Đang tải... (xem toàn văn)
Đề tài được thực hiện trên đối tượng heo và chó. Loài heo đã được nghiên cứu nhiều và cung cấp nguồn noãn dồi dào. Chó là đối tượng có tỉ lệ thành công thấp và nhiều giống chó quí hiếm r
1 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày lĩnh vực chăn nuôi, thành tựu đánh dấu tiến vượt bậc kĩ thuật nuôi cấy tế bào sinh dục khả tạo hợp tử bên ngồi thể mẹ thơng qua kết hợp tinh trùng noãn điều kiện in vitro Ở động vật, nguồn phơi dồi phục vụ cho mục đích khác như: tạo động vật chuyển gen, khai thác nguồn tế bào mầm, nhân động vật, tạo đàn thú có điều kiện thí nghiệm tương đương phục vụ nghiên cứu khoa học… Nhưng dù với mục đích gì, cần phải qua khâu tạo nguồn nỗn chín đồng loạt Đó bước thao tác liên quan đến khoa học sinh sản Ngày 24/04/2005, nhà khoa học đại học quốc gia Seoul thành công cho sinh sản vơ tính giống chó săn Afganistan (trích báo tuổi trẻ số ngày 05/08/2005) Trên giới, công nghệ sinh học lĩnh vực sinh sản nói chung việc tạo nỗn chín in vitro nói riêng phổ biến, Việt Nam hạn hẹp Noãn heo nguồn noãn dồi giúp hồn thiện thao tác lấy nỗn ni nỗn Trên chó có số giống q chu kỳ sinh sản chúng dài tỉ lệ ni thành cơng thấp, chọn ni trứng chó có ý nghĩa Vì lý trên, đề tài “Áp dụng qui trình ni chín nỗn in vitro heo chó” tiến hành 1.2 Mục tiêu yêu cầu Mục tiêu Góp phần xây dựng hệ thống qui trình ni cấy phôi điều kiện Việt Nam Yêu cầu Phân loại nang nỗn buồng trứng heo chó Áp dụng phương pháp ni chín nỗn heo chó Áp dụng phương pháp nhuộm nhiễm sắc thể thể cực nỗn chín PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Buồng trứng 2.1.1 Cấu tạo [1] Buồng trứng phát triển từ miền vỏ tuyến sinh dục, gồm đôi treo cạnh trước dây chằng rộng nằm xoang chậu Bên lớp màng liên kết sợi màng bao dịch hoàn Bên buồng trứng chia làm hai miền: miền vỏ miền tủy, hai miền cấu tạo lớp mô liên kết sợi xốp, tạo chất đệm cho buồng trứng Miền tủy có mạch máu nhiều lớp mơ liên kết dày Miền vỏ nơi xảy chín nỗn rụng nỗn Bên lớp màng nỗn ngun thủy Khi nang nỗn chín, tế bào nang bao quanh noãn phân chia thành nhiều tầng tế bào hạt Nang nỗn phát triển tế bào nang phân hủy tạo xoang chứa dịch Khi trở nên chín, nang nỗn bao bọc lớp màng mỏng Tổ chức liên kết buồng trứng lúc dày lên để bảo vệ nang noãn chín, màng liên kết màng nang nỗn tổ chức mạch quản dày đặc Lúc nang noãn thành thục màng bọc nang màng bao liên kết buồng trứng tách ra, noãn rời buồng trứng với dịch nang để vào vòi Fallop Màng nang noãn rách liền lại ngay, tế bào hạt xoang phân chia nhanh thành khối tế bào lớn để lấp kín xoang nang nỗn trở thành thể vàng 2.1.2 Chức nội tiết buồng trứng [1], [2] Hormon tiết từ nang noãn thể vàng Hormon từ nang noãn estrogen, từ thể vàng progesteron Hàm lượng hormon liên quan đến giai đoạn