Đang tải... (xem toàn văn)
ứng dụng kỹ thuật multiplex – pcr để phát hiện một số gen độc lực của nhóm escherichia coli sản sinh độc tố shiga (stec) phân lập được từ phân bò, heo tiêu chảy và thịt bò
1 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Escherichia coli (E coli) vi khuẩn phổ biến đường tiêu hóa người động vật máu nóng Hầu hết dịng E coli tồn cách tự nhiên không gây hại đường tiêu hóa Tuy nhiên, số trường hợp, sinh lý thể thay đổi, stress, loạn khuẩn xảy ra, …thì số dịng E coli độc gây bệnh người số lồi động vật Dựa vào đặc điểm gây bệnh, người ta chia E coli thành nhiều nhóm Mỗi nhóm có yếu tố độc lực khác quy định gen độc lực khác Một số gen độc lực quan trọng E coli như: gen ehxA, stx1, stx2, uid nhóm STEC (Shiga toxigenic E coli); gen eae nhóm STEC EPEC (Enteropathogenic E coli); … Nhìn chung, E coli phân lập dễ dàng khắp nơi môi trường nhiễm phân Ngồi ra, E coli cịn phân lập từ vùng nước ấm, không bị ô nhiễm hữu cơ; vi sinh vật tồn phát triển lâu môi trường Với phân bố rộng rãi vậy, E coli dễ dàng vấy nhiễm vào nguyên liệu thức ăn hay nguồn nước quy trình sản xuất khơng đảm bảo vệ sinh nghiêm ngặt Từ đó, gây nên bệnh rối loạn đường tiêu hóa, nhiễm trùng đường tiết niệu, có trường hợp gây tử vong cho người gia súc Do vậy, việc xác định gen độc lực E coli phân gia súc bình thường tiêu chảy cần thiết, góp phần việc chẩn đoán bệnh động vật đánh giá nguy truyền lây sang người qua đường thực phẩm Từ đó, có biện pháp phịng ngừa hữu hiệu nhằm bảo vệ sức khỏe cho người vật nuôi Những tiến công nghệ sinh học với phương pháp PCR giúp chẩn đốn xác, hiệu thời gian ngắn so với phương pháp truyền thống (nuôi cấy, phân lập, …) Vì vậy, đề tài tiến hành sử dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát đồng thời gen độc: stx1, stx2, eae, ehxA, uid E coli phân lập từ phân bò, heo tiêu chảy thịt bò Hy vọng tương lai, đề tài ứng dụng vào thực tiễn chẩn đoán tầm soát bệnh cho gia súc cho người qua đường thực phẩm 1.2 Mục tiêu – yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu - Phát gen độc lực stx1, stx2, eae, ehxA uid E coli, đặc biệt nhóm STEC 1.2.2 Yêu cầu - Phân lập E coli từ phân, thịt số loại môi trường chọn lọc (MAC, SMAC, CT - SMAC) - Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR phát số gen độc lực E coli phân lập Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn E coli Vi khuẩn E coli sống bình thường ruột người động vật, nhiều ruột già Vi khuẩn theo phân mơi trường bên ngồi gây nhiễm cho nước, đất, khơng khí, dụng cụ giết mổ, ngun liệu sử dụng chế biến thực phẩm, … 2.1.1 Đặc điểm sinh học Phân loại: vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia Hình thái: trực khuẩn, gram âm, di động, khơng bào tử, giáp mơ, có lơng tơ xung quanh Kích thước: khoảng 0,5 µm – µm Đặc tính ni cấy: vi khuẩn hiếu khí yếm khí tùy nghi Có thể sinh trưởng nhiệt độ 15 - 400C nhiệt độ thích hợp 370C, pH từ 6,4 – 7,4 Mọc tốt mơi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 hình thành khuẩn lạc tròn, ướt, trắng đục, khoảng – mm Đặc tính sinh hóa: E coli lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrate thành nitrite Để phân biệt E coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường sử dụng thử nghiệm IMViC E coli cho kết IMViC là: + + - - hay - + - - (FAO, 1992) 2.1.2 Yếu tố kháng nguyên Vi khuẩn đường ruột E coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp Dựa vào tính chất kháng nguyên, người ta phân chia vi khuẩn loại thành tuýp huyết (serotype) khác (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, 1996): Kháng nguyên thân O (somatic antigen) kháng nguyên vách tế bào, cấu tạo lipopolysaccharide, có 150 loại khác Đặc tính kháng nguyên O là: Chịu nhiệt, không bị hủy đun nóng 100oC Kháng cồn, khơng bị hủy tiếp xúc với cồn 50% Bị hủy formol 5% Rất độc, cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24 Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết tương ứng xảy phản ứng ngưng kết O Kháng nguyên O giữ vai trò định khả gây bệnh dịng vi khuẩn có tính chất chun biệt cho lồi vật chủ Kháng ngun lơng H (flagellar antigen): có 50 