mili n v, kilô n v. - Trong quá trình tách và làm sch (tinh ch) enzim thì ánh giá hiu qu ca quá trình này, ngi ta dùng n v hot riêng: ó là sn v enzim tính trên 1 mg protein. n v này ánh giá mc  thun khit ca enzim. - u bit chính xác trng lng phân t ca enzim thì có th xác nh c hot  phân t ca nó: là s phân t c cht (hoc sng lng các nhóm tng ng) b chuyn hoá di tác dng ca 1 phân t enzim sau 1 phút. - u bit c s trung tâm hot ng trong phân t enzim có th bit c hot  ca trung tâm xúc tác. ó là s phân t c cht b chuyn hoá do 1 trung tâm xúc tác ca enzim sau 1 phút. Nh vy nu enzim ch có mt trung tâm xúc tác thì i lng này trùng vi hot  phân t enzim. - ng  enzim trong dung dch c biu din bng sn v hot ng trong 1 ml. - Nhng u cn lu ý khi xác nh hot  enzim: + Bn cht các enzim là protein nên thng không bn vng, rt nhy cm vi các tác nhân lý, hoá. Vì vy khi làm thí nghim vi enzim cn tránh các yu t có th gây A + B C + D CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 69 bin tính vô hot enzim nh: t 0 cao, pH quá axit, quá kim, kim loi nng và mui ca chúng .tránh to bt trong dung dch vì mt s enzim có th b kìm hãm trên b mt phân chia pha. + Các u kin (thông s) phn ng (t 0 , pH, áp sut .) phi  trong gii hn enzim có th tn ti bn vng và c gi cnh trong sut thi gian phn ng. Mun y phi tin hành phn ng trong dung dch có pH xác nh, bình phn ng phi t trong máy siêu n nhit, các cht phn ng (c cht, cofacto .) phi có nhit  ca bình phn ng trc khi np vào. + Phn ng enzim c tin hành trong u kin d c cht và cofacto. Cn tính trc  sao cho khi kt thúc phn ng ch cô  20% c cht ban u b chuyn hoá. trc ó cn xác nh nng  c cht thích hp cho phn ng bng các thí nghim qui hoch ng. + Thi gian xác nh hot  không nên quá lâu, thng trong khong 5 – 30 phút. t nht là xác nh tc  phn ng  phút u tiên (30 – 60s) vì tc  phn ng n nh enzim cha b các tác ng nh hng nhiu n hot . Trong mt s trng hp u hot  enzim quá thp hay cn nghiên cu nh hng ca mt s yu t hoá hc, hoá sinh (kim loi, gc axit, baz .) cn phi  enzim vi c cht có yu t kho sát trong thi gian  lâu (>1h). + Khi xác nh hot  enzim, bên cnh mu thí nghim (enzim tác dng vi c cht) cn làm mu kim tra (kim chng, mu trng) trong ó enzim ã b mt hot ng (hoc không có enzim) trc khi tip xúc vi c cht. Mu này cng thc hin ging mu thí nghim nhng ch khác là phi vô hot (ình ch hot ) enzim hoc là không thêm enzim. Hot  enzim c tính bng hiu s lng c cht (hay sn phm phn ng) gia mu thí nghim và kim tra. 7.2. Các phng pháp xác nh hot  enzim: Có th phân chia thành 2 loi phng pháp: liên tc và gián n. - Phng pháp liên tc: s dng máy móc, thit bc bit hot ng tng liên tc (chun , so sánh, o c) vi c cu tng ghi li liên tc s bin i ca các cht và các thông s phn ng (hin th bng bng, biu,  th, biu , enzim  .) trong sut thi gian tác dng ca enzim. Nh vy phng pháp này có nhiu u m, hoàn toàn tng, có kt qu ngay, cùng t lúc có th có nhiu mu theo mt chng trình nh sn. ây là xu hng và thc tin hin nay vi công ngh cao (high – tech) - Phng pháp gián n: cho enzim tác dng vi c cht, sau nhng khong thi gian nht nh thì ly mu phn