chu kì động dục Hàm lượng progesteron thể vàng tăng sau xuất noãn thấp thối triển Có relaxin pha thể vàng chu kì pha nang nỗn khơng có relaxin Relaxin không xuất buồng trứng heo tơ Nang nỗn thành thục tế bào hạt biểu mô tiết nhiều estrogen Estrogen làm gia súc biểu động dục Estrogen gồm estradiol sản phẩm hóa học estrol estriol Estrogen liên quan đến đặc tính sinh dục thứ cấp gia súc cái, làm âm đạo tiết nhiều dịch nhầy, sừng tử cung ống dẫn trứng tăng cường dòng máu, tuyến vú phát triển, vỏ não hưng phấn Hình 2.1: (a) Estradiol (b) Estriol Sau xuất nỗn, ngun sinh chất bên nang nỗn tích tụ sắc tố thể vàng Thể vàng tiết hormon progesteron Progesteron vào máu, ức chế phân tiết gonadotropin từ tuyến yên ức chế chín nang nỗn, kích thích hoạt động niêm mạc tử cung để trứng thụ tinh nơi làm tổ phát triển, ức chế co bóp tử cung, giảm hormon thùy sau tuyến yên thời gian gia súc có chửa thúc đẩy tuyến vú phát triển Hình 2.2: Progesteron 2.1.3 Buồng trứng heo chó 2.1.3.1 Buồng trứng heo [6] Buồng trứng heo hình chùm dâu, có màu hồng vân, nằm hai bên hốc bụng Trọng lượng buồng trứng tăng từ ngày thứ đến ngày 12 sau động dục thể vàng phát triển Đường kính thể vàng đạt tối đa 11 mm vào ngày 15 giảm dần thối hóa Màu cấu trúc thể vàng thay đổi theo thời gian Thể vàng có màu đỏ sậm vào ngày thứ 3, tím tái vào ngày 15 màu kem vàng trắng dần vào ngày 15 – 18 Ngày thứ có cục máu đỏ sậm thể vàng, ngày thứ cục máu thay mô liên kết dịch vàng, đến ngày 16 – 18 có nhiều mạch máu Lúc bắt đầu động dục chu kỳ thể vàng thối hóa, đường kính thể vàng 50 % vào ngày 40 Số nang tối đa 2.700.000, số nang lúc sinh 135.000, số nang trình phát triển 95 % Kích thước nang xoang – 10 mm, kích thước nang nỗn thành thục – 12 mm 2.1.3.2 Buồng trứng chó [6] Buồng trứng bao túi Khi lột bỏ túi, kích thước buồng trứng 1,7 0,9 0,4 cm chó beagle Buồng trứng chó già tương tự bề mặt bơng cải, có kẽ hở sâu để phân chia thùy với kích cỡ khác Khi buồng trứng chứa nang nỗn tịt, mơ liên kết dày đặc, vết sẹo thể vàng, thành phần sườn gian bào vùng tủy Tế bào biểu mơ mầm trở nên hình trụ giả với mảng lồi giống tiêm mao Ở chó khơng mang thai thể vàng thối hóa vào ngày 20 sau động dục Chó có khoảng 700.000 nang nỗn lúc sinh, cịn 350.000 lúc thành thục, số khoảng 1200 – 1300 nang xoang Khả thụ tinh không giảm đến chó tuổi 2.2 Nang nỗn 2.2.1 Đặc điểm hình thái [1] Nỗn tế bào lớn thể, có dạng hình cầu Thể tích tế bào trứng lớn tinh trùng nhiều lần dài gấp lần Cấu tạo noãn gồm phần: Phần nguyên sinh chất gồm thành phần chủ yếu nước, vật chất hữu cơ, muối khoáng vật chất khác Nhân gồm lưới nhiễm sắc thể nhiều hạt Màng bao gồm lớp: lớp ngoài, lớp lớp Màng gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp Những tế bào phân bổ khắp nỗn nên cịn gọi màng