loại khác nhau, cấu tạo protein có tính chất khơng chịu nhiệt, bị hủy cồn 50% proteinase, không bị hủy formol 5% Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng xảy tượng ngưng kết H Kháng ngun giáp mơ K (capsular antigen): có 100 loại khác nằm kháng nguyên O Kháng nguyên K polysaccharide protein Nếu kháng nguyên K che phủ hồn tồn thân vi khuẩn ngăn cản phản ứng ngưng kết O Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen) giúp E coli bám vào tế bào biểu mơ trước xâm lấn đường tiêu hóa hay đường tiết niệu Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): có dạng hình sợi, dài khoảng µm, thẳng hay xoắn, đường kính 2,1 – nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc ruột nên quan trọng khả gây bệnh vi khuẩn Hiện có 700 tuýp huyết E coli từ tổ hợp nhóm kháng nguyên O, H, K, F Dựa vào đó, người ta định danh vi khuẩn 2.1.3 Phân loại E coli Để phân loại E coli gây bệnh, người ta dựa vào đặc điểm sinh bệnh như: gen độc lực mã hóa protein gây bệnh cho vật chủ, tác động khác lên màng nhầy ruột, hội chứng lâm sàng khác mặt dịch tễ bệnh Có nhóm E coli gây bệnh (Keskimaki, 2001): (1) E coli sinh độc tố Shiga (STEC- Shiga toxigenic E coli hay VTECVerotoxigenic E coli EHEC Enterohemorrhagic E coli ) (2) E coli gây bệnh đường ruột (EPEC- Enteropathogenic E coli) (3) E coli sinh độc tố đường ruột (ETEC- Enterotoxigenic E coli) (4) E coli bám dính kết tập ruột (EAEC hay EaggEC- Enteroaggregative E coli) (5) E coli công hay xâm lấn đường ruột (EIEC- Enteroinvasive E coli) 2.2 Shiga toxigenic E coli (STEC) Nhóm STEC kết tội liên quan đến nhiều đợt dịch bệnh viêm dày, đe dọa sức khỏe cộng đồng Vào năm đầu thập niên 1980, dòng STEC gây đợt dịch liên quan đến hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC) hội chứng huyết niệu (HUS) HUS biểu ba triệu chứng điển hình suy thận cấp, giảm tiểu cầu thiếu máu tan huyết tổn thương mao mạch Bao gồm nhiều serotype khác O26, O111, O113, O124, O145, O157, … (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, 1996) Hiện nay, người ta cơng nhận dịng STEC gây bệnh nghiêm trọng cho người, đặc biệt O157:H7 serotype STEC gây nhiều ổ dịch lớn khắp giới (Smith ctv, 1988) 2.2.1 Thuật ngữ Những hướng khác nghiên cứu đưa thuật ngữ khác để gọi tên cho nhóm E coli Thuật ngữ Verotoxigenic E coli hay Verocytotoxigenic E coli (VTEC) Konowalchuk ctv (1977) đặt cho nhóm phát việc sản xuất độc tố gây độc dòng tế bào Vero (ở thận khỉ mặt xanh châu Phi) Thuật ngữ Enterohemorrhagic E coli ( EHEC) dòng E coli gây HC HUS (Nataro Kaper, 1998) Và thuật ngữ Shiga toxin-producing E coli (STEC) serotype E coli sản sinh độc tố gây độc tế bào giống độc tố vi khuẩn Shigella (Calderwood ctv, 1996) STEC VTEC hai thuật ngữ tương đương nhau, hai đề cập đến E coli sản sinh hay nhiều độc tố gây độc tế bào Tuy nhiên, khơng phải có gen sản sinh độc tố gây bệnh khơng có yếu tố độc lực khác Những dòng E coli mang gen sản sinh độc tố diện ruột gia súc khỏe mạnh với số lượng ít, dịng thiếu hay vài yếu tố độc lực khác STEC (Beutin ctv, 1995) Do đó, khơng phải tất STEC có khả gây bệnh (Nataro Kaper, 1998) 2.2.2 Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh STEC 2.2.2.1 Độc tố Shiga (Stx) Shigella dysenteriae Kiyoshi Shiga phát năm 1897, sản sinh độc tố thường gọi Shiga Và sau người ta phát STEC sản xuất độc tố tác động tương tự Shiga (Shiga-like toxin) (Nataro Kaper, 1998) Stx ngoại độc tố không bền với nhiệt, tác động lên ruột lẫn hệ thần kinh trung ương Ở ruột, E coli gây tiêu chảy, đồng thời ức chế hấp thu đường axit amin ruột non Ở hệ thần kinh, gây biểu lâm sàng trầm trọng tử vong (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, 1996) Trong số 200 serotype E coli sản sinh độc tố Stx có 50 serotype gây HC hay HUS người (Nataro Kaper, 1998) Cấu trúc tổ chức gen stx: họ độc tố Stx STEC gồm hai nhóm khơng phản ứng chéo với Stx1 Stx2 Trong Stx1 có tính bảo tồn cao Stx2 thay đổi trình tự, tạo nhiều biến chủng Stx2c, Stx2hp, Stx2e Một dịng STEC sản sinh Stx1 hay Stx2, Stx1 lẫn Stx2, chí nhiều dạng Stx2 Những nghiên cứu đầu thập niên 80 xác định Stx1 Stx2 mã hóa thực