Đang tải... (xem toàn văn)
Bệnh sán lá gán lớn ở trâu bò và các động vật nhai lại khác như dê, cừu là một trong những nguyên nhân gây tổn thất kinh tế trong ngành công nghiệp chăn nuôi.
1 PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.2 Đặt vấn đề Bệnh sán lớn gan bệnh phổ biến trâu bò động vật khác dê, cừu Bệnh có khả lây truyền qua người ăn rau sống mọc nước có chứa nang trùng Có hai loại sán lớn gan Fasciola gigantica Fasciola hepatica Fasciola gigantica phổ biến vùng nhiệt đới Đông Nam Á, Châu Phi, Hawaii, Pakistan Thái Lan; Fasciola hepatica phổ biến Châu Âu, vùng Đông Nam Châu Phi, Mỹ, Châu Úc Nhật Bản Các cơng trình nghiên cứu tác giả nước cho thấy động vật ăn cỏ Việt Nam trâu bò bị nhiễm sán gan cao đa số F gigantica Bệnh sán gan làm giảm trọng lượng vật rõ rệt, giảm phẩm chất thịt (thịt bị thấm ướt), giảm sức chống đỡ với bệnh khác, làm giảm lượng sữa trâu bị ni lấy sữa Ở Việt Nam, trước bệnh Fasciola sp người chưa phát Tuy nhiên, tỉ lệ người mắc bệnh có chiều hướng gia tăng xác định với kỹ thuật chẩn đoán bệnh ngày xác Theo cơng trình nghiên cứu khoa học giới, ký sinh thể vật chủ, sán gan lớn tiết chất có đặc tính sinh học kháng ngun (nên gọi kháng nguyên tiết) thể chủ Loại kháng nguyên đánh giá có mức độ đặc hiệu cao kháng nguyên thân kháng ngun bề mặt, việc chẩn đốn bệnh sán gan xác sử dụng loại kháng nguyên Ngoài ra, dịch tiết cịn có thành phần cysteine-protease biết enzyme thiết yếu cho cầu ký sinh ký sinh vật thể chủ Enzyme tinh chế dùng làm vaccine tiêm chủng cừu cho thấy, khơng loại trừ hồn tồn phát triển sán gan kết thí nghiệm chứng minh có giảm làm hẳn xuất trứng sán phân Điều góp phần hạn chế lây lan dịch bệnh, giảm thiệt hại kinh tế Những nhận định đồng ý Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – trường Đại Học Nông Lâm TPHCM Viện Pasteur TPHCM Dưới hướng dẫn TS.Nguyễn Ngọc Hải PGS.TS Nguyễn Lê Trang, tiến hành thực đề tài: “Thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica sử dụng làm kháng nguyên chẩn đoán” để xây dựng quy trình tạo kháng thể cho mục đích chẩn đốn y học nghiên cứu chế ký sinh sán gan 1.2 Mục đích đề tài Khảo sát hoạt động kháng nguyên thành phần dịch tiết Xây dựng quy trình tạo kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tiết Dùng kháng thể bệnh nhân đặc hiệu với kháng nguyên tiết tạo kỹ thuật chẩn đốn Khảo sát hoạt tính cystein-protease dịch tiết 1.3 Yêu cầu Thực kỹ thuật miễn dịch liên quan đến bệnh sán lớn gan: Thu thập sán dịch tiết Xác định nồng độ protein dịch tiết sán gan lớn (Fasciola gigantica) phương pháp Bradford Xác định thành phần protein dịch tiết phương pháp điện di SDS-PAGE 12% Kiểm tra phản ứng kháng thể huyết bệnh nhân nhiễm Fasciola sp kháng nguyên tiết dịch tiết sán gan lớn phương pháp miễn dịch khuếch tán kép Ouchterlony Tạo cột sắc ký lực Sepharose 4B - kháng nguyên tiết để tinh chế kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tiết sán gan lớn Tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết bệnh nhân nhiễm sán gan lớn, dùng sắc ký lực miễn dịch Chế tạo hệ thống miễn dịch men để phát kháng ngun Fasciola sp Tìm hoạt tính protease dịch tiết sán gan lớn với phương pháp điện di SDS-PAGE, 12% gelatine 0,1% thạch PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc lịch sử nghiên cứu sán gan bệnh sán gan lớn gây nên [4] Loài sán gan Fasciola gigantica Cobbold phát từ năm 1855 Bệnh sán gan F gigantica gây gọi bệnh sán gan, bệnh phổ biến vùng Á Châu Phi Châu Theo E Brumpt, dê, cừu, trâu, bò người nhiễm F gigantica Năm 1879, Brie người công bố mô tả bệnh sán gan cừu Năm 1881, Thomas Leuckart hai người phát vịng đời (chu trình phát triển) sán gan phải có ốc (ký chủ trung gian) tham gia hai năm sau vào năm 1883, Thomas thực nghiệm bổ sung thêm chu trình: phát trứng sán gan phát triển phải có nước, nước yêu cầu cấp bách ngoại cảnh Việc nghiên cứu chu trình phát triển sán gan sau Thomas chủ trì, cuối nghiên cứu thành cơng vịng đời F hepatica 2.2 Vòng đời sán gan lớn Trong điều kiện nhiệt độ thích hợp (từ 28-300C), có ốc ký chủ trung gian Lymnaea swinhoei Lymnaea viridis có vật chủ cuối (dê, cừu, trâu, bị nhiễm kén gây bệnh Adolescaria) vịng đời phát triển sán gan nước ta xác định với khoảng thời gian sau: Ở môi trường nước (ao, hồ, rãnh…): Trứng sán gan nở thành miracidium sau 14-16 ngày Ở ốc ký chủ trung gian: Miracidium phát triển thành sporocyst ngày Sporocyst thành redia 8-21 ngày Redia thành cercaria non 7-14 ngày Cercaria non thành cercaria trưởng thành 13-14 ngày Ở nước (ao, hồ, rãnh…): Cercaria rụng đuôi thành adolescaria gây bệnh sau Ở vật chủ cuối cùng: Thời gian sán phát triển thành sán trưởng thành 79-88 ngày Hình 2.1 – Chu kỳ phát triển sán gan lớn (Fasciola sp)[13] Như điều kiện nóng ẩm nước ta thuận lợi cho gây nhiễm bệnh nhiễm bệnh tự nhiên Gia súc nhai lại dễ cảm nhiễm kén gây bệnh Ở vùng có mầm bệnh (trứng sán), có nhiệt độ thích hợp để trứng nở thành miracidium, có ốc ký chủ trung gian, có dê, cừu, trâu, bị nuốt phải kén gây bệnh bình quân ba tháng lại tạo đời sán Con vật mang sán lại nhiễm tiếp mầm bệnh mới, gây bội nhiễm làm cho mức độ bệnh trở nên nặng 2.3 Hình thái sinh học sán gan lớn (Fasciola sp) Cũng nhiều loài sán khác, sán gan có hệ sinh dục lưỡng tính (có phận sinh dục đực cá thể) Sán có hai giác bám, giác miệng phía đầu sán, giác bụng trịn gần giác miệng Sán gan khơng có hệ tuần hồn hơ hấp Hệ tiết gồm nhiều ống nhỏ, phân nhánh thơng với hai ống Hai ống hợp lại cuối thân thông qua lỗ tiết Thực quản tương đối ngắn, ống tiêu hóa dài tận phần cuối thân sau, phân thành nhiều nhánh Dịch hoàn nằm sau buồng trứng phân nhánh PGS TS Phan Địch Lân (1994), phân biệt khái quát hai loài sán gan sau: Một lồi có chiều dài thân gấp ba lần chiều rộng, vai sán khơng có nhìn không rõ rệt, nhánh ruột chia tỏa nhiều nhánh ngang, lồi F gigantica Lồi có thân lá, thân rộng, phía đầu lồi hẳn phía trước làm cho sán có “vai đặc biệt”, nhánh ruột chia nhỏ, lồi F hepatica Hình 2.2 – Hình thái sinh học sán gan lớn (Fasciola sp)[15] 2.4 Tác hại bệnh sán lớn gan 2.4.1 Ở gia súc [4] Đây bệnh phổ biến trâu bị đồng sơng Cửu Long địa phương khác nước Sán dinh dưỡng cách ăn hồng cầu, tế bào thượng bì niêm mạc ống dẫn mật Bệnh sán gan trâu bò phổ biến vùng trũng nước ngọt, có nhiều điều kiện thuận lợi cho trứng phát triển có diện ký chủ trung gian Do sán non di hành nhu mô gan làm thương tổn gan, vật bệnh sốt, ăn, mệt mỏi Triệu chứng lâm sàng thường gặp gầy rạc, suy nhược thể, ỉa phân nhão không thành khn; sau vật lúc táo bón, lúc tiêu chảy, niêm mạc mắt nhợt nhạt; lông xù, mốc, dễ nhổ Phân có mùi khắm, đen, hốc mắt sau, có có nhèm; có thủy thủng nách, ức, chướng cỏ, thở hôi, vùng gan sưng lên Khi sờ vào vùng vật có cảm giác đau đớn chết dễ dàng viêm gan nặng suy kiệt 2.4.2 Ở ngƣời [3] Bệnh tiến triển theo hai giai đoạn: Giai đoạn gan (xâm nhập): Các triệu chứng xuất khoảng 6-12 tuần sau ăn phải nang ấu trùng vào kéo dài - tháng Trong giai đoạn này, số lượng lớn ấu trùng di chuyển qua thành ruột, qua khoang phúc mạc, bao gan Các triệu chứng hay gặp đau bụng, sốt cơn, sút cân, mề đay, ho, khó thở, đau ngực, rối loạn đại tiện, chán ăn buồn nơn Có đau khắp bụng thường khu trú vùng hạ sườn phải Bạch cầu toan tăng cao (70% - 80%) Giai đoạn mật (trưởng thành): Có thể kéo dài nhiều năm Fasciola sp có xu hướng di chuyển đến lòng ống mật chủ phát triển thành sán trưởng thành Trên đường sán ăn mơ gan ký chủ gây triệu chứng nặng Gan to, vàng da, thiếu máu (một sán trưởng thành hút 0,2 ml máu /ngày) Đơi sán non lọt vào tĩnh mạch đại tuần hoàn định vị nơi xa mô da, phổi, mắt… (trường hợp ký sinh trùng lạc chỗ) Sau ba tháng, sán định vị ống mật Người bệnh có triệu chứng viêm gan mật mãn, tiếp tục bị mệt mỏi, sụt cân, biếng ăn… Giai đoạn này, số bạch cầu toan lại giảm nhiều Trong phân dịch mật người bệnh bắt đầu tìm thấy trứng sán Nhưng thực tế số trứng xét nghiệm định Bệnh tiếp tục kéo dài nhiều năm, để tồn lưu lâu ngày bị bệnh mãn tính đường mật dẫn đến biến chứng xơ gan, vỡ gan, suy gan, đau bụng dai dẳng, sức lao động cuối dẫn đến tử vong 2.5 Chẩn đốn, phịng ngừa điều trị bệnh sán lớn gan 2.5.1 Ở gia súc [4] Chẩn đoán: Chú ý đến tính chất vùng có đủ điều kiện thích hợp cho sán phát triển Trâu bị thể mãn tính gầy ốm, suy nhược tiêu chảy kéo dài (viêm ruột mãn) Để tìm trứng sán phân ta sử dụng phương pháp gạn rửa sa lắng phân: lấy 4-8 viên phân, phân nhão lấy lượng phân táo ta, hòa nước lọc qua lưới thép bỏ bớt cặn bã Nước lọc để lắng cặn gạn rửa nhiều lần gạn nước bỏ đi, lấy cặn phân soi kính hiển vi tìm trứng sán gan độ phóng đại 100 lần Trứng sán gan hình bầu dục, đầu nhỏ hơn, màu vàng nâu, có phơi bào xếp sát đến vỏ trứng Hình 2.5.1 – Trứng sán gan lớn (Fasciola sp)[17] Theo Enigh, sán gan năm thải theo phân khoảng 6000 trứng sán sống thể gia súc tới 11 năm Trong điều kiện nhiệt độ ẩm độ thích hợp, phần số trứng phát triển, miracidium phát triển thành chừng 