Đang tải... (xem toàn văn)
MỤC LỤC CHưƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn .iii Tóm tắt . iv Mục lục . v
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E coli Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VÂN ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E coli Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS NGUYỄN NGỌC HẢI PGS TSKH NGUYỄN LÊ TRANG NGUYỄN VÂN ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập - Các Thầy Cô Bộ môn Công nghệ sinh học Thầy Cơ ln tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ động viên - TS Nguyễn Ngọc Hải PGS TSKH Nguyễn Lê Trang trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp - Các chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, Đỗ Thị Châm, Dƣơng Ngọc Diễm, Võ Thị Mỹ Duyên, Lạc Thị Thêm, Doãn Thị Sim thuộc phòng Miễn dịch viện Pasteur Tp HCM tận tình giúp đỡ, bảo tơi suốt thời gian thực khoá luận - Thầy Lê Anh Phụng, Nguyễn Thị Kim Loan phụ trách phịng thí nghiệm Vi Sinh thầy cô thuộc Bệnh xá Thú y tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt thời gian qua - Tồn thể lớp CNSH27 hỗ trợ, giúp đỡ động viên suốt thời gian làm đề tài Con thành kính ghi ơn ba mẹ ngƣời thân gia đình ln tạo điều kiện động viên suốt trình học tập trƣờng Chân thành cảm ơn Tháng 08 năm 2005 Nguyễn Vân Anh iii TĨM TẮT NGUYỄN VÂN ANH, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 “THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E coli” Hội đồng hƣớng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Hải PGS TSKH Nguyễn Lê Trang Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2/2005 đến tháng 8/2005 Địa điểm nghiên cứu: Viện Pasteur Tp HCM Bệnh xá Thú y Trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp HCM Phịng thí nghiệm Vi Sinh Đánh giá chất lƣợng kháng huyết thu đƣợc hai qui trình gây đáp ứng miễn dịch ngắn ngày dài ngày Đề tài thực lô thỏ thí nghiệm đƣợc gây miễn dịch theo hai qui trình khác nhau: qui trình ngắn ngày (35 ngày) qui trình dài ngày (154 ngày) Kháng huyết thu đƣợc từ hai qui trình tủa amonium sulfate bão hịa phục hồi phƣơng pháp thẩm tích Hiệu đáp ứng miễn dịch hai qui trình đƣợc đánh giá qua phản ứng ngƣng kết nhanh phiến kính (định tính) phản ứng ngƣng kết chậm ống nghiệm (định lƣợng) Ngoài để tăng cƣờng độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng ngƣng kết kháng huyết đƣợc xử lí gắn với Staphylococcus aureus hấp phụ với kháng nguyên vi khuẩn K88+ Kết đạt đƣợc: Cả hai qui trình ngắn ngày dài ngày gây đáp ứng miễn dịch thỏ Phát đƣợc kháng thể kháng huyết sau tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày phản ứng ngƣng kết nhanh phiến kính Xác định đƣợc nồng độ S aureus thích hợp để gắn với KHT nhằm tăng độ nhạy phản ứng ngƣng kết nhanh phiến kính KHT đƣợc xử lí gắn với S aureus (nồng độ 1014 tế bào/ ml) tỉ lệ thể tích KHT : S aureus 1:4 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết qui trình dài ngày cao qui trình ngắn ngày Tách kháng thể khỏi kháng huyết cách tủa muối amonium sulfate bão hòa Hấp phụ kháng thể không đặc hiệu kháng huyết iv MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình x Danh