khuẩn thể thực khuẩn thể chèn vào nhiễm sắc thể E coli (O’Brien ctv, 1984) Bảng 2.1 Danh pháp thành viên họ Stx Shiga toxin (Stx) Tên gọi Gen Protein stx Stx Shiga like toxin I (SLT_I) hay Verotoxin (VT1) stx1 Stx1 SLT_II hay VT2 stx2 Stx2 STL_II c hay VT2c stx2c Stx2c Tên gọi trước STL_II e hay VT2e stx2e Stx2e (Nguồn: Calderwood ctv, 1996) Tất độc tố Stx gồm hai thành phần cấu tạo (Paton Paton, 1998): - Tiểu đơn vị A , 32 kDa, gồm peptide A1 28 kDa peptide A2 kDa nối với cầu nối disulfit Peptide A1 có hoạt tính enzyme peptide A2 có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vị A vào tiểu đơn vị B - Năm tiểu đơn vị B, có trọng lượng phân tử 7,7 kDa Các tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với thụ thể đặc hiệu Vai trị Stx sinh bệnh: Để gây bệnh, trước tiên Stx phải tiếp nhận thụ thể đặc hiệu Các nghiên cứu cho thấy Stx có tính chất gây độc trực tiếp lên tế bào ruột chúng nhắm đến thụ thể Gb (globotriaosylceramide), dạng thụ thể glycolipid, nhung mao tế bào biểu mô ruột động vật (Stx2e có thụ thể Gb4) Gb3 Gb4 cịn tìm thấy tế bào nội mơ thận, tế bào Vero, tế bào Hela Nhờ tính đặc hiệu tương tác phân bố thụ thể thay đổi theo loại tế bào ảnh hưởng đến cách sinh bệnh (Lingwood, 1996) Sau làm hư hại tế bào biểu mô, Stx xuyên qua hàng rào biểu mơ, xâm nhập vào dịng máu tiến đến mơ đích khác có chứa thụ thể glycolipid, gây tổn thương tế bào nội mạch, tế bào thận … Cụ thể tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với thụ thể đặc hiệu Sau chuyển vào bên tế bào, tiểu đơn vị A đến tế bào chất tác động lên tiểu phần 60S ribosome, cắt gốc adenin khỏi rRNA 28S ribosome, gây trở ngại cho tổng hợp protein Vì khơng tổng hợp protein, tế bào bị Stx tác động chết Hậu gây tiêu chảy, viêm kết tràng xuất huyết (HC) hội chứng huyết niệu (HUS) Trong đó, hậu Stx2e tượng phù thủng heo sau cai sữa (trích dẫn Lê Thị Mai Khanh, 2004) Ảnh hưởng loại Stx sinh bệnh: Các nghiên cứu dịch tễ dòng STEC sản sinh Stx2 gây bệnh trầm trọng so với dòng STEC sản sinh Stx1, bệnh nặng dòng STEC sản sinh Stx1 lẫn Stx2, chẳng hạn HUS (Paton Paton, 1998) 2.2.2.2 Enterohemolysin (haemolysin) Enterohemolysin tồn nhiều dạng (α, β …) E coli xâm lấn hay sinh độc tố đường ruột (Manil Daube, 2005) Độc tố tìm thấy hầu hết dịng O157:H7 dịng STEC khơng phải O157:H7 Enterohemolysin thuộc nhóm độc tố RTX (Repeats in toxin), gây dung giải tế bào tạo thành lỗ chân lông (RTX family of pore-forming cytolysin) (Paton Paton, 1998) Và RTX diện E coli gây bệnh đường huyết niệu (uropathogenic E coli), Pasteurella haemolytica tác nhân khác gây bệnh cho người, động vật (Bauer Welch, 1996) Haemolysin gen ehxA nằm plasmid 60 MDa pO157 mã hóa Gen ehxA có 60% tương đồng với hlyA; hlyA gen cấu trúc mã hóa haemolysin E coli gây bệnh đường huyết niệu cho kiểu dung huyết α-haemolysin (α-Hly) Ngoài ra, gen cấu trúc ehxA có nhiều biến thể, chia thành hai nhóm: nhóm gồm nhiều loại EHEC phổ biến O157:H7, O26, O111; đó, nhóm gồm nhiều serotype khác cịn lại có tính chất gây bệnh Gần đây, nghiên cứu di truyền học gen ehxA dịng STEC có trình tự giống 98%, có khác lớn số đoạn trình tự chuyên biệt (Feng Monday, 2000) Beutin ctv (1989) khảo sát khẳng định đa số dòng STEC cho kiểu dung huyết alpha (α-Hly) Các dòng sản sinh độc tố khơng gây dung huyết thạch máu tạo thành vòng dung huyết nhỏ, mờ thạch máu cừu (có bổ sung Ca2+) sau ủ qua đêm Hiện tại, phương thức tham gia gây bệnh enterohaemolysin chưa biết rõ Chính dung huyết trở thành nguồn cung cấp Fe kích thích phát triển STEC ống tiêu hoá (Law Kelly, 1995) 2.2.2.3 Yếu tố bám dính Yếu tố bám dính STEC chứng minh đóng vai trị quan trọng định vị vi khuẩn ruột Đó intimin, protein màng ngồi có trọng lượng phân tử 94-97 kDa Intimin mã hóa gen eae (E coli attaching and effacing) Intimin gây tổn thương dạng bám dính phá hủy, gọi bệnh tích A/E (attaching and effacing) ruột già vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg ctv, 1993) Có loại intimin, kí hiệu α, β, γ, ε Trong đó: α-intimin thường tìm thấy dịng E coli thuộc nhóm EPEC người chó β-intimin có dịng E coli thuộc nhóm EPEC EHEC người thỏ γ-intimin chủ yếu nhóm STEC người động vật, EPEC người ε-intimin diện dịng E coli thuộc nhóm EHEC bị người (Oswald ctv, 2000) Có liên quan chặt chẽ gen eae khả gây bệnh trầm trọng dòng STEC người HC HUS Nhiều nghiên cứu tỉ lệ dòng mang gen eae bệnh phẩm người cao gia súc Hơn nữa, diện dòng STEC mang gen eae gia súc thường liên quan đến dòng vi khuẩn E coli độc lực người mà khoa học biết, chúng thuộc serotype O157, O26, O111, … (Sandhu ctv, 1996) Ngồi cịn có yếu tố liên quan đến bám dính tác nhân khác gây bệnh đường ruột bao gồm fimbriae, OMPs (outer membrance proteins) LPS (lipopolysaccharide) 2.2.3 Cách sinh bệnh Cách sinh bệnh trình gồm nhiều bước, liên quan đến tương tác phức tạp số lượng vi khuẩn yếu tố vật chủ Cấp STEC qua đường miệng (chỉ cần liều thấp) vi khuẩn phải sống sót điều kiện mơi trường khắc nghiệt dày chúng phải cạnh tranh với vi khuẩn khác đường ruột để thiết lập định cư Vi khuẩn STEC sống sót đường ruột, nhân lên sản sinh Stx hấp thu qua tế bào biểu mơ ruột, dẫn truyền vào dịng máu Điều cho phép toxin đặc hiệu đến bề mặt tế bào đích gồm tế bào ruột lẫn nội quan khác (Paton Paton, 1998) Định cư vào ống tiêu hố: vi khuẩn có khả bám vào tế bào biểu mô ruột định cư ống tiêu hoá người yếu tố định độc lực Người ta ước tính liều gây nhiễm vài dòng STEC (O111:H- O157:H7) khoảng 1–100 CFU (colony forming unit) (Paton ctv, 1996) 10 Sức đề kháng acid STEC: Nét đặc trưng dòng STEC khả định cư ống tiêu hóa người, với số lượng cảm nhiễm thấp STEC đề kháng pH acid dày Do đó, dịng STEC O157:H7 cịn sống sót thực phẩm acid cao (Leyer ctv, 1995) Tính trạng điều hịa gen rpoS Gen có khả giúp vi khuẩn E coli kéo dài thời gian sống sót pH 2,5 (Paton Paton, 1998) Gần đây, Waterman Small (1996) báo cáo tình trạng đột biến gen Điều góp phần giải thích dịng STEC có khả gây cảm nhiễm khác Kiểu bám vào tế bào biểu mô ruột: STEC có khả sống sót điều kiện khắc nghiệt dày Chúng phải thiết lập định cư cách bám vào tế bào biểu mô ruột STEC định cư đoạn kết tràng (colon) có lẽ đoạn xa ruột non người; tượng chưa chứng minh trực tiếp Ngay dòng serotype O157:H7 có bám dính khác nhau, điều phản ánh nhiều chế bám khác Vai trò plasmid 60 MDa (pO157) cho STEC bám dính: Hầu hết dòng STEC chứa pO157 Nhiều nghiên cứu phát diện plasmid liên quan đến yếu tố bám (fimbriae) bám dính với tế bào Henle 407 không bám vào tế bào HEp-2 Theo Tzipori ctv (1987), có diện plasmid hay khơng có khơng ảnh hưởng đến khả định cư kết tràng STEC khả gây bệnh tích A/E heo sinh cách mổ lấy thai 2.2.4 Khía cạnh lâm sàng Ngày nay, người ta cơng nhận có phân bố rộng bệnh người liên quan đến vi khuẩn sản sinh độc tố Stx Những bệnh liên quan tới STEC thường gắn liền với ổ dịch nhỏ rải rác lẫn ổ dịch lớn có nguồn gốc ngộ độc thực phẩm Nhiều bệnh nhân nhiễm STEC với triệu chứng tiêu chảy, số trường hợp sau hay hai ngày tiêu chảy lẫn máu HC Đau bụng dội thường xảy Đối với bệnh nhân nhiễm STEC gây tình trạng HUS dễ để lại di chứng tổn thương cấp tính thận, thiếu máu dung huyết giảm tiểu cầu Vài cá thể bị HUS có triệu chứng thần kinh bơ phờ, nhức đầu dội, co giật đau não Mặc dù HUS xảy tất nhóm tuổi tỉ lệ mắc bệnh 29 Trong trình giết mổ, E coli từ phân dễ dàng vấy nhiễm lên sàn, dụng cụ giết mổ, nước sử dụng, phương tiện vận chuyển Do đó, qui trình giết mổ gia súc, vận chuyển phân phối thịt không tuân thủ nghiêm ngặt điều kiện vệ sinh nguy vấy nhiễm E coli từ phân vào thịt dễ dàng xảy Phân gia súc nguồn chủ yếu chứa E coli O157:H7, thịt heo nguồn lây nhiễm (Doyle, 1991) Theo Levine (1987), STEC tác nhân gây bệnh cho người, người trở nên cảm nhiễm ăn phải thức ăn bị nhiễm STEC tiếp xúc trực tiếp với STEC từ động vật (Renwick ctv, 1993) Người bị nhiễm STEC tiêu chảy trầm trọng HC HUS (Karmali, 1989) Và để bước đầu tầm soát gen độc lực E coli STEC thực phẩm, tiến hành khảo sát bề mặt thịt bị, hầu hết trường hợp ngộ độc thực phẩm người ăn phải thịt bị sản phẩm có nguồn gốc từ thịt bị bị nhiễm E coli nhóm STEC (Keskimaki, 2001) Kết phát gen độc lực mẫu E coli phân lập từ thịt bò ghi nhận bảng 4.5 Trong mẫu bề mặt thịt bị khảo sát, khơng có mẫu phát E coli