Đang tải... (xem toàn văn)
Định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 bằng kỹ thuật Real-time PCR
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 Mở đầu Theo thống kê Tổ chức Nghiên cứu ung thư Thế giới (International Agency for Research on Cancer_ IARC), ung thư phổi nguyên nhân gây tử vong hàng đầu số bệnh ung thư Tổng số người chết ung thư phổi hàng năm cao tổng số người chết ung thư vú, ung thư ruột ung thư tuyến giáp, đứng thứ hai tổng số tử vong bệnh sau bệnh tim mạch Các thống kê từ hiệp hội Ung thư quốc gia Việt Nam đưa cảnh báo tương tự, số bệnh nhân ung thư phổi gia tăng liên tục năm gần Phần lớn bệnh nhân ung thư phát giai đoạn cuối không chữa trị được, đa số bệnh nhân bị tử vong Vì nhiều lí như: hút thuốc lá, môi trường sống bị ô nhiễm, thực phẩm khơng an tồn… nên bệnh nguy hiểm ngày trở nên phổ biến Mặc dù bệnh nguy hiểm bệnh nhân phát sớm điều trị theo phác đồ thích hợp người bệnh có hội cứu sống, chí khỏi bệnh Ngồi phương pháp chẩn đoán ung thư truyền thống như: chụp hình phổi X_quang, chụp CT Scan phổi….các nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm cách chẩn đốn nhanh xác bệnh ung thư Sự phát triển vũ bão ngành sinh học phân tử mở hướng nghiên cứu Sinh_Y_Dược học Việc tìm thị sinh học giúp cho bác sĩ chẩn đoán phát bệnh cách nhanh chóng, có độ xác cao Các thị sinh học có liên quan đến chẩn đoán bệnh ung thư quan tâm Trong đo, Cyfra21-1 thị có độ nhạy tương đối cao ung thư phổi nghiên cứu Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 Do chúng tơi tiến hành thực đề tài: “ Định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 kỹ thuật Real-time PCR” Để từ nghiên cứu tạo Kít định lượng để chẩn đốn Ung thư phổi cách nhanh chóng, có độ xác cao Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Ung thư phổi 1.1.1 Khái niệm chung ung thư phổi Ung thư phổi gọi ung thư phế quản – phổi nguyên phát, gây tế bào ung thư phát triển từ biểu mô phế quản (hiếm phát triển từ biểu mô phế nang) Ung thư phổi phát thường khối rắn có đường kính từ 2- 10cm, chí cịn lớn Mặt ngồi khối u thường gồ ghề, nhiều múi, nhăn nhúm Mặt cắt khối u thường đồng nhất, hay có mầu trắng tổ chức não Hình 1: Ung thư phổi 1.1.2 Phân loại ung thư phổi Tùy thuộc vào hình dạng quan sát kính hiển vi mà người ta phân chia ung thư phổi thành hai loại chính: ung thư phổi tế bào nhỏ ung thư phổi tế bào nhỏ Mỗi loại ung thư phát triển theo cách khác điều trị theo phác đồ điều trị khác - Ung thư phổi tế bào nhỏ (small_cell carcinoma) chiếm khoảng 20% số bệnh ung thư phổi, loại thường phát triển phế quản – phổi (không Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 ngoại vi phổi) Mặc dù tế bào ung thư tế bào nhỏ, chúng phát triển nhanh tạo thành khối u lớn, có khả lan xa trước có triệu chứng lâm sàng Nhiều trường hợp phát mổ nữa, tử vong nhanh Đây loại ung thư có quan hệ mật thiết với thuốc loại ung thư ác tính nhất.[3] - Ung thư phổi tế bào nhỏ (non small _cell carcinoma) chiếm khoảng 80% số bệnh ung thư phổi, ung thư phổi tế bào nhỏ thường gặp ung thư phổi tế bào nhỏ Nó thường phát triển lan chậm ung thư phổi tế bào nhỏ Có ba loại ung thư phổi khơng phải tế bào nhỏ chủ yếu, chúng đặt tên theo loại tế bào mà từ ung thư phát triển.[3] + Ung thư tế bào tuyến (adenocarcinoma, AC): xuất phát từ tế bào tuyến nhầy thành phế quản, chiếm tỷ lệ khoảng 30-45% loại ung thư phổi Đây loại ung thư phổi phổ biến phụ nữ người không hút thuốc.