180 – 200 cercaria trưởng thành Sự khô tác động trực tiếp ánh nắng mặt trời làm trứng chết Trong phân ướt trứng sống tháng Trứng sán ngừng phát triển 10-120C Ở nhiệt độ 500C trứng sống ngày Trong cỏ phơi chưa khô, adolescaria gây bệnh trì sức sống 3-5 tháng Phịng bệnh: + Chống phát tán mầm bệnh: Ủ phân diệt trứng sán, làm tinh “tinh khiết” ốc ký chủ trung gian Áp dụng biện pháp chia lô chăn thả, qui hoạch bãi chăn gia súc không bị nhiễm sán, kiểm tra gia súc để phân loại tẩy sán trước thả vào bãi + Diệt mầm bệnh: Tẩy sán gan thể gia súc theo lịch dựa vào chu trình sinh học sán Những sở giống tháng tẩy lần; sở ô nhiễm nặng tẩy lần/năm; sở ô nhiễm nhẹ tẩy lần/1 năm; sở nhiễm 20% tổng đàn phát có sán tẩy cần tăng cường sức khỏe đàn gia súc chế độ ăn uống quản lý tốt sức cày kéo trâu bò, định kỳ kiểm tra sức khỏe Điều trị: + Dertyl – B cho uống liều – mg/ kg thể trọng + Dovenix: Chích bắp ml/ 25 kg thể trọng Khi điều trị nên kết hợp bồi dưỡng cho vật quản lý tốt môi trường 2.5.2 Ở ngƣời [2,3] Ở người, việc chẩn đoán sán gan gặp nhiều khó khăn có nhiều triệu chứng lâm sàng bệnh tích khơng rõ ràng Hai trường hợp nhiễm sán gan lớn người Việt Nam Đỗ Dương Thái Trịnh Văn Thịnh báo cáo vào năm 1978 Ca ghi nhận vào năm 1991 từ năm 1997 đến Trần Vinh Hiển Trần Thị Kim Dung sử dụng phương pháp huyết miễn dịch men nhằm chẩn đoán bệnh sán lớn gan người ca bệnh phát ngày nhiều Theo phương pháp này, phát 500 ca người vịng có năm Đa số bệnh nhân đến từ tỉnh ven biển miền Trung Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hịa Tất bệnh nhân có hình ảnh tổn thương gan siêu âm, tổn thương dễ nhầm với abces gan amibe; abces gan vi khuẩn, ung thư gan Bên cạnh xét nghiệm máu cho thấy bạch cầu toan tính tăng cao từ 16 – 70% tất có hiệu giá kháng thể 1/1600 – 1/12800 với kháng nguyên Fasciola gigantica 10 Hình 2.5.2.1 – Hình chụp CT bệnh nhân bị nhiễm sán gan lớn [Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh] Hình 2.5.2.2 - Hình chụp siêu âm bệnh nhân nhiễm sán lớn gan [Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh] Về điều trị dùng Dehydro – Emetine Chlorhydrate Emetine, thuốc có nhiều tác dụng phụ (gây liệt cơ, suy tim…); bệnh nhân phải nằm viện tối thiểu 10 ngày phải sử dụng thị trường 31 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nồng độ protein dịch tiết sán gan lớn đƣợc xác định phƣơng pháp Bradford Sau xử lý số liệu phần mềm KC4 ta tính nồng độ protein dịch tiết sán gan lớn Nồng độ protein đo = 1,4258 1,2806 1,4433 1,38mg / ml 4.2 Kết điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein dịch tiết sán gan lớn Albumin Mẫu Papain Lysozyme Hình 4.2.1 – Kết điện di để xác định trọng lƣợng phân tử protein dịch tiết sán gan lớn Giếng 1, 2, 3, 5, 7: Protein dịch tiết sán gan lớn với nồng độ khác Giếng 4,6 : Protein chuẩn - Albumin ( MW = 66 kDa; Nồng độ 1,53 mg/ml) - Papain (MW = 23 kDa; Nồng độ 2,8 mg/ml) - Lysozyme (MW = 14 kDa; Nồng độ 4,3 mg/ml) 32 Hình 4.2.2 – Đồ thị