phóng xạ hay màng tia Các tế bào gắn với acid hyaluronic Khi tinh trùng gặp trứng, men hyaluronidase phần acrosom tiết để phân giải acid hyaluronic làm màng phóng xạ tan tạo điều kiện thụ tinh Màng gồm nhiều tế bào, sinh từ tế bào nang, lớp ni dưỡng nỗn Màng gọi màng suốt Màng đảm bảo dinh dưỡng cho noãn buồng trứng Trong màng chứa enzym zonalizin – men đặc hiệu chủng lồi có tác dụng ngăn ngừa tinh trùng khác lồi vào nhân nỗn q trình thụ tinh Màng lớp màng mỏng bao quanh phần nguyên sinh chất gọi màng nỗn hồng hay màng ngun sinh chất Màng có tác dụng ni dưỡng noãn thụ tinh Giữa màng suốt màng nỗn hồng có khoảng trống dày 14 – 25 µm, pH – 5, chứa dịch có nồng độ ion cao 2.2.2 Các giai đoạn phát triển nang noãn nỗn Q trình hình thành nang nỗn xảy lớp vỏ buồng trứng, từ nang noãn nguyên thủy phân bố vùng ngoại biên Ở thời kì sau thai, nang nỗn khơng ngừng hình thành phát triển từ biểu mơ phơi thai Q trình hình thành noãn gồm bước: sinh tế bào mầm nguyên thủy (PGC – primordial germ cells); di chuyển PGC tới tuyến sinh dục; định vị PGC tuyến sinh dục; biệt hóa PGC thành nỗn ngun bào; tăng số lượng noãn nguyên bào; bắt đầu giảm phân; dừng giai đoạn nhân đôi prophase I [26] Từ PGC trở thành nang nỗn bọc tế bào dẹt, biến thành nang độ Song song với trình giảm phân, nang độ lên từ vùng vỏ chứa noãn bao quanh lớp tế bào sinh dưỡng, gọi tiền tế bào hạt Tế bào sinh dưỡng miền vỏ có nguồn gốc từ tế bào biểu mô bề mặt di chuyển ngược vào buồng trứng tế bào hạt có nguồn gốc từ tế bào trung thận di chuyển xuyên qua buồng trứng (Sawyer cs, 2002) [29] Ở cừu, nỗn q độ có đường kính 25 – 53 µm, nỗn biệt hóa 17 – 22 µm nỗn ngun bào 13 – 17 µm, điều chứng tỏ tế bào mầm tăng trưởng trước, sau trình tạo nang noãn (Mc Natty cs, 2000) [20] Từ nang độ phát triển thành nang bậc Nang bậc chứa lớp tế bào hạt bao quanh, giai đoạn chuyển thành nang bậc chậm so với trình tăng trưởng nang Từ nang bậc phát triển thành nang bậc hai, có từ lớp tế bào hạt trở lên Khi noãn tăng trưởng, tế bào hạt tăng sinh dày, lớp tế bào vỏ hình thành xung quanh tế bào hạt Giai đoạn tăng RNA, protein, ribosom, ti thể số chất hữu khác Từ nang bậc hai tạo nang xoang, chứa nhiều dịch nhiều tế bào hạt bao quanh Dịch có vai trị điều hịa chất từ máu chất tiết tế bào nang như: gonadotropin, steroid, yếu tố tăng trưởng, enzym, proteoglycan, lipoprotein Dịch tăng lên nhờ phát triển mao quản dòng máu vận chuyển nang Noãn lúc bọc tế bào hạt tụ (cumulus), tạo phức hợp COC (cumulus oocyte complex) Sau q trình tăng trưởng, nỗn tồn giai đoạn tiền kỳ Sau đỉnh LH, để hoàn thành giảm phân, noãn tăng trưởng đầy đủ xuất màng suốt tạo cầu nối nỗn tế bào hạt tụ Q trình trưởng thành khoảng thời gian sau đỉnh LH xuất noãn Q trình có hai biến đổi lớn: trưởng thành nhân