sách bảng xi Danh sách biểu đồ xii Danh sách sơ đồ xiii MỞ ĐẦU .1 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH 2.1.1 Khái niệm miễn dịch 2.1.2 Kháng nguyên 2.1.2.1 Định nghĩa 2.1.2.2 Khái niệm epitop 2.1.3 Kháng thể dịch thể 2.1.3.1 Định nghĩa 2.1.3.2 Cấu trúc phân tử immunoglobulin 2.1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả đáp ứng miễn dịch động vật 2.1.4.1 Loài động vật 2.1.4.2 Yếu tố di truyền v 2.1.4.3 Kháng nguyên 2.1.4.4 Qui trình gây miễn dịch 2.1.4.5 Chất bổ trợ 2.1.5 Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể 2.1.5.1 Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể 2.1.5.2 Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể 11 2.2 VI KHUẨN E coli 14 2.2.1 Định nghĩa 14 2.2.2 Đặc tính sinh hóa 14 2.2.3 Yếu tố kháng nguyên 14 2.2.3.1 Kháng nguyên thân O 14 2.2.3.2 Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K 15 2.2.3.3 Kháng nguyên lông roi H 15 2.3 TÁCH KHÁNG THỂ BẰNG AMMONIUM SULFATE 15 2.4 HỒI CHẾ KHÁNG THỂ BẰNG PHƢƠNG PHÁP THẨM TÍCH 16 2.5 PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ 17 2.5.1 Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) 17 2.5.2 Các đặc tính chung liên kết KN-KT 17 2.5.3 Phản ứng ngƣng kết KN-KT 18 2.5.3.1 Phản ứng ngƣng kết KN-KT xảy theo pha 18 2.5.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng ngƣng kết KN-KT 19 2.6 PROTEIN A 19 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 21 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 21 3.1.1 Thời gian thực nghiệm 21 3.1.2 Địa điểm 21 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 21 3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 21 3.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.4.1 Gây đáp ứng miễn dịch thỏ 22 3.4.1.1 Chuẩn bị dịch tiêm 22 3.4.1.2 Tiêm thú thí nghiệm 22 vi 3.4.1.3 Bố trí thí nghiệm 23 3.4.2 Thu nhận kháng huyết 25 3.4.2.1 Tách kháng thể amonium sulfate bão hoà 26 3.4.2.2 Phục hồi kháng thể 26 3.4.3 Xử lí kháng huyết 27 3.4.3.1 Hấp phụ kháng thể không đặc hiệu 28 3.4.3.2 Gắn kháng thể với protein A Staphylococcus aureus 29 3.4.4 Đánh giá 30 3.4.4.1 Định tính (bằng phản ứng ngƣng kết nhanh phiến kính) 30 3.4.4.2 Định lƣợng (định hiệu giá phản ứng ngƣng kết chậm ống nghiệm) 31 3.5 CHỈ TIÊU THEO DÕI 32 3.6 XỬ LÍ KẾT QUẢ 32 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .33 4.1 KẾT QUẢ 33 4.1.1 Định tính 33 4.1.1.1 Qui trình ngắn ngày 33 4.1.1.2 Qui trình dài ngày 34 4.1.2 Định lƣợng 34 4.1.2.1 Qui trình ngắn ngày 35 4.1.2.2 Qui trình dài ngày 36 4.1.2.3 Hiệu gây đáp ứng miễn dịch qui trình 37 4.1.3 Xử lí tăng độ nhạy kháng huyết 38 4.1.3.1 Xác định nồng độ S aureus thích hợp gắn với kháng huyết 38 4.1.3.2 Kiểm tra phản ứng ngƣng kết với kháng huyết xử lí gắn S aureus 38 4.1.4 Xử lí tăng độ đặc hiệu kháng huyết 40 4.2 THẢO LUẬN 42 4.2.1 Định tính 42 4.2.2 Định lƣợng 43 4.2.2.1 Qui trình ngắn ngày 43 4.2.2.2 Qui trình dài ngày 43 vii 4.2.3 Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết 44 4.2.4 Xử lí tăng độ đặc hiệu kháng huyết 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 KẾT LUẬN 46 5.2 ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC .49 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT APC Antigen-presenting cell (Tế bào trình diện kháng nguyên) E coli Escherichia coli Ig Immunoglobulin (Globulin miễn) IL Interleukine KHT Kháng huyết KN Kháng nguyên KT Kháng thể KN-KT Kháng nguyên – Kháng thể MHC II Major histocompatibility complex class II antigens (các kháng nguyên phù hợp tổ chức lớp II) S aureus Staphylococcus aureus SIg Surface immunoglobulin (Globulin miễn màng tế bào) TCR T cell receptor (Thụ quan bề mặt tế bào T) TH lympho T helper cell (tế bào lympho T hỗ trợ) ix DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cấu trúc tổng quát phân tử kháng thể Hình 2.2 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II biểu lộ bề mặt tế bào 10 Hình 2.3 Phức hợp KN- MHC lớp II gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4+ tế bào TH 10 Hình 2.4 Cấu trúc đặc trƣng tế bào tƣơng 11 Hình 2.5 Đáp ứng tế bào B với kháng nguyên mối liên hệ đáp ứng với hàm lƣợng kháng thể huyết 12 Hình 2.6 Sự khác biệt KN phụ thuộc tuyến ức KN không phụ thuộc tuyến ức kích hoạt đáp ứng tế bào B 13 Hình 2.7 Đáp ứng tạo kháng thể khác tùy vào KN phụ thuộc tuyến ức hay không phụ thuộc tuyến ức KN không phụ thuộc vào tuyến ức không gây thay đổi từ sản xuất IgM sang IgG 13 Hình 2.8 Trên bao thẩm tích có lỗ nhỏ cho phép phân tử muối ngồi cịn KT bị giữ lại 17 H ình 2.9 Phản ứng ngƣng kết kháng thể tạo nên 19 Hình 2.10 Kháng thể IgG gắn với protein A S aureus 20 Hình 3.1 Tủa kháng huyết 26 Hình 3.2 Dịch kháng huyết tủa amonium sulfate trƣớc sau thẩm tích 27 Hình 3.3 Phản ứng ngƣng kết phiến kính 30 Hình 3.4 Phản ứng ngƣng kết chậm ống nghiệm 32 Hình 7.1 Thỏ ni thí nghiệm 50 Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai 50 Hình 7.3 Tiêm dƣới da 50 x 37 Tƣơng tự nhƣ qui trình ngắn ngày, qui trình dài ngày có hàm lƣợng kháng thể kháng huyết sau tủa ammonium sulfate thẩm tích thƣờng thấp hiệu giá KT lƣợng kháng thể kháng huyết thô lúc đầu 2500 2000 1500 1000 500 huyết KHT thẩm tích mũi nhắc lại mũi nhắc lại thời điểm lấy máu Biểu đồ 4.4 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết huyết lúc đầu KHT thẩm tích qui trình dài ngày 4.1.2.3 Hiệu gây đáp ứng miễn dịch qui trình Hiệu gây đáp ứng miễn dịch đƣợc đánh giá qua việc so sánh trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết kháng huyết thỏ sau lần tiêm nhắc lại thứ qui trình ngắn ngày sau lần tiêm nhắc lại thứ 3, thứ qui trình dài ngày Kết đƣợc thể qua bảng 4.5 Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết kháng huyết thỏ qui trình ngắn ngày dài ngày Qui trình ngắn ngày Qui trình dài ngày Lần 1/1600 Sau mũi nhắc lại 1/1120 Lần 1/1120 Sau mũi nhắc lại 1/1920 Lần 1/720 Trung bình 1/1147 Trung bình 1/1520 Kết cho thấy trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại qui trình ngắn ngày thấp trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại qui trình dài ngày 38 4.1.3 Xử lí tăng độ nhạy kháng huyết Để tăng độ nhạy phản ứng ngƣng kết phiến kính ta cho kháng thể KHT gắn với protein A Staphylococcus aureus 4.1.3.1 Xác định nồng độ S aureus thích hợp gắn với kháng huyết KHT thỏ thu đƣợc lần lấy máu cuối (lấy máu lần 3) đƣợc gắn với S aureus nồng độ khác theo quy trình 3.4 Thực phản ứng ngƣng kết phiến kính ta thu đƣợc kết nhƣ sau: Bảng 4.6 Kết phản ứng ngƣng kết phiến kính với kháng huyết gắn S aureus nồng độ khác VKHT : VS aureus Nồng độ S aureus (tế bào / ml) 1:4 109 1010 1011 1012 1013 1014 1015 1:9 ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ + + + + ++ ++ ++ Ghi chú: Đối chứng KHT lần lấy máu thứ (thỏ 1) khơng xử lí với S aureus cho kết (+) KHT trƣớc gây đáp ứng miễn dịch đƣợc xử lí với S aureus cho kết (-) Dựa vào bảng kết ta thấy: Phản ứng ngƣng kết thấy rõ KHT gắn với S aureus có nồng độ 1014, 1015 tế bào/ ml Trong đó, nồng độ S aureus 1014 cho kết khơng khác nồng độ 1015 Tỉ lệ thể tích KHT kết hợp với S aureus 1:4 cho kết ngƣng kết phiến kính rõ tỉ lệ 1:9 Nhƣ việc xử lí gắn kháng thể với protein A S aureus làm tăng độ nhạy phản ứng ngƣng kết, giúp cho việc đọc kết đƣợc dễ dàng 4.1.3.2 Kiểm tra phản ứng ngƣng kết với kháng huyết xử lí gắn S aureus Việc xử lí kháng huyết với S aureus làm tăng độ nhạy phản ứng ngƣng kết, điều cho phép xác định xác thời điểm xuất 39 kháng thể Dựa vào kết mục 4.1.3.1., tiến hành xử lí kháng huyết với dịch vi khuẩn S aureus có nồng độ 1014 tế bào/ ml với tỉ lệ thể tích KHT : dịch vi khuẩn 1:4 Kết phản ứng ngƣng kết phiến kính đƣợc trình bày bảng 4.6 4.7 a Qui trình ngắn ngày Bảng 4.7 Kết thử phản ứng ngƣng kết nhanh phiến kính với kháng huyết đƣợc xử lí khơng đƣợc xử lí với S aureus thỏ thỏ Thỏ Lấy máu Trƣớc tiêm Sau mũi mẫn cảm Sau mũi nhắc lại Sau mũi nhắc lại Sau mũi nhắc lại Sau mũi nhắc lại (lấy máu lần 1) Lấy máu lần Lấy máu lần Thỏ Thỏ Không xử lí với S aureus Xử lí với S aureus Khơng xử lí với S aureus Xử lí với S aureus + + + ++ + + ++ ++ + ++ + ++ + + + +++ + + ++ + So với KHT khơng gắn S aureus KHT gắn S aureus cho kết phản ứng ngƣng kết phiến kính rõ ràng Tuy nhiên khơng có khác biệt thời điểm phát kháng thể Ở hai trƣờng hợp cho kết phản ứng ngƣng kết dƣơng tính với mẫu đƣợc lấy sau tiêm mũi nhắc lại lần b Qui trình dài ngày Bảng 4.8 Kết thử phản ứng ngƣng kết nhanh phiến kính với kháng huyết đƣợc xử lí khơng đƣợc xử lí với S aureus thỏ 3, thỏ thỏ Thỏ L.máu Trƣớc tiêm Sau mũi mẫn cảm Sau mũi nhắc lại Sau mũi nhắc lại Sau mũi nhắc lại Sau mũi nhắc lại Thỏ Thỏ Thỏ Khơng Khơng Khơng Xử lí với Xử lí với Xử lí với xử lí với xử lí với xử lí với S aureus S aureus S aureus S.aureus S aureus S aureus ± ± ± ± + ± ± + ++ +++ ± ± ± + ++ + + + ++ +++ - + Chết 40 Kết cho thấy kháng thể đƣợc gắn với protein A S aureus cho phản ứng ngƣng kết rõ so với kháng thể không gắn protein A Sau tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày kháng thể xuất phản ứng ngƣng kết thấy rõ tiêm mũi gây mẫn cảm với liều cao Ở mũi nhắc lại phản ứng ngƣng kết thấy rõ Đặc biệt thỏ 5, sau xử lí với S aureus phát đƣợc kháng thể ngƣng kết sau mũi tiêm mẫn cảm với kháng huyết không xử lí cho kết (-) 4.1.4 Xử lí tăng độ đặc hiệu kháng huyết Do kháng nguyên sử dụng nguyên tế bào vi khuẩn E coli có kháng thể đặc hiệu chung cho loài vi khuẩn E coli đƣợc tạo thành kháng huyết Nhằm tăng độ đặc hiệu phản ứng ngƣng kết cần thiết phải loại bỏ kháng thể đặc hiệu chung