có mang gen độc lực Nếu nói khía cạnh ngộ độc thực phẩm kết thật đáng mừng Điều hoàn toàn hợp với luật pháp không cho phép STEC diện thực phẩm (Paton Paton, 1998) Tuy nhiên, nguyên nhân vắng mặt dòng E coli mang gen độc lực phân lập từ thịt bị do: Số mẫu khảo sát cịn nên chưa đủ để phát gen độc lực Khuẩn lạc trắng mơi trường CT - SMAC khơng phải khuẩn lạc điển hình E coli O157:H7 Theo Fujisawa ctv (2002), môi trường CT SMAC, vi khuẩn hiếu khí Pseudomonas spp có khuẩn lạc khơng màu, khơng lên men sorbitol Mẫu âm tính thật Bảng 4.5 Kết phát gen độc lực E coli bề mặt thịt bò Mẫu Loại khuẩn lạc, môi trường eae TCT TCT TCT _ _ _ Gen độc lực ehx stx1 stx2 A _ _ _ _ _ _ _ _ _ uid _ _ _ 30 TCT TCT TCT TCT _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ TCT TCT _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 4.5 Tổng kết kết phát gen độc lực E coli mẫu khảo sát có nguồn gốc từ bị heo Tóm lại, khảo sát này, đối tượng gia súc chọn khảo sát bò heo Ở bị, chúng tơi khảo sát ba loại mẫu: phân bê tiêu chảy, phân bò tiêu chảy bề mặt thịt bị Beutin ctv (1995) nhận định dòng STEC thường diện phân loài nhai lại Trên heo, phân heo cai sữa tiêu chảy tập trung khảo sát tính nhạy cảm lứa tuổi với nhóm STEC Khảo sát 36 mẫu, gồm mẫu phân bê tiêu chảy, 10 mẫu phân bò tiêu chảy, mẫu phân heo tiêu chảy mẫu bề mặt thịt bò, kết phát gen độc lực E coli từ mẫu khảo sát tổng hợp bảng 4.6 Như vậy, 36 mẫu khảo sát có 16 mẫu phát E coli mang gen độc lực nhóm STEC, chiếm tỉ lệ 44,4% Gen ehxA phát với tỉ lệ cao (75%) Hầu hết dịng STEC O157 dịng STEC khơng thuộc O157 sản sinh độc tố gây dung huyết EhxA (Paton Paton, 1998) Theo Stephan Hoelzle (2000), STEC mà khơng mang gen ehxA độc lực giảm chí khơng độc người Tần số diện gen stx1 stx2 9/36 mẫu (25%) 8/36 mẫu (22,2%) Không phát gen eae uid mẫu khảo sát Điều giải thích primer Eae gắn vào đoạn gen eae chuyên biệt tạo dạng protein γ-intimin (Feng Monday, 2000) Protein có chủ yếu serotype O157:H7 O55:H7 mà Các serotype diện mẫu phân thực phẩm Beutin ctv (1995) nghiên cứu kết luận có 3/208 (1,4%) khuẩn lạc STEC có nguồn gốc từ phân động vật dương tính với eae Theo Wang ctv (2002), gen ehxA có khả gây bệnh cao Vả lại, theo Jerse ctv (1990), intimin gen eae mã hóa điều kiện cần điều kiện đủ để gây tổn thương kiểu A/E 31 Tóm lại, phát số E coli thuộc nhóm STEC chưa phát dịng E coli O157:H7 Bởi vì, vụ bộc phát bệnh STEC khơng thiết gây dịng đơn có lẽ cần phức hệ VSV (Paton Paton, 1998) Bảng 4.6 Tổng kết kết phát gen độc lực E coli nhóm STEC 36 mẫu khảo sát Nguồn gốc Phân bò N 10 (+) eae Gen độc lực ehxA stx1 stx2 10 tiêu chảy Phân heo cai (%) 50,0 0,0 100,0 10,0 40,0 0,0 sữa tiêu chảy Phân bê (%) 44,4 0,0 100,0 11,1 33,3 0,0 tiêu chảy (%) 87,5 0,0 100,0 87,5 12,5 0,0 (%) 36 (%) 0,0 16 44,4 0,0 0 0,0 27 75 0,0 25 0,0 22,2 0,0 0 Bề mặt thịt bò Tổng cộng uid N: số lượng mẫu khảo sát (+): số lượng mẫu phát có mang gen độc lực E coli nhóm STEC Tỉ lệ (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 eae ehxA stx1 stx2 Phân bê tiêu chảy Phân bò tiêu chảy Phân heo cai sữa tiêu chảy Gen độc lực uid Thịt bò Biểu đồ 4.1 Kết phát gen độc lực E coli 36 mẫu khảo sát 32 Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm multiplex - PCR T1: mẫu thịt số 1; P.B1: mẫu phân bò tiêu chảy số 1; Ladder: thang chuẩn; P.b7: mẫu phân bê tiêu chảy số 7; EDL933: đối chứng dương; P.h1: mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy số 33 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu nhận trình thực đề tài, rút kết luận sau: (1) E coli môi trường thạch MAC xuất loại khuẩn lạc hồng (HM), môi trường thạch SMAC xuất loại khuẩn lạc trắng (TS) hồng (HS), môi trường thạch CT - SMAC xuất loại khuẩn lạc trắng (TCT) hồng (HCT) (2) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực chưa khuẩn lạc riêng lẻ có mang gen độc lực (3) 100% mẫu phân tiêu chảy có E coli mang gen dung huyết ehxA Tần số phát gen stx E coli phân lập mẫu phân bò, heo bê tiêu chảy là: 50%; 44,4% 100% (4) mẫu bề mặt thịt bò chưa phát gen độc lực E coli (5) Chưa phát gen uid eae 27 mẫu phân tiêu chảy bò, bê heo; mẫu bề mặt thịt 5.2 Tồn đề nghị Tồn Do điều kiện thời gian kinh phí có hạn, đề tài cịn có số tồn sau: (1) Chưa phát phân lập serotype E coli O157:H7 (2) Chưa tổ chức khảo sát việc phát gen độc lực E coli môi trường phân lập MAC, SMAC, CT - SMAC Đề nghị (1) Có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát gen độc lực dòng E coli gây bệnh chẩn đoán bệnh kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm, đặc biệt trường hợp xảy dịch bệnh (2) Tăng số lượng mẫu khảo sát, định serotype khuẩn lạc riêng lẻ kháng huyết chuẩn (3) Thay đổi môi trường tăng sinh để tăng khả phát E coli O157:H7 Chẳng hạn thay môi trường pepton đệm bổ sung cefixime vancomycin môi 34 trường LST (Lauryl sulfate tryptose) bổ sung cefixime (0,0125mg/L) tellurite (0,625mg/L) ủ 420C 24 (Dogan ctv, 2003) 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN TIẾNG VIỆT 1.Bộ môn vi sinh – Khoa Y - Đại học Y Dược TP.HCM, 1996 Vi khuẩn học Trang 123 – 130 2.Trần Thị Dân, 2001 Lưu ý PCR Tài liệu giảng dạy Trường Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh 3.Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục TP HCM 301trang 4.Lê Thị Mai Khanh, 2004 Phát số gen độc lực Escherichia coli phân lập từ phân thịt bò, heo kỹ thuật multiplex - PCR Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp Trường Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh PHẦN TIẾNG NƯỚC NGỒI 5.Barrett T J., Kaper L P., Jerse A E., and Wachsmuth I K., 1992 Virulence factors in Shiga-like toxin producing Escherichia coli isolated from humans and cattle J Infect Dis 165: 970 - 980 6.Bauer M E., and Welch R A., 1996 Characterization of an RTX toxin from enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Infect Immun 64: 167 - 175 Beutin L., Montenegro M A., Orskov I., Orskov F., Prada J., Zimmermann S., and Stephan R., 1989 Close association of verotoxin (Shiga-like toxin) production with enterohemolysin production in strains of Escherichia coli J Clin Microbiol 27: 2559 - 2564 8.Beutin L., Geier D., Zimmermann S., and Karch H., 1995 Virulence markers of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli strains originating from healthy domestic animals of different species J Clin Microbiol 33: 631- 635 9.Blanco M., Blanco J E., Gonzalez E A., Mora A., Jansen W., Gomez T A T., Zerbini L F., Yano T., de Castro A F P., and Blanco J., 1997 Note: Genes coding for enterotoxins and verotoxins in porcine Escherichia coli strains belonging to different O:K:H serotypes: relationship with phenotype J Clin Microbiol 35: 2958 - 2963 10.Botteldoorn N., Heyndrick M., Rijpens N., Herman L., 2003 Detection and characterization of verotoxigenic Escherichia coli by a VTEC/EHEC multiplex PCR in porcine faeces and pig carcass swabs Research in Microbiology 154: 97-104 36 11.Calderwood S B., Acheson D W K., Keusch G T., Barret T J., Griffin P M., Strockbine N A et al, 1996 Proposed new nomenclature for SLT (VT) family ASM News 62: 118 – 119 12.Cebula T A., Payne W L., and Feng P., 1995 Simultaneous Identification of Strains of Escherichia coli Serotype O157:H7 and Their Shiga – Like toxin Type by Mismatch Amplification Mutation Assay – Multiplex PCR J Clin Microbiol 33: 248 - 250 13.Cerna J F., Nataro J P., and Teresa Estrada Garcia, 2003 Multiplex PCR for detection of three plasmide borne genes of enteroaggregative Escherichia coli strains J Clin Microbiol 41: 2138 - 2140 14 Chalmer R M., Salmon R L., Willshaw G A., Cheasty T., Looker N., Davies I., and Wray C., 1997 Verocytotoxin-producing E coli O157 in a farmer handing horses Lancet 349: 1816 15.Dogan H B., Kluleasan H., Cakin I., Hallemam A K., 2003 Evaluation of increased incubation temperature cefixime – telluride treatment for the isolation of Escherichia coli O157:H7 from minced beef J Food Microbiology 87: 29 -34 16.Donnenberg M S., Tzipori S., McKee M L., O’Brien A D., Alroy J., and Kaper J B., 1993 The role of the eae gen of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model J Clin Invest 92: 1418 - 1424 17.Doyle M P., 1991 Escherichia coli O157:H7 and its significance in foods International J of Food Mic 12: 289 - 302 18.FAO, 1992 Microbiological analysis in the food control laboratory 19.FDA, 2002 “Diarrheagenic Escherichia coli”, Bacteriological Analytical manual Online, CFSAN September 2002 20.Feng P., Lample KA, 1994 Genetic analysis of uidA expression in enterohaemorrhagic Escherichia coli serotype O157:H7 Microbiology 140: 21012107 21.Feng P and Monday S., 2000 Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes Molecular and Cellular Probes 14: 333 - 337 22.Fujisawa T., Sata S., and Aikawa K., 2002 Evaluation of sorbitol-salicin MacConkey medium containing cefixime and tellurite (CT-SSMAC medium) for isolation of Escherichia coli O157:H7 from raw vegetables J Food Mic 74: 161 - 163 23.Gyles C L 1992 Escherichia coli cytotoxins and enterotoxins Can J Microbiol 38: 734 - 746 37 24.Jay J M., 2000 Modern food Microbiology An Aspen publication, Maryland p 531 - 543 25.Jerse A E., Yu J., Tall B D., and Kaper J B., 1990 A genetic locus of enteropathogenic Escherichia coli necessary for the production of attaching and effacing lesions on tissue culture cells Proc Natl Acad Sci USA 87: 7839 – 7843 26.Foster J W., 2004 Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile http://www.southalabama.edu/microbiology/foster.html 27.Karmali M A 1989 Infection by verotoxin-producing Escherichia coli Clin Microbiol Rev 2: 15 - 38 28.Keene W E., McAnulty J M., Hoesly L P., Williams Jr., Hedberg K., Oxman G L., Barrett T J., Pfaller M A., and Fleming D W., 1994 A swimming-associated outbreak of hemorrhagic colitis caused by Escherichia coli O157:H7 and Shigella sonnei N Engl J Med 331: 579 - 584 29.Keskimaki M., 2001 Shiga toxin-producing and other diarrhoeagenic Escherichia coli in Finland: pheno- and genotypic epidemiology Academic dissertation The Faculty of Agriculture and Forestry of the University of Helsinky, Finland p 15 – 18 30.Kim H H., 1994 Characteristics of antibiotic-resistant Escherichia coli 0157:H7 in Washington State, 1984-1991 J Infect Dis 170: 1606-1609 31.Konowalchuk J., Speirs J I., and Stavric S., 1977 Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli Infect Immu 18: 775 - 779 32.Law D., and Kelly J., 1995 Use of heme and hemoglobin by Escherichia coli O157 and other Shiga-like-toxin-producing E coli serogroups Infect Immun 63: 700 - 702 33.Levine M M., Xu J., Kaper J B., Lior H., Prado V., Tall B., Nataro J., Karch H., and Wachsmuth I K., 1987 A DNA probe to identify enterohemorrhagic Escherichia coli of O157:H7 and other serotypes that cause hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome J Infect Dis 156: 175 - 182 34.Leyer G J., Wang L., and Johnson E A., 1995 Acid adaptation of Escherichia coli O157:H7 increases survival in acidic foods Appl Environ Microbiol 61: 3752 3755 35.Lingwood C A 1996 Role of verotoxin receptors in pathogenesis Trends Microbiol 4: 147 - 153 36.Mainil J G., and Daube G., 2005 Verotoxigenic Escherichia coli from animals, humans and foods: who’s who ? Journal of Applied Microbiology Rev 98: 1332 - 1344 38 37.Monday S., Whittam T., and Feng P., 2001 Genetic and Evolutionary Analysis of Mutations in the gusA Gene That Cause the Absence of bêta-Glucuronidase Activity in Escherichia coli O157:H7 The Journal of Infectious Diseases 184: 918 - 21 38.Nataro J P and Kaper J P., 1998 Diarrheagenic Escherichia coli Clin Microbiol Rev 11: 142 – 201 39.O’Brien A D., Newland J W., Miller S F., Holmes R K., Smith H W., and Formal S B., 1984 Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea Science 226: 694–696 40.Oswald E., Schmidt H., Morabito S., Karch H., Marches O., Caprioli A., 2000 Typing of Intimin Genes in Human and Animal Enterohemorrhagic and Enteropathogenic Escherichia coli : characterization of a New Intimin Variant Infection and Immunity 68: 64 - 71 41.Paton A W., Ratcliff R., Doyle R M., Seymour-Murray J., Davos D., Lanser J A., and Paton J C., 1996 Molecular microbiological investigation of an outbreak of hemolytic uremic syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shigalike toxin-producing Escherichia coli J Clin Microbiol 34: 1622 – 1627 42.Paton J C And Paton A W., 1998 Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxinproducing Escherichia coli infection Clin Microbiol Rev 11: 450 - 479 43.Renwick S A., Wilson J B., Clarke R C., Lior H., Borcyk A A., Spika J., Rahn K., McFadden K., Brouwer A., Anderson N G., Alves D., and Karmali M A., 1993 Evidence of direct transmission of Escherichia coli O157:H7 infection between calves and a human J Infect Dis 168: 792 – 793 44.Sandhu K S., Clarke R C., McFadden K., Brouwer A., Louie M., Wilson J., Lior H., and Gyles C L., 1996 Prevalence of the eaeA gene in verotoxigenic Escherichia coli strains from dairy cattle in Southwest Ontario Epidemiol Infect 116: - 45.Smith H R., and Scotland S M., 1988 Vero cytotoxin-producing strains of Escherichia coli J Med Microbiol 26: 77 - 85 46.Smith H R., and Scotland S M., 1993 Isolation and identification methods for Escherichia coli O157 and other Vero cytotoxin producing strains J Clin Pathol 46: 10 - 17 47.Stephan R., and Hoelzle L E., 2000 Characterzation of shiga toxin type variant Bsubunit in Escherichia coli strains from asymptomatic human carriers by PCR-RFLP Lett Appl Mic 31: 139 - 142 48.Tzipori S., Karch H., Wachsmuth I K., Robins-Browne R M., O’Brien A D., Lior H., Cohen M L., Smithers J., and Levine M M., 1987 Role of a 60-MDa plasmid and 39 Shiga-like toxins in the pathogenesis of infection caused by enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in gnotobiotic piglets Infect Immun 55: 3117 - 3125 49.USA Department of Agriculture’s Food safety and Inspection Service, 2004 http://www.fsis.usda.gov 50.Wang G., Clark C G., and Rodgerst F G., 2002 Detection in Escherichia coli of the genes defining the O157:H7 serotype, and components of the type shiga toxin family by Multiplex PCR J Clin Microbiol 40: 3613 - 3619 51 Waterman S R., and Small P L., 1996 Characterization of the acid resistance phenotype and rpoS alleles of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli Infect Immun 64: 2808 - 2811 PHỤ LỤC HÓA CHẤT CHO ĐIỆN DI TBE (0,5X) Tris HCl 3,94 mg Acid Boric 1,39 mg Na2EDTA 93,06 mg Nước cất vừa đủ 500 ml pH = 8,3 Agarose (1,65%) 40 Loading dye Bromophenol blue 0,25% Sucrose 40% TE 1X vừa đủ 100% HÓA CHẤT CHO NHUỘM GEL TBE 1X Ethidium bromide 10 mg/ml MƠI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ Mơi trường Nước pepton đệm Pepton 10 g Sodium chloride 5g Disodium hydrogen phosphate 9g Potassium dihydrogen phosphate 1,5 g Nước cất vừa đủ 1000 ml Pepton 5g Sodium chloride 5g Beef Extract 1,5 g Yeast Extract 1,5 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml NA pH = 7,4 ± 0,2 (250C) MAC Bacto pepton 17 g Bacto Proteose pepton 3g Bacto Lactose 10 g Bacto Bile salts 1,5 g 41 Sodium Chloride 5g Bacto agar 13,5 g Neutral Red 0,03 g Bacto Crystal Violet 0,001 g SMAC Pepton 20 g Sodium chloride 5g Bile salt 1,5 g Sorbitol 10 g Crystal violet 0,001 g Neutral red 0,003 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml SIMMON CITRATE Na citrate 2g NaCl 5g K2HPO4 1g NH4H2PO4 1g MgSO4 0,2 g Bromothymol blue 0,08 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml MR – VP Pepton 7g Glucose 5g K2HPO4 5g Nước cất vừa đủ 800 ml pH = 6,9 ± 0,2 Thuốc thử 42 VP (Voges Proskauer) Dung dịch A: Alpha napthol 5g Ethanol tuyệt đối 100 ml Dung dịch B: Potassium hydroxyde 40 g Nước cất 100 ml MR (Methyl red) Methyl red 0,1 g Alcohol 300 ml Nước cất vừa đủ 500 ml ... Kết phát gen độc lực E coli phân lập từ phân heo cai sữa tiêu chảy Kết phát gen độc lực E coli từ mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3 cho ta thấy có 4/9 mẫu (44,4%) mang gen. .. Các sản phẩm PCR xác định cách so với băng đối chứng dương thang ladder 100 bp Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết phát gen độc lực E coli phân lập từ phân bò tiêu chảy 24 Kết phát gen độc lực E coli. .. mẫu phân bê tiêu chảy, 10 mẫu phân bò tiêu chảy, mẫu phân heo tiêu chảy mẫu bề mặt thịt bò, kết phát gen độc lực E coli từ mẫu khảo sát tổng hợp bảng 4.6 Như vậy, 36 mẫu khảo sát có 16 mẫu phát