ng  phân tích kt qu. CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 70 Có th gi phng pháp này là phng pháp cn nhng hin nay vn còn c s ng ph bin trng nghiên cu thm dò, s b, thí nghim i cng, nh tính. Ch có t s ít thao tác vi enzim tinh khit c xem là hin i. Sau ây ta xem xét mt s phng pháp c th. 7.2.1. Phng pháp o  nht: Thng dùng c cht ca enzim có  nht ln hn (hoc nh hn) sn phm phân hu ca nó. S bin i  nht này là thc o hot  enzim. Phng pháp này thng dùng  xác nh hot  enzim thu phân cho amylaza, proteinaza. 7.2.2. Phng pháp phân cc k: Thng dùng khi c cht ca enzim hoc sn phm phân gii ca nó có kh nng làm quay mt phng ánh sáng phân cc và góc quay riêng ca chúng có khác nhau. Ngi ta thng dùng phng pháp này  xác nh hot  ca saccaraza. C cht ca enzim này là ng saccaroza có góc quay riêng là +66,5 0 (phía phi). Sn phm thu phân ca nó là glucoza (góc quay riêng +52,5 0 ) và fructoza (góc quay riêng là -92,4 0 - phía trái). Khi enzim tác dng lên saccaroza theo mc  thu phân mà góc quay tng cng gim dn và chuyn t phi sang trái. ây là phn ng nghch o ng rt kinh n trong nghiên u ng hc phn ng, ng to ra gi là ng nghch o (t phi sang trái mt phng ánh sáng phân cc). Tác nhân xúc tác thông thng (không phi enzim) là axit vô  (HCl, H 2 SO 4 ). 7.2.3. Phng pháp áp k: c dùng khi phn ng enzim to thành hay hp th khí, chng hn các loi phn ng oxy hoá có s tham gia ca phân t oxy (oxy hoá hiu khí), decacboxy hoá, deamin hoá (loi CO 2 , NH 3 ). Ngoài ra có th dùng phng pháp này  xác nh hot  ca enzim trong quá trình phn ng không trc tip làm bin i th tích nhng kho thông qua các phn ng trung gian tip theo (th hin gián tip hot ng ca enzim và do ó th hin hot  ca nó) li to thành hoc hp th khí. Ví d: - Các phn ng to axit hu c do enzim oxy hoá kh lipaza xúc tác có th dung dch m bicacbonat (HCO 3 - )  to thành CO 2 (theo phn ng - Các phn ng deamin hoá di tác dng ca enzim peptithydrolaza, sau phn ng cho tác dng vi axit nit to thành N 2 - Các phn ng lên men cn (ym khí và hiu khí) có th thc hin trong bình Enron, hp th CO 2 bng dung dch BaSO 4 . 7.2.4. Phng pháp ph quang k: Thng dùng  xác nh hot  các enzim mà c cht, coenzim hoc sn phm phn ng có kh nng hp th ánh sáng khác nhau  nhng bc sóng xác nh. S bin i  p th bc sóng y trong quá trình phn nh là o hot  enzim. Phng pháp này c s dng rng rãi  nghiên cu các enzim thuc nhóm oxy hoá kh oxydoreductaza, chng hn: - Các ehydrogenaza vi coenzim NAD + hoc NADP + . Tc  phn ng enzim c xác nh theo mc  kh hoc oxy hoá coenzim ca chúng. Dng kh NADH, NADPH và dng oxy hoá ca các coenzim này khác nhau rõ rt v kh nng hp th bc sóng H + + HCO 3 - H 2 O + CO 2 ) (NH 3 + HNO HNO 3 + N) CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 71 340 nm, s bin i này phn ánh mc  chuyn hoá gia 2 dng và cng chính là tc  và hot  phn ng enzim. - Enzim tyrosunaza xúc tác s oxy hoá các hp cht phenol thành các quinon. Phn ng này làm tng  hp th  bc sóng 280 nm. ây là phng pháp xác nh hot  tyrosinaza (gi là phng pháp A hay phng pháp tyrosin 280). Tng t nh trên, EPPO xúc tác oxy hoá c cht pyrpcatechin. Phng pháp này ch cn lng nguyên liu nghiên cu rt ít, li có  nhy cao, cho phép xác nh nhanh chóng, chính xác hot  enzim. Vì vy ây là mt trong nhng phng pháp c s dng ph bin nht  nghiên cu enzim hc. Thm chí có trng p phn ng enzim không làm bin i rõ rt quang ph hp th thì mt tác nhân khác (enzim hay mt tác nhân khác) tác dng làm sn phm phm ng  thay i s hp th. 7.2.5. Phng pháp chun  liên tc: c dùng  nghiên cu các phn ng enzim mà kt qu ca nó to thành axit hoc baz. Lúc ó dùng thit b tng thêm kim hoc axit vào  gi pH môi trng phn ng cnh, ng thi tng ghi ng biu din lng kim hoc axit ã tiêu tn vào phn ng trung hoà. Lu lng kim hoc axit này phn ánh tc  phn ng enzim. Phng pháp này có thc mô t m rng ra  nghiên cu các i tng khác nhng trên nguyên tc liên tc nh lng (sn phm to thành hay lng c cht tiêu hao), chng hn gián tip o th oxy hoá kh vi n cc tiêu chun khi nghiên cu các enzim oxy hoá. 7.2.6. Phng pháp sc ký: ây là phng pháp hin i, hin nay c s dng rt nhiu và trong nhiu trng p dùng  tinh ch enzim. Tt c các phng pháp sc ký u có th áp dng  xác nh hot  enzim. T phng pháp lâu i nht nh sc ký giy, sc ký trao i ion cho n các phng pháp hin i nh sc ký lng cao áp, sc ký khí kt hp vi các phng pháp phân tích hin i khác (phân tích axit ami tng, cng hng t ht nhân, cc ph). Lng enzim và c cht cng nh sn phm phn ánh rt ít cng cho kt qu chính xác, nhanh chóng. 7.2.7. Phng pháp hoá hc: Dùng các phn ng hoá hc khác nhau  nh lng c cht b hao ht hoc sn phm phn ng to thành di tác dng ca enzim. Các phn ng này thuc loi at màu c trng, to màu vi thuc thc trng, nói chung là mt du hiu  nói lên mc  hay thi m kt thúc phn ng. (ví dm tng ng khi nh phân axit – baz c xác nh bi si màu fenolftalein, quì tím .) Trong tt c các phng pháp va nêu, tu theo u kin, yêu ccu nghiên cu thc t mà quyt nh phng thc tin hành (chng hn tin hành trong u kin thi gian nh nhau, hay nng  enzim, nng  c cht không i .) qui hoch thc nghim  xác nh các thông s ti u. 7.3. Chun b dch chit enzim  xác nh ho. Ch phm enzim có th dng rn, lng, bao gm giá th (c cht, cht n, ht cc) các b phn khác nhau ca c th sinh vt sinh enzim (mô, t bào, khun ty, bào t .) và CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 72 môi trng sinh tng hp enzim (ch yu là nc) có th cha c enzim trong ó. Trong quá trình nuôi cy, ny mm, enzim có th tin hành vào môi trng (enzim ngoi bào) hoc enzim tn ti trong t chc c th sinh vt (mô, t bào), vì vy phi cn x lý nhm y enzim  xác nh. -i enzim ngoi bào: + Nu quá trình nuôi cy hay tích lu enzim bng phng pháp b sâu trong môi trng lng. Sau khi ly mu xong cn làm sch nhanh chóng xung 0 0 C ri ly tâm tc  cao 5000 – 6000 vòng/phút  thu c dung dch trong sut. + Nu quá trình nuôi cy hay tích lu enzim bng phng pháp b mt trên môi trng n (hay ht cc) thì ly mu 10 – 20 gam, chit rút bng dung dch m tng ng vi pH xác nh trong u kin lnh (0 0 C)  enzim khkông b bin tính hay gim hot tính, ng dung dch này khong 200 ml (gp 10 – 20 ln ch phm). Lc qua phu hay ly tâm vt  thu c dung dch trong sut. -i enzim ni bào: Phi phá v t bào  gii phóng enzim t do bng nhiu phng pháp: + Phng pháp c hc: ph bin nht là nghin thông thng (trong ci s, thu tinh, máy nghin quay tay, máy nghin có ng c), nghin vi cát, vn thu tinh. + Phng pháp vt lý: dùng sóng siêu âm  phá v cu trúc t bào, mô. + Phng pháp hoá sinh: dùng enzim thích hp (xenluloza, pectinaza)  phân hu màng t bào, mô  gii phóng enzim (trc ht có th nhn c t bào trn rt có giá tr trong nghiên cu t bào hc, enzim hc). Tip ó có th dùng các phng pháp chit rút thích hp (dùng dung dch m, dùng (NH 4 ) 2 SO 4 , axeton .) và hc  nhn c dung dch trong sut Trong trng hp sau khi xác nh xong hot  ca dch chit cn tính toán hot  a ch phm ban u (qui v hàm lng cht khô tuyt i) CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 73 TÀI LIU THAM KHO 1- Nguyn Trng Cn (ch biên), Nguyn Th Hin,  Th Giang, Trn Th Huyn, Công ngh emzim, NXB Nông Nghip TPHCM, 1998. 2- Nguyn Lân Dng, Phm Th Trân Châu, Nguyn Thanh Hin, Lê ình Lng, oàn Xuân Mn, Phm Vn Ty - Mt s phng pháp nghiên cu vi sinh vt c, tp III – NXBKH và k thut, Hà Ni 1987. 3- Lê ngc tú (ch biên) và các tác gi - hoá sinh công nghip NXBH và THCN 1977. 4- Lê ngc tú (ch biên) và các tác gi - enzym vi sinh vt, tp I, II - NXBKH và k thut, Hà Ni 1982. CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 74 c lc Chng 1: NGUYÊN LIU THU ENZIM VÀ PHÂN B 3 1.1. Ngun ng vt: 3 1.2. Ngun gc thc vt: 4 1.3. Ngun vi sinh vt: 4 Chng 2: N XUT CÁC CH PHM ENZIM T VI SINH VT 5 2.1. u hoà quá trình sinh tng hp enzim trong môi trng nuôi cy vi sinh vt 5 2.2. Tuyn chn và ci to ging vi sinh vt cho enzim có hot lc cao: .11 2.3. Phng pháp bo qun ging vi sinh vt : 12 2.4. Môi trng nuôi cy vi sinh vt sinh tng hp enzim: 13 2.5. Các phng pháp nuôi cy vi sinh vt: 17 2.6. Tách và làm sch ch phm enzym : 22 Chng 3:  THUT SN XUT CH PHM T HT CC NY MM (MALT) .24 3.1. Nguyên liu i mch: 24 3.2. Làm sch và phân loi ht: .25 3.3. a, sát trùng và ngâm ht: 26 3.4. y mm: .28 3.5. y malt: 34 3.6. Tách mm, r, bo qun malt: .37 3.7.  thut sn xut mt s loi malt c bit: .38 Chng 4: N XUT ENZIM T THC VT 40 4.1. n xut ureaza tu ra: .40 4.2. Thu nhn bromelain t da: 40 Chng 5: ENZIM CNH .44 5.1. Gii thiu chung: 44 5.2. t s phng pháp ch yu ch to enzim cnh : 44 5.3. t s liên kt trong vic cnh enzim. 45 5.4. nh hng ca s cnh n hottính ca enzim .46 5.5. Các reactor cha enzim cnh: .48 5.6. . S dng enzim cnh trong y hc và trong công nghip: .50 Chng 6: GII THIU MT S LOI ENZIM CH YU VÀ KH NNG NG NG 55 6.1. Amylaza 55 6.2. Proteaza .58 6.3. Pectinaza 60 6.4. Xenluloza: .64 6.5. Saccaraza và glucooxydaza. 66 Chng 7: PHNG PHÁP XÁC NH HOT  MT SÔ LOI ENZIM 68 7.1. n vo hot : .68 CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 75 7.2. Các phng pháp xác nh hot  enzim: .69 7.3. Chun b dch chit enzim  xác nh ho 71 . NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch Trang: 68 Chng 7: PHNG PHÁP XÁC NH HOT  MT SÔ LOI ENZIM (Copfacto: cht phi hp hay cht cng tác ca enzim. vi lng enzim trong hn hp phn ng. Lng enzim theo quy c quc t c biu din bng n v enzim: n v tiêu chun enzim là lng enzim có kh