Trong thí nghiệm, chúng tơi thử cho KHT hấp phụ với kháng nguyên chủng vi khuẩn E coli E68 để KHT lại kháng thể đặc hiệu cho H28 KHT đƣợc hấp phụ với vi khuẩn E coli E68, sau định hiệu giá kháng thể phản ứng ngƣng kết chậm ống nghiệm thu đƣợc kết nhƣ sau: Bảng 4.9 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng huyết sau hấp phụ thỏ thỏ (qui trình ngắn ngày) Thỏ Lấy máu Lần Không h phụ (n=2) Hấp phụ E68 (n=2) Lần Không h phụ (n=2) Hấp phụ E68 (n=2) Lần Không h phụ (n=2) Hấp phụ E68 (n=2) T1 T2 Trung bình H KHT thẩm tích H KHT thẩm tích 1/1600 1/960 1/1600 1/480 1/1160 1/48 1/48 1/48 1/20 1/41 1/960 1/240 1/1280 1/640 1/780 1/48 1/6 1/48 1/48 1/38 1/480 1/640 1/960 1/480 1/640 1/24 1/10 1/32 1/20 1/22 41 Bảng 4.10 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng huyết sau hấp phụ thỏ thỏ (qui trình dài ngày) Thỏ T3 Lấy máu T4 Trung bình H Mũi nhắc lại Khơng h phụ (n=2) Hấp phụ E68 (n=2) Mũi nhắc lại Không h phụ (n=2) Hấp phụ E68 (n=2) KT thẩm tích H KT thẩm tích 1/1280 1/960 1/960 1/640 1/960 1/16 1/12 1/64 1/24 1/29 1/1280 1/320 1/2560 1/1920 1/1520 1/48 1/6 1/128 1/96 1/70 Dựa vào kết bảng 4.9 4.10 ta thấy có giảm đáng kể hiệu giá kháng thể hiệu giá KT ngƣng kết KHT hấp phụ so với KHT không hấp phụ 1400 1200 1000 800 600 400 200 Huyết HT hấp phụ E68 lần lần lần thời điểm lấy máu Biểu đồ 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết huyết đƣợc không đƣợc hấp phụ qui trình ngắn ngày 42 hiệu giá KT 2000 1500 Huyết HT hấp phụ E68 1000 500 mũi nhắc lại mũi nhắc lại thời điểm lấy máu Biểu đồ 4.6 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết huyết đƣợc không đƣợc hấp phụ qui trình dài ngày 4.2 THẢO LUẬN 4.2.1 Định tính Khi tiêm kháng ngun lần đầu khoảng ngày sau kháng thể xuất huyết nhƣng hàm lƣợng thấp nên khó phát đƣợc phƣơng pháp thông thƣờng đặc biệt phản ứng ngƣng kết nhanh phiến kính có độ nhạy thấp Kháng thể đƣợc phát phƣơng pháp nồng độ kháng thể lên đến đỉnh điểm (khoảng 12-15 ngày sau tiêm kháng nguyên) Ở qui trình ngắn ngày, kháng thể phát đƣợc huyết sau mũi nhắc lại lần (sau tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày) 14 ngày thời gian đủ để hàm lƣợng kháng thể máu lên cao nên phát phản ứng ngƣng kết Kháng thể tiếp tục tồn máu mũi nhắc lại (khoảng cách mũi nhắc lại cách ngày) Trong KHT lần lấy máu cuối (15 ngày sau tiêm mũi nhắc lại cuối cùng) diện kháng thể Ở qui trình dài ngày, kết phản ứng ngƣng kết phiến kính với KHT sau tiêm mũi gây mẫn cảm mũi nhắc lại 1,2 khơng rõ ràng Có thể kháng thể xuất KHT sau tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày nhƣng hàm lƣợng kháng thể huyết cịn thấp nên khó phát đƣợc Ở mũi nhắc lại thứ thứ phản ứng ngƣng kết cho kết rõ Có thể tiêm nhắc lại loại kháng nguyên vào thể giúp tăng cƣờng việc chọn lọc dòng kháng thể có lực cao với kháng nguyên phát triển tạo kháng thể có lực mạnh nhiều 43 Để tăng cƣờng khả đáp ứng miễn dịch, mũi gây mẫn cảm nên tiêm thêm vi khuẩn lao vaccine ho gà hai loại kháng nguyên kích thích tổng hợp số cytokin cần thiết giúp kích thích miễn dịch mạnh Ngoài ra, sử dụng tá chất làm tăng cƣờng khả đáp ứng miễn dịch 4.2.2 Định lƣợng 4.2.2.1 Qui trình