trưởng thành tế bào chất [3] Trưởng thành nhân thuật ngữ phục hồi trình phân bào giảm nhiễm chuyển biến đến giai đoạn MII (metaphase II) Trưởng thành tế bào chất thuật ngữ liên quan đến kiện khác: chuẩn bị cho trứng thụ tinh phát triển trước làm tổ, định vị lại tiểu thể bào tương tế bào hạt Trưởng thành nhân kéo dài 44 heo, gồm trình phân chia liên tục thời kì MI MII, sau nỗn dừng lại MII chờ thụ tinh Ở giai đoạn này, noãn đáp ứng đỉnh LH tạo nhiều hormon steroid từ tế bào hạt, tạo nhiều hyaluronan từ tế bào hạt tụ, tiết dịch nhầy tăng kích thước tế bào hạt tụ Nang bậc ba Nang bậc hai Hình 2.3 : Các giai đoạn phát triển nang noãn [37] Nang noãn bậc 2.2.3 Biến đổi đại thể nang noãn 2.2.3.1 Nang noãn heo [6] Nang bậc hai Đường kính trung bình nang noãn lớn tăng dần đến ngày thứ 18 chu kì, đạt tối đa mm Nang nỗn lớn thấy vào 18 sau bắt đầu động dục sau thay đổi kích thước lại biến động Kích thước nang chưa đủ đánh giá đường kính nang biến động lúc xuất noãn Màu nang noãn trưởng thành màu hồng vỏ sò, mạng mạch máu nằm bề mặt nang noãn Vùng suốt đỉnh nang noãn nơi xuất noãn Khi xuất noãn, thành nang noãn vỡ dịch đỏ xuất bề mặt nang nỗn Điểm vỡ thấy vào ngày 12 sau động dục Động mạch xung huyết tràn máu vào nang noãn dẫn tới noãn xuất huyết, tượng thường xuất heo Khi xuất noãn, nang nhuộm đỏ đứt mạch máu, thành nang xẹp xuống xuất dịch đỏ bề mặt Khoảng – ngày trước động dục, nang nỗn lớn nhanh, lúc có triển dưỡng lớp màng bao nang nỗn hịa tan phần tế bào hạt tụ nên noãn trạng thái tự lơ lửng Noãn tự trải qua giai đoạn giảm nhiễm đầu tiên, nhân di chuyển phía ngoại vi tế bào thể cực thứ tạo Lúc xuất noãn, thể cực thứ đẩy trục thể cực thứ nhì tạo nên 2.2.3.2 Nang nỗn chó [6] Nang nỗn bậc có lớp tế bào hình lập phương cịn nang nỗn bậc hai gia tăng kích thước tăng tế bào hạt tạo xoang nang Thông thường nang nỗn bậc hai có nỗn nhiều Nhiều báo cáo cho thấy nang nỗn đa nỗn có 11 nỗn, thơng thường – nỗn Kích thước nang noãn gia tăng vào giai đoạn tiền động dục nên giai đoạn xem giai đoạn nang nỗn trưởng thành Vì phần lớn nang nỗn nhỏ thối hóa, có số nang nỗn có kích thước > mm Những nang noãn – mm có khoảng – 10 lớp tế bào hạt, lớp màng bao tăng mạch quản mô liên kết Nang noãn – mm phồng lên bề mặt buồng trứng Một đặc tính thống nang nỗn trưởng thành chó nếp gấp sâu lớp tế bào hạt, có cuộn mao quản ăn sâu vào lớp màng bao chuẩn bị tạo chất vàng Vào đầu giai đoạn động dục, nhiều nang noãn xuất noãn Lúc thú bắt đầu chịu đực, thể cực thứ chưa tạo Noãn phóng thích qua lỗ nhỏ lỗ đinh kim mà khơng có tượng vỡ bao nỗn Nỗn phóng thích có kính thước khoảng 77 99 μm, kể vùng suốt khoảng 95 110 μm, chứa hạt có tính khúc xạ cao nhiều hạt mỡ 2.2.4 Nội tiết nang noãn Sự tăng trưởng, thành thục, xuất noãn thể vàng hóa nang phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kiểu chế tiết thích hợp, hàm lượng đủ tỉ lệ phù hợp FSH (follicle stimulating hormone) LH (luteinizing hormone) huyết FSH giữ vai trò chủ đạo cho việc khởi đầu hình thành xoang nang, kích thích q trình ngun phân tế bào hạt q trình hình thành dịch nang Ngồi ra, FSH tăng khả cảm ứng tế bào hạt LH cách tăng số lượng thụ thể LH Ở heo, thụ thể LH tăng từ 300 (trong nang bé) lên 10.000 (trong nang lớn trước xuất noãn) Tăng LH chuẩn bị cho q trình thể vàng hóa tế bào hạt Trong giai đoạn tạo nang bậc hai, tăng kích thước, tăng số tế bào hạt số nang noãn tịt bị ảnh hưởng lượng kích dục tố FSH kích thích tạo cầu nối tế bào hạt LH quan trọng FSH phát triển nang bậc hai qua thụ thể LH tế bào bao nang, khởi động sinh tổng hợp androgen để kích thích tạo thụ thể FSH tế bào hạt, tăng ảnh hưởng FSH lên nang bậc hai [34] Ở giai đoạn này, người ta phát GH (growth hormone) làm tăng phát triển in vitro nang bậc hai chuột (Liu cs, 1998) [14] Trong giai đoạn tạo nang xoang, nang xoang giai đoạn sớm có thụ thể FSH tế bào hạt chưa phụ thuộc vào kích dục tố Ở giai đoạn tế bào bao nang tăng tiết steroid, tế bào hạt aromatase (loại enzyme biến đổi androgen thành estrogen) Điều chứng tỏ progesteron androgen mà estrogen hormon steroid tạo nang xoang giai đoạn sớm Trong nang xoang giai đoạn sau, có tượng giảm FSH, nang noãn tiết nhiều estradiol inhibin có khả xuất nỗn Những nang cịn lại phát triển bất thường trở thành nang tịt Trong giai đoạn nang noãn trưởng thành, tuyến yên tiết LH tối đa nang có khả xuất nỗn Pha nang nỗn Hình 2.4: Nội tiết nang [36] 2.2.5 Sự trƣởng thành nỗn 2.2.5.1 Q trình trƣởng thành Trên heo, noãn nguyên bào bắt đầu giảm phân tạo noãn bậc hai, noãn bậc hai tiếp tục phát triển đến giai đoạn nhân đôi nhiễm sắc thể dừng lại đến thú thành thục tính Khi heo xuất nỗn, nỗn tiếp tục phát triển đến MII chờ thụ tinh Trên chó, nỗn rụng trước tạo thể cực thứ Sự tạo thể cực thứ hoàn tất khoảng 48 – 60 sau xuất noãn Nếu thụ tinh, noãn hồn thành giảm phân phát triển phơi Q trình nỗn phát triển đến metaphase gọi q trình trưởng thành Gồm kiện xảy theo thứ tự sau: nhiễm sắc thể (NST) cô đặc, nhân biến mất, vỡ màng nhân, hình thành trục (1) Cô đặc NST Đây bước quan trọng để phân phối số NST vào noãn thể cực Hirano cs (1994) phát protein gọi condensin liên quan đến cô đặc NST [11] Condensin làm tăng cấu trúc siêu xoắn DNA Sutani cs (1999) khẳng định condensin phosphoryl hóa hoạt hóa MPF (maturation promoting factor) [32] Tuy nhiên, theo Hong Thuy Bui cs (2004), giai đoạn không liên quan đến MPF mà liên quan đến histon H3 (Ser 10) kinase [12] Như ta biết, đơn vị NST nucleosome tức đoạn DNA khoảng 200 bp bao quanh protein histon; histon gồm số phân tử H2A, H2B, H3, H4 Đầu N histon H3 liên quan đến khả giữ ổn định sợi NST, bị phosphoryl hóa vị trí serine 10, 10 kiện cần thiết cho NST cô đặc lại (Wei cs, 1999; de la Barre cs, 2000) [35],[7] (2) Nhân biến Trong giai đoạn từ MI đến MII nhân không xuất hiện, xuất vào giai đoạn tiền nhân sau tinh trùng xâm nhập Chất nhân dạng sợi giải phóng vào dịch nhân lúc nhân biến mất, sau vào dịch tế bào lúc vỡ màng nhân Quá trình điều khiển phosphoryl hóa dephosphoryl hóa protein nhân Nỗn heo lấy nhân có tượng đặc NST, màng nhân biến hình thành trục (Fulka cs, 2003) [10] Do đó, nhân nỗn khơng quan trọng lắm, vào giai đoạn trưởng thành (3) Vỡ màng nhân GVBD (germinal vesical breakdown) Màng nhân màng đôi gồm lớp lipid, lớp tạo mảnh A,B,C, có động vật có xương sống, vị trí kết hợp MPF GVBD xảy mảnh biến mất; MPF hoạt hóa phosphoryl hóa phân tử mảnh, phá vỡ trạng thái polymer thành dimer Màng nhân bị vỡ, mạng lưới nội chất gắn với màng nhân vỡ (4) Tạo trục metaphase Trong trình trưởng thành, trục tạo hai lần, MI MII Trục MI xuất sau tác dụng MPF hoàn thành MAP kinase hoạt hóa MPF phosphoryl hóa protein liên kết với vi ống, gồm α β tubulin, tăng biến đổi chúng Trong nguyên phân, hai trung thể nhân đôi hai cực tế bào Vi sợi tỏa từ hai cực tìm bắt cặp NST chị em Cyclin B gắn với vi ống, MAP kinase gắn với cực Giảm phân noãn khác với nguyên phân tế bào sinh dưỡng: khơng có trung thể, giống tế bào thực vật Trên heo, sau GVBD, NST tạo dạng đám bụi, theo Motlik Fulka mô tả giai đoạn hướng cực muộn Vi ống bị cắt tỏa xung quanh đám bụi 2.2.5.2 Các chất liên quan (1) MPF Theo Masui Markert (1971), progesteron gây trưởng thành noãn cung cấp bên ngồi nỗn, thất bại tiêm vào nỗn [19] Do đó, ... tách noãn thỏ chưa trưởng thành khỏi ức chế nang noãn, cho phép noãn đạt tới trưởng thành nuôi cấy in vitro Năm 1983, Minato Toyoda (Nhật) Schroeder Eppig (Mỹ) cho noãn chuột trưởng thành in vitro. .. nhập tinh trùng bị cản trở Do đó, BSA sử dụng biện pháp ngăn chặn xâm nhập đa tinh trùng qui trình thụ tinh in vitro (4) Muối Đây thành phần quan trọng mơi trường ni nỗn phơi nhằm bảo đảm áp suất... nang noãn Vùng suốt đỉnh nang noãn nơi xuất noãn Khi xuất noãn, thành nang noãn vỡ dịch đỏ xuất bề mặt nang noãn Điểm vỡ thấy vào ngày 12 sau động dục Động mạch xung huyết tràn máu vào nang noãn![Hình 2. 3: Các giai đoạn phát triển của nang noãn [37] 2.2.3. Biến đổi đại thể của nang noãn - Áp dụng qui trình nuôi chín noãn in vitro trên heo và chó](https://media.store123doc.com/figures/001/119/hinh-doan-phat-trien-noan-bien-doi-dai-1119846.png)
![Hình 2.4: Nội tiết nang [36] 2.2.5. Sự trƣởng thành của noãn - Áp dụng qui trình nuôi chín noãn in vitro trên heo và chó](https://media.store123doc.com/figures/001/119/hinh-noi-tiet-nang-trong-thanh-noan-1119847.png)