[3] + Ung thư tế bào sừng (squamous_cell carcinoma; SCC): hay xuất phế quản lớn làm chít hẹp lịng phế quản.Đây loại ung thư phổi phổ biến nam giới, chiếm tỷ lệ khoảng 30-35% loại ung thư phổi.[3] + Ung thư tế bào lớn (large_cell carcinoma; LCC): hình thành gần bề mặt phổi, chiếm tỷ lệ khoảng 10-15% loại ung thư phổi.[3] 1.1.3 Triệu chứng bệnh ung thư phổi Những người mắc bệnh ung thư phổi thường có triệu chứng sau: - Ho không khỏi ngày nặng - Thường xuyên thấy đau ngực - Ho máu - Khó thở, ngạt mũi, khản giọng - Phù nề vùng mặt cổ - Mệt mỏi Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 - Mất cảm giác ngon miệng, sút cân - Thường xuyên bị viêm phổi viêm phế quản 1.1.4 Chẩn đoán bệnh ung thư phổi Khi người bệnh bị nghi ngờ mắc ung thư phổi, bác sĩ xem xét tiền sử người bệnh, tiền sử hút thuốc, tiếp xúc với chất môi trường tự nhiên môi trường lao động, yếu tố di truyền… Sau đó, bác sĩ cho chụp X_Quang lồng ngực, xét nghiệm tế bào đờm (quan sát kính hiển vi tế bào lấy từ mẫu dịch nhầy phổi ho), xét nghiệm đơn giản mà có ích cho việc phát bệnh ung thư phổi Ngoài ra, sử dụng kĩ thuật Sinh thiết (lấy mẫu mô nhỏ phổi để quan sát kính hiển vi Qua cho biết người có bị ung thử phổi hay khơng) Một số thủ thuật dùng để lấy mẫu bệnh phẩm: nội soi phế quản, chọc hút kim, chọc dịch màng phổi, mở lồng ngực… Hiện nay, cịn có thêm xét nghiệm mẫu máu, sử dụng thị Cyfra 21-1 để chẩn đoán bệnh.[1] 1.1.5 Các nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thư phổi Các cơng trình nghiên cứu chưa cho biết xác nguyên nhân gây ung thư phổi Tuy vậy, người ta xác định yếu tố gắn liền với trình phát sinh bệnh như: hút thuốc lá, tiếp xúc nhiều với hóa chất độc hại amiang, niken… 1.1.5.1 Nghiện hút thuốc lá, thuốc lào Trong khói thuốc có chứa chất Hydrocacbua thơm nhiều vịng, số độc chất 3,4 benzopyrene với hàm lượng 0.5 µg/1 điếu thuốc (P.Freour, 1979) Chất đóng vai trị quan trọng phát sinh ung thư phổi Ngồi khói thuốc cịn chứa chất gây ung thư khác nitrosamine, benzanthracene Các chất nguyên nhân gây bệnh Ung thư phổi Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 Trong khóa họp vào tháng 11 năm 1982 Geneve, chuyên gia ung thư phổi thống kết luận 80-90% nguyên nhân dẫn đến ung thư phổi hút thuốc Tại Việt Nam, theo thống kê 389 bệnh nhân mắc ung thư phổi phẫu thuật thì: 70% số bệnh nhân có hút thuốc lào, 52% hút thuốc lá, 10,49% hút thuốc thuốc lào Những người hút loại khác người hít phải khói thuốc (hút thuốc thụ động) có nguy tương tự Ngừng hút thuốc làm giảm đáng kể khả mắc ung thư phổi 1.1.5.2 Radon Radon chất khí phóng xạ khơng màu, khơng mùi khơng nhìn thấy mắt thường Trong tự nhiên radon có sỏi đá Nó làm tổn hại tới phổi từ dẫn đến ung thư phổi Những người làm việc hầm mỏ tiếp xúc với khí radon Ở số vùng Mỹ, người ta cịn tìm thấy khí radon ngơi nhà 1.1.5.3 Amiang Amiang tên gọi nhóm chất khoáng, chúng tồn tự nhiên dạng sợi sử dụng số nghành công nghiệp Amiang có hai nhóm nhóm amphibole nhóm serpentine Nhóm amphibole hấp thụ qua đường hơ hấp lưu lại phổi khó bị đào thải ngồi Các sợi thuộc nhóm amphibole nguyên nhân gây bệnh ung thư phổi, u trung biểu mô 1.1.5.4 Nghề nghiệp Các thống kê bệnh học cho thấy, chất phóng xạ đóng vai trị quan trọng phát sinh bệnh ung thư Những người thường xuyên tiếp xúc với chất