tuyến tính đƣờng di chuyển protein chuẩn trọng lƣợng phân tử Nhận xét: Dựa theo hình điện di đồ thị ta thấy dịch tiết sán gan lớn có thành phần protein trội có trọng lượng phân tử xấp xỉ khoảng từ 27 – 29 kDa 4.3 Kết miễn dịch khuếch tán kép kiểm tra độ đặc hiệu kháng nguyên tiết dịch tiết sán gan lớn so với kháng ngun thân Kháng ngun tiết kháng nguyên thân sán gan lớn pha lỗng bậc hai nồng độ ½ với PBS Cho mẫu vào giếng tương ứng Ta có kết sau: 33 Kháng nguyên tiết Kháng nguyên thân Hình 4.3 – Kết miễn dịch khuếch tán kép phát kháng thể đặc hiệu huyết bệnh nhân Kết cho thấy đường tủa kháng nguyên tiết kháng thể bệnh nhân bị nhiễm bệnh rõ nét Cho thấy độ đặc hiệu kháng nguyên tiết cao kháng nguyên thân so với kháng thể Fasciola sp 4.4 Kết tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết bệnh nhân Từ 4ml huyết ban đầu bệnh nhân bị nhiễm Fasciola sp qua giai đoạn tủa kháng thể Sau đo OD280 ta thu nồng độ kháng thể 21 mg/ml Bảo quản kháng thể thu dung dịch đệm PBS 1X 34 4.5 Giải hấp kháng thể từ cột sắc ký lực tạo với kháng nguyên tiết IgG kháng nguyên tiết OD280nm 2.5 1.5 0.5 0 10 20 30 Đoạn 1ml Hình 4.5 – Tinh chế kháng thể qua sắc ký lực dùng Sepharose – 4B cộng hợp với protein tiết từ Fasciola gigantica Sau giải hấp với glycine pH = 2.5, đoạn số đến số 27 gom lại hấp phụ quang trung bình đo là: [IgG kháng nguyên tiết] = 0,293 mg/ml 35 4.6 Kết phát kháng nguyên tiết huyết bệnh nhân phƣơng pháp ELISA Sau xử lý số liệu phần mềm KC4 ta có kết sau: Bảng 4.6 – Kết phát kháng nguyên tiết huyết bệnh nhân hệ thống ELISA Giếng A 0.014 0.016 HT - B 0.728 0.726 31.25ng C 1.099 1.124 62.5 D 1.312 1.418 125 E 1.506 1.367 250 F 1.558 1.339 500 G 1.495 1.406 1000 H ] 0.013 0.012 HT + Abs 490 nm 1.5 0.5 0 125 250 375 500 625 750 875 1000 Nồng độ k háng nguyên tiết (ng/ml) Hình 4.6.1 – Đồ thị hệ thống ELISA phát kháng nguyên tiết huyết bệnh nhân 36 Kết cho thấy hệ thống hoạt động tốt phát hàm lượng kháng nguyên tiết huyết bệnh nhân giá trị 125 ng/ml Tuy nhiên huyết bệnh nhân dương tính khơng cho thấy có kháng nguyên tiết trường hợp nhiễm Fasciola sp mãn tính nên lượng kháng nguyên tiết tiết phân Hình 4.6.2 – Đồ thị biểu biến động kháng nguyên tuần hoàn máu phân bệnh nhân nhiễm Fasciola sp [11] 37 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica xác định nồng độ protein dịch tiết phương pháp Bradford, ta thu xấp xỉ 6,5 mg protein tiết/ sán/ 24 Dịch tiết sán gan lớn chứa thành phần protein trội có trọng lượng phân tử khoảng từ 27-29 kDa Đặc tính kháng nguyên tiết thành phần protein đặc hiệu so với kháng nguyên thân Fasciola sp nên sử dụng để chẩn đoán bệnh sán gan lớn người xác Với protein tiết, giá sắc ký lực thực Giá sắc ký cho phép tinh chế từ huyết bệnh nhân kháng thể (IgG), đặc hiệu với protein tiết sán Các kháng thể sử dụng để thực hệ thống thử nghiệm miễn dịch cộng hợp enzyme (ELISA) để sử dụng chẩn đoán 5.2 Đề nghị Gia tăng độ nhạy phản ứng ELISA Sử dụng kháng nguyên tiết để phát kháng thể huyết bệnh nhân nhiễm Fasciola sp Thử nghiệm phát kháng nguyên tiết phân bệnh nhân Xác định lại hoạt tính tinh chế enzyme cystein-protease dịch tiết sán gan lớn Trên sở ứng dụng kỹ thuật phân tử để nghiên cứu đặc tính enzyme mục đích chẩn đoán điều chế vaccine chống sán gan lớn 38 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tiếng Việt Trần Thị Kim Dung Chẩn đoán số bệnh ký sinh trùng phương pháp huyết miễn dịch men Chuyên ngành Ký Sinh Trùng học Luận án Tiến sĩ khoa học Y Dược Trường đại học Y Dược TP HCM, 1995 Trần Thị Kim Dung, Trần Vinh Hiển, Phan Anh Tuấn Chẩn đoán bệnh sán lớn gan Fasciola gigantica phương pháp huyết miễn dịch ELISA huỳnh quang Tạp chí Y học Đại học Y Dược TP HCM Cơng trình nghiên cứu khoa học, trang 201-204, 1994 Trần Vinh Hiển, Trần Thị Kim Dung, Nguyễn Hữu Chí, Phan Hữu Danh, Phạm Thị Hạnh Bệnh sán lớn gan Fasciola sp người Việt Nam Tạp chí Y học Đại học Y Dược TP HCM Số đặc biệt chuyên đề Ký Sinh Trùng Phụ tập 5, số 1, trang 75-78, 2001 Phan Địch Lân Bệnh sán gan trâu bị Fasciola gigantica phía Bắc Việt Nam Luận án Phó tiến sĩ thú y H Bộ Nơng Nghiệp, 1980 Phần tiếng nƣớc ngồi A.Y SHEHAB et al, 1999 Serogiagnosis and assessment of antigens in the sera of patients with fascioliasis by IELISA.Tropical Medicine and International Health Volume 4, N010; pp 686 – 690 Medical Research Institute, University of Alexandria, Egypt B GệNEỗ H O SARIMEHMETOĞLU M KARA F KIRCALI, 2003 Comparison of Crude and Excretory/Secretory Antigens for the Diagnosis of Fasciola hepatica in Sheep by Western Blotting Turk J Vet Anim Sci 28 (2004) 943-949, Turkey 39 Bradford, M.M (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding A ral Biochem 72: 248-254 Peter R.Collins, Colin M Stack et al, 2004 Cathepsin L1, the Major Protease Involved in Live Fluke (Fasciola hepatica) Virulence The Journal of Biological Chemistry Vol 279, No 17, Issue of April 23, pp 17038-17046, USA Cooper, Terrance G.(1977) The tools of Biochemistry John Willey and Sons, Interscience publication, United State of America pp 36-307 10 John P Dalton, Sharon J Andrew Induction of protective immunity in cattle against infection with Fasciola hepatica by vaccination with cathepsin L proteinase and with Hemoglobin Infection and Immunity, Dec 1996, pp 50665074 United Kingdom 11 ESPINO et al Dynamics of Antigenemia and Coproantigens during a human Fasciola hepatica Outbreak Journal of Clinical Microbiology, Sept 1998, pp 2723 – 2726 Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kouri”, Ciudad de La Habana, Cuba 12 ESPINO et al, 1990 Detection of Circulating Excretory Secretory Antigens in Human Fascioliasis by Sandwich Enzyme- Linked Immunosorbent Assay Jounal of clinical microbiology, pp 2637-2640 Instituto Medicina Tropical “Pedor Kouri” Apartado 601 Zona 13, Havana, Cuba 13 Louis Nguyen Anh Van (1985) Essai d’enseignement des cycles parasitaires par le graphisme Thèse pour le Doctorat en Médecine Université de Paris Sud p28 14 Ortiz, P.L Claxton J R Clarkson, M.J Mc Garry, J Williams, D.J L The specificity of antibody responses in cattle naturally exposed to Fasciola hepatica Vet Parasit 2000:93:121:124 40 Internet 15 http://www.med.cmu.ac.th/dept/parasite/trematode/Fga.html 16 http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/gellab2.html 17 http://www.med-chem.com/ 18 http://sbio.uct.ac.za/Sbio/documentation/Bradford%20assay.html 41 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trƣờng nuôi sán gan Fasciola gigantica để thu đƣợc kháng nguyên tiết Môi trường RPMI 1640 1X (104,3 g/10 lít) bổ sung 2g NaHCO3/1lít Thành phần Đơn vị (mg/l) Ca(NO3)2.4H2O 100,00 KCl 400,00 MgSO4 (anhydrid) 48,84 NaCl 6000,00 Na2HPO4(anhydrid) 800,00 D-Glucose 2000,00 Glutathione 1,00 Rouge de Phénol 5,00 L-Arginine HCl 241,86 L-Asparagine 50,00 Acide L-Aspartique 20,00 L-Cystine 2HCl 65,15 Acide L-Glutamique 20,00 L-Glutamine 300,00 Glycine 10,00 L-Histidine 15,00 L-Hydroxyproline 20,00 L-Isoleucine 50,00 L-Leucine 50,00 L-Lysine HCl 40,00 L-Méthionine 15,00 L-Phénylalanine 15,00 42 L-Proline 20,00 L-Sérine 30,00 L-Thréonine 20,00 L-Tryptophane 5,00 L-Tyrosine 20,00 L-Valine 20,00 D-Biotine 0,20 Pantothénate de Calcium D 0,25 Chlorure de Choline 3,00 Acide Folique 1,00 i-Inositol 35,00 Nicotinamide 1,00 Acid Para-aminobenzoique 1,00 Pyridoxal HCl 1,00 Riboflavine 0,20 Thiamine HCl 1,00 Vitamine B12 0,005 (Theo Catalogue 1996-97 Culture Cellulaire – Hãng Gibco BRL Code 51800 – 035 Produced in U K by life Technologies LTD, P O Box 35 PAISLEY) Pha 500 ml môi trường RPMI 1640 1X (m = 5,215g + 1g NaHCO3) Chỉnh pH = 7,3 HCl đặc Bổ sung 300 µl Penicillin 1000000U (nồng độ 200 000 U / ml) Thêm vào 300 µl Streptomycin 1000000 µg (nồng độ 200 mg / ml) Cho dung dịch qua lọc vơ trùng 0,22 µm để khử trùng Phân phối vào ống nghiệm, ống ml giữ 40C Tất thao tác thực điều kiện vơ trùng 43 Hình-Cácống nghiệm chứa mơi trƣờng RPMI 1640 dùng để ni sán bên ngồi vật chủ Phụ lục 2: Hình cột sắc ký lực để tinh chế kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tiết sán gan lớn 44 Phụ lục 3: Máy đo quang phổ hấp thụ Spectrophotometer U 3310 Hitachi (Japan) Phụ lục 4: Máy đọc Elisa Sanofi PR 2100, Diagnostics Pasteur 45 Phụ lục 5: Các giếng thực phản ứng ELISA để phát kháng nguyên tiết huyết bệnh nhân ... hoạt động kháng nguyên thành phần dịch tiết Xây dựng quy trình tạo kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tiết Dùng kháng thể bệnh nhân đặc hiệu với kháng nguyên tiết tạo kỹ thu? ??t chẩn đoán Khảo... Lê Trang, tiến hành thực đề tài: ? ?Thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica sử dụng làm kháng ngun chẩn đốn” để xây dựng quy trình tạo kháng thể cho mục đích chẩn đốn y học nghiên cứu chế ký sinh... KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica xác định nồng độ protein dịch tiết phương pháp Bradford, ta thu xấp xỉ 6,5 mg protein tiết/ sán/ 24 Dịch tiết sán