ngắn ngày Kháng thể phát kháng huyết sau mũi nhắc lần (14 ngày sau tiêm mũi mẫn cảm) Do số lƣợng KHT thu đƣợc sau mũi nhắc lại lần 2, lần q khơng đủ để định lƣợng nên khơng thể xác định đƣợc hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại lần 2, lần mà định lƣợng đƣợc KHT sau mũi nhắc lại lần (tiêm lần cuối) thời điểm khác (5, 10, 15 ngày sau tiêm mũi nhắc lại cuối cùng) Hiệu giá kháng thể ngƣng kết kháng huyết giảm dần qua lần lấy máu Hiệu giá kháng thể ngƣng kết cao đợt lấy máu lần (5 ngày sau tiêm mũi nhắc lại cuối cùng) thấp đợt lấy máu lần (15 ngày sau tiêm mũi nhắc lại cuối cùng) Đáp ứng miễn dịch giảm dần việc ngừng cung cấp kháng ngun Qui trình ngắn ngày khơng tạo đáp ứng miễn dịch đủ mạnh kéo dài Với liều tiêm, lần lấy máu thứ nhất, hiệu giá kháng thể ngƣng kết thỏ thỏ Nhƣng lần lấy máu thứ 2, thứ hiệu giá kháng thể ngƣng kết thỏ cao thỏ có lẽ cá thể có sức đề kháng, trạng thái thể chất thần kinh thể khác nên khả đáp ứng miễn dịch khác 4.2.2.2 Qui trình dài ngày Thơng thƣờng hiệu giá kháng thể ngƣng kết kháng huyết mũi nhắc lại sau phải cao mũi nhắc lại trƣớc nhƣng ta thấy hiệu giá kháng thể ngƣng kết thỏ mũi nhắc lại lần lần đáp ứng miễn dịch thỏ đạt đến ngƣỡng cao nên không tăng lên thỏ bị bệnh nên sức để kháng giảm làm giảm đáp ứng miễn dịch, việc tiêm thuốc trị bệnh thỏ ảnh hƣởng đến khả đáp ứng miễn dịch Ở mũi nhắc lại lần 3, hiệu giá kháng thể ngƣng kết thỏ (liều tiêm mẫn cảm 1ml) cao thỏ (liều tiêm mẫn cảm 1,5 ml) Điều chứng tỏ liều tiêm 1,5 ml không ảnh hƣởng lớn đến đáp ứng miễn dịch mà phụ thuộc chủ yếu vào khả đáp ứng miễn dịch cá thể 44 Ở thỏ 4, hiệu giá kháng thể ngƣng kết mũi nhắc lại lần cao mũi nhắc lại lần nhiều so với thỏ Điều cho thấy đặc điểm cá thể giữ vai trò định đáp ứng miễn dịch với yếu tố kháng nguyên xâm nhập Ở hai qui trình ngắn ngày dài ngày, hiệu giá kháng thể ngƣng kết kháng huyết nguyên cao hiệu giá kháng huyết tủa với ammonium sulfate thẩm tích Điều trình tủa rửa tủa số protein kháng thể bị biến tính bị trơi So với qui trình ngắn ngày, qui trình dài ngày cho lƣợng kháng thể cao (tăng dần lần lặp lại) Do gây miễn dịch để thu kháng huyết nên chọn qui trình dài ngày thu đƣợc lƣợng KHT nhiều (có thể lặp lại đến mũi nhắc lại thứ 7) kháng thể tạo có lực cao với kháng nguyên Tuy nhiên số thú thí nghiệm chƣa nhiều việc lặp lại cần thiết để có kết luận chắn 4.2.3 Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết Phản ứng ngƣng kết nhanh phiến kính phản ứng có độ nhạy thấp, phát đƣợc kháng thể KHT nồng độ cao Do để tăng độ nhạy nhằm xác định xác diện kháng thể huyết ta cho kháng thể gắn với protein A S aureus Protein A thành vi khuẩn S aureus có khả gắn với IgG thỏ tốt Khi cho kháng thể gắn với protein A phản ứng với kháng ngun thích hợp kháng thể với S aureus ngƣng kết với kháng nguyên hạt ngƣng kết lớn nhiều lần so với kháng thể không gắn protein A Do việc gắn kháng thể với protein A S aureus làm tăng độ nhạy phản ứng ngƣng kết Tuy tỉ lệ kết hợp kháng huyết S aureus tác động đến kết phản ứng ngƣng kết Thử nghiệm cho thấy tỉ lệ thích hợp KHT dịch vi khuẩn S aureus nghiên cứu 1:4 với nồng độ S aureus 1014 tế bào/ ml 4.2.4 Xử lí tăng độ đặc hiệu kháng huyết Khi đƣa kháng nguyên vào thể kích thích thể tạo kháng thể chống lại định kháng nguyên (các epitop) Nếu kháng nguyên có định KN thể tạo loại kháng thể đặc hiệu với định KN Nếu KN có nhiều định KN khác ứng với định KN thể tạo KT phù hợp 45 Vi khuẩn E coli kháng nguyên gồm nhiều định KN khác nhau, có số định KN giống cho tất chủng E coli Kháng thể tạo có số kháng thể đặc hiệu cho tất chủng E coli việc định tính kháng thể kháng chủng E coli khơng xác Chủng O139:K82 (H28) chủng K88+ (E68) thuộc nhóm E coli gây bệnh heo nên chúng có số yếu tố kháng nguyên giống Do dùng chủng E68 để hấp phụ huyết loại kháng thể chung cho E68 H28 nên huyết lại kháng thể đặc hiệu cho H28 Vì việc thực phản ứng ngƣng kết với kháng huyết hấp phụ E68 cho hiệu giá thấp 46 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Kháng thể ngƣng kết phát đƣợc kháng huyết sau tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày Hiệu lực gây đáp ứng miễn dịch kháng nguyên biến đổi tùy theo qui trình gây miễn dịch Khoảng cách lần tiêm nhắc kháng nguyên E coli thỏ 28 ngày tạo hiệu giá kháng thể ngƣng kết cao so với khoảng cách lần tiêm nhắc ngày Để tăng độ nhạy phản ứng ngƣng kết phiến kính KHT đƣợc xử lí gắn với S aureus (nồng độ 1014 tế bào/ ml) tỉ lệ thể tích KHT : S aureus 1:4 Xử lí kháng huyết cách kết tủa thẩm tích làm giảm đáng kể hiệu giá kháng thể ngƣng kết kháng huyết 5.2 ĐỀ NGHỊ Với qui trình ngắn ngày cần định lƣợng KHT sau mũi nhắc lại thứ 2, thứ để xác định thời điểm kháng thể KHT nhiều Nên thử nghiệm sử dụng chất bổ trợ để tăng cƣờng khả đáp ứng miễn dịch thỏ Lặp lại thí nghiệm với số lƣợng thú thí nghiệm lớn để đánh giá xác hiệu đáp ứng miễn dịch hai qui trình 47 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tiếng việt Nguyễn Ngọc Hải, 1999 Phân lập vi khuẩn E coli gây bệnh phù heo sau cai sữa khảo sát khả nhạy cảm chúng số kháng sinh Luận án Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Lê Văn Hùng, 2002 Giáo trình miễn dịch học thú y NXB Nông Nghiệp, TP.HCM 191 trang Đỗ Ngọc Liên, 2004 Miễn dịch học sở NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội tr 3-119 Đỗ Ngọc Liên, Thực hành hóa sinh miễn dịch NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Nhƣ Thanh, 1996 Miễn dịch học NXB Nông Nghiệp Hà Nội Bộ mơn miễn dịch - sinh lí bệnh trƣờng đại học Y Hà Nội, 1997 Miễn dịch học NXB Y học Hà Nội Phần tiếng Anh Cooper G Terrance, 1977 The Tools of Biochemistry John Wiley & Sons, New York, USA p 257-277, 355-405 Dress W D Immunization of experimental animals Applications of Immunological Methods in Biomedical Sciences, Volume (Edited by D M Weir, Co-editors L A Herzenberg, Caroline black well, Leonone A Herzenberg) Black well Scientific Publications p 8.1-8.18 Gross J R and Rowe B., 1985 Serotyping of Escherichia coli The Virulence of Escherichia coli (M Sussman) Academic Press, London, England p 345356 10 Harlow Ed and Lane David, 1988 Antibodies: a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory p 92-137, 286-299 11 Mahler R Henry and Cordes H Eugene, 1967 Biological chemistry Harper & Row, New YorK, USA p 63-69 12 Sojka J W., M.R.C.V.S, 1965 Escherichia coli in domestic animals and poultry Commonwealth Agricultural Bureaux Farham Royal, Bucks, England p 205-212 48 13 Tizar Ian R., 1992 Immunology: an introduction, Third Edition Sauders College Publishing, New York, USA p 13-25, 112-128, 167-189, 219-236 Internet http://www.bio.mtu.edu/campbell/bl482/lectures/lec5/482w52.htm http://www.uccs.edu/~rmelamed/MicroFall2002/Chapter%2017/Antibody%20Ti me%20Course.jpg http://www.accessexcellence.org/ RC/VL/GG/antiBD_mol.html http://www.cvm.uiuc.edu/courses/vp331/Staphylococci/proteinA.gif 49 PHẦN PHỤ LỤC Thành phần môi trƣờng TSB (Tryptone Soya Broth) tổng hợp: Casein enzymic hydrolysate 17 g/l Popaic digest of soyabean meal g/l Sodium chloride 2,5 g/l Dipotassium phosphate 2,5 g/l Dextrose 2,5 g/l pH = 7,3 ± 0,2 (ở 25oC) Pha chế: cân 30g bột TSB hòa 1l nƣớc cất, đun sơi cho tan sau đem hấp khử trùng 121oC 15 phút Nếu pha môi trƣờng TSA bổ sung thêm 17,5g agar Thành phần đệm PBS 10X NaCl 84,74g NaH2PO4.2H2O 10,14g Na2HPO4.12H2O 51,93g NaN3 5g Pha đệm: cân tất thành phần hòa tan nƣớc cất để đƣợc 1l dung dịch đệm PBS 10X Pha PBS 1X: 100 ml đệm PBS 10X + 900 ml nƣớc cất 1000 ml PBS 1X Pha amonium sulfate bão hòa 100%S: cân 767g (NH4)2SO4 hòa 1l nƣớc cất Hỗn hợp đƣợc khuấy từ có đun nóng cho tan hết muối, bảo quản nhiệt độ phòng Pha amonium sulfate bão hòa 45%S: 450 ml (NH4)2SO4 100%S + 550 ml PBS 1X 1000 ml (NH4)2SO4 45%S 50 Hình 7.1 Thỏ ni thí nghiệm Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai Hình 7.3 Tiêm dƣới da 51 Bảng 1: Kết phản ứng ngƣng kết chậm ống nghiệm với kháng huyết độ pha lỗng cao có phản ứng ngƣng kết xảy thỏ thỏ Thỏ Thỏ Lấy máu Lần Lần Lần H Không h phụ (n=2) Hấp phụ E68 (n=2) Không h phụ (n=2) Hấp phụ E68 (n=2) Không h phụ (n=2) Hấp phụ E68 (n=2) 1/1600 1/1600 1/32 1/64 1/640 1/1280 1/32 1/64 1/320 1/640 1/32 1/16 KHT thẩm tích 1/1280 1/640 1/32 1/64 1/320 1/160 1/8 1/4 1/640 1/640 1/4 1/16 Thỏ H KHT thẩm tích 1/640 1/2560 1/32 1/64 1/1280 1/1280 1/64 1/32 1/640 1/1280 1/32 1/32 1/640 1/320 1/8 1/32 1/640 1/640 1/64 1/32 1/640 1/320 1/8 1/32 Bảng 2: Kết phản ứng ngƣng kết chậm ống nghiệm với kháng huyết độ pha lỗng cao có phản ứng ngƣng kết xảy thỏ 3, thỏ thỏ Thỏ Lấy máu Mũi Không h phụ (n=2) nhắc Hấp phụ E68 lại (n=2) Mũi Không h phụ nhắc (n=2) Hấp phụ E68 lại (n=2) Thỏ H KHT thẩm tích 1/1280 1/1280 1/16 1/16 1/1280 1/1280 1/32 1/64 1/1280 1/640 1/8 1/16 1/320 1/320 1/4 1/8 Thỏ H 1/1280 1/640 1/64 1/64 1/2560 1/2560 1/128 1/128 KHT thẩm tích 1/640 1/640 1/32 1/16 1/2560 1/1280 1/128 1/64 ... THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E coli Giáo vi? ?n hƣớng dẫn: Sinh vi? ?n thực hiện: TS NGUYỄN NGỌC HẢI PGS TSKH NGUYỄN LÊ... vụ cho vi? ??c chẩn đoán bệnh miễn dịch học chăn ni cịn ít, áp dụng cho số bệnh Xuất phát từ yêu cầu thực tế chúng tơi vào nghiên cứu đề tài ? ?Thử nghiệm sản xuất kháng huyết kháng vi khuẩn E coli? ??... TÓM TẮT NGUYỄN VÂN ANH, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 “THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E coli? ?? Hội đồng hƣớng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Hải PGS TSKH Nguyễn Lê Trang
