Đang tải... (xem toàn văn)
Phương pháp xác định trình tự ADN
•Là các phương pháp dùng để xác định trình tự sắp xếp các nucleotides trong một chuỗi hoặc 1 đoạn DNA.•Sử dụng các phương pháp :Maxam-Gilbert (1977) Sanger (1977)Xác định trình tự tự độngPhương pháp xác định trình tự ADN I.Phng phỏp Maxam-Gilbert 1.Nguyờn lýL phng phỏp phõn gii húa hc (do Allan Maxam và Walter Gilbert ở đại học Haward đã đề xuất năm1977).S dng húa cht phõn hy ADN cỏc v trớ base c hiu to ra cỏc on cú chiu di khỏc nhau 1 nucleotid. Điện di các đoạn ADN này và nhận biết vị trí của chúng nhờ đánh dấu phóng xạ. Dựa vào đó để đọc được trình tự của ADN 2. Các bước tiến hành Chuỗi ADN kép được đánh dấu phóng xạ với 32P tại đầu cuối 5 nhờ enzym polynucleotit kinase và 32P - dATPDùng dimethyl sunphoxit đun nóng đến 90 0C để tách ADN thành 2 sợi đơn và điện di tách dời từng loại sơi đơn Các sợi đơn được chia thành 4 mẫu riêng rẽ và được xử lý với các hoá chất đặc hiệu để phá hỏng 1 hay 2 trong 4 bazơ nitơ: Dimethylsun phat phá hỏng G Glicosidic phá hỏng A+G Hydrazin phá hỏng C+T hydrazin + NaCl phá hỏng C I.Phng phỏp Maxam-Gilbert Phng phỏp Maxam-GilbertXử lý tiếp các mẫu này với piperidin để bẻ gẫy ADN tại vị trí bazơ nitơ đã bị phá hỏngiện di riêng rẽ 4 mẫu trên cùng 1 gel điện di, làm phim phóng xạ tự ghi v đọc vị trí của các nucleotit lần lượt trên 4 mẫu từ cực dương của gel lên cực âm theo nguyên tắc: đoạn ADN càng ngắn càng dịch chuyển xa so với điểm xuất phát ban đầu trên bản điện di đồ. Ví dụ•Đoạn mạch đơn ADN đánh dấu đầu 5‘ ở nucleotid A có trình tự: P32 TAGTCGCAGT3‘-Xử lý G: tạo 3 đoạn-Xử lý A+G: tạo 5 đoạn-Xử lý T+C: tạo 5 đoạn-Xử lý C: tạo 2 đoạn II.Phng phỏp Sanger 1.Nguyờn lýPhng phỏp enzym (do Frederick Sanger đề xuất 1977 ) Da vo hot ng ca enzym ADN polymerase trong quỏ trỡnh tng hp ADN. Enzym ny xỳc tỏc gn cỏc nucleotid vo mch n ang tng hp v trớ 3'OH, khi gp nucleotid khụng cú nhúm 3'OH, phn ng tng hp b dng li v to ra cỏc on AND chờnh lch nhau 1 nucleotidĐiện di các đoạn ADN này và nhận biết vị trí của chúng nhờ đánh dấu phóng xạ. Dựa vào đó để đọc được trình tự của ADN Nhõn t kt thỳc c hiu c s dng l cỏc dideoxynucleotit (phng phỏp dideoxynucleotid) [...]...Phng phỏp Sanger 2.Cỏch tin hnh: Cắt ADN bằng enzym cắt giới hạn, tách các đoạn ADN đã cắt thành sợi đơn và nhân dòng ( cloning ) chúng ( lượng ADN > àg ) bằng vetơ mạch đơn: phage M13 để tạo đủ ADN làm nguyên liệu nghiên cứu Tiến hành đồng thời 4 phản ứng tổng hợp riêng rẽ cho đoạn ADN nghiên cứu bằng phương pháp tổng hợp nhờ enzym AND-polymerase và trong mỗi phản ứng có... trỡnh t bng phng phỏp t ng Nguyên tắc chung của giải trình tự gen tự động là dựa theo cơ sở của phương pháp Sanger Nhưng : Quá trình tổng hợp AND thực hiện nhờ kỳ thuật PCR Mỗi ddNTP được đánh dấu bằng một loại fluochrom có màu khác nhau nên có thể tiến hành cả 4 phản ứng tổng hợp trong cùng một ống nghiệm và điện di trên 1 băng Đọc kết quả điện di tự động nhờ tia laze và phần mềm xử lý số liệu Figures... được đánh dấu phóng xạ 32P hay 35S Chạy điện di để tách các đoạn ADN đã tổng hợp được trong mỗi phản ứng Điện di riêng rẽ kết quả của 4 phản ứng trên cùng 1 bản gel Làm phim phóng xạ tự ghi cho bản gel điện di và đọc trình tự của nucleotit trên điện di đồ lần lượt trên cả 4 mẫu từ cực âm bản gel lên cực dương theo nguyên tắc: đoạn ADN càng ngắn càng dịch chuyển xa so với điểm xuất phát ban đầu trên . phương pháp :Maxam-Gilbert (1977) Sanger (1977) Xác định trình tự tự độngPhương pháp xác định trình tự ADN I.Phng phỏp Maxam-Gilbert 1.Nguyờn lýL phng. •Là các phương pháp dùng để xác định trình tự sắp xếp các nucleotides trong một chuỗi hoặc 1 đoạn DNA.•Sử dụng các phương pháp :Maxam-Gilbert