phóng xạ, niken, cromat, amian chất sinh chưng cất hắc ín thường dễ bị ung thư Các chất nguyên nhân dẫn đến Ung thư phổi người không hút thuốc (chiếm khoảng 15-20%) Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 Nghiên cứu Doll (1958) cho thấy: công nhân làm việc công nghiệp niken bị chết Ung thư phổi 26%, cao lần so với công nhân làm việc ngành công nghiệp khác 1.1.5.5 Môi trường Các nhà nghiên cứu tìm mối liên kết bệnh ung thư phổi phơi nhiễm với số chất gây nhiễm mơi trường khơng khí định (ví dụ: sản phẩm phụ sinh trình đốt dầu Diezen nguyên liệu hóa thạch) Tuy nhiên, mối quan hệ chưa xác định cách rõ ràng tiếp tục nghiên cứu Nhiều thống kê cho thấy, tỉ lệ mắc ung thư phổi thành phố công nghiệp, đặc biệt thành phố có ngành cơng nghiệp hóa chất cao hẳn so với vùng nông thôn Trong bầu khí thành phố có chứa nhiều chất độc hại benzopyren… Các chất kích thích gây phản ứng với lớp niêm mạc đường hơ hấp làm cho q trình tiết chất nhầy bị chậm lại, sau biểu mơ bị bong ra, lại tái sinh Những chu kì liên tiếp diễn kích thích tăng sản tế bào đáy, dị sản tế bào biểu mơ đẫn đến hình thành phát triển tế bào ung thư 1.1.5.6 Các yếu tố khác Ngoài nguyên nhân trên, nhà khoa học phát thấy virus nguyên nhân gây Ung thư phổi khỉ Điều đặt câu hỏi: liệu ung thư phổi có phải virus gây không? Đây ẩn số lớn nhà khoa học Tiền sử thân người bệnh nguyên nhân gây ung thư phổi Một người mắc ung thư phổi lần có nguy mắc ung thư phổi lần hai cao so với người chưa mắc bệnh ung thư phổi.Bỏ hút thuốc sau chẩn đoán ung thư phổi ngăn ngừa nguy bị ung thư phổi lần hai Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 Các nhà nghiên cứu tiếp tục tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh ung thư phổi tìm kiếm cách thức để phồng chống bệnh Chúng ta biết, cách tốt để phòng chống bệnh ung thư phổi bỏ hút thuốc lá, bỏ hút thuốc sớm tốt Thậm chí, bạn hút thuốc thời gian dài việc bỏ hút thuốc khơng muộn 1.2 Kháng nguyên Cyfra 21-1 1.2.1 Kháng nguyên 1.2.1.1 Định nghĩa Kháng nguyên định nghĩa chất tương tác với phân tử kháng thể thụ thể kháng nguyên tế bào lympho Một chất gây miễn dịch kháng nguyên thể nhận biết chất ngoại lai kích thích phản ứng miễn dịch thích ứng Để đơn giản hóa, kháng nguyên chất gây miễn dịch xem kháng nguyên.[2,3] 1.2.1.2 Bản chất hóa học kháng nguyên Về chất hóa học, kháng nguyên phân tử protein có khối lượng phân tử lớn (kể protein cộng hợp glycoprotein, lipoprotein nucleoprotein) polysaccharide (kể lipopolysaccharide) Các kháng nguyên protein polysaccharide tìm thấy bề mặt virus, tế bào vi khuẩn, nấm, đơn bào tế bào người.[3] 1.2.1.3 Nguồn gốc kháng nguyên 1.2.1.3.1 Kháng nguyên ngoại sinh Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 Kháng nguyên ngoại sinh kháng nguyên xâm nhập vào thể từ bên ngồi do: hít, ăn, tiêm Bằng trình nhập nội bào thực bào, kháng nguyên đưa vào tế bào trình diện kháng ngun (ACP) xử lí thành mảnh nhỏ Sau ACP trình diện mảnh nhỏ cho tế bào Lympho T giúp đỡ (CD4+) cách dung phân tử phù hợp mô loại II bề mặt chúng Một số tế bào Lympho T đặc hiệu cho phức hợp peptide: MHC Chúng trở nên hoạt hoá bắt đầu tiết Cytokine Cytokine chất có khả hoạt hố Lympho bào T độc tế bào (CLL), tế bào Lympho B tạo kháng thể, đại thực bào tế bào khác 1.2.1.3.2 Kháng nguyên nội sinh Kháng nguyên nội sinh kháng nguyên sản xuất bên tế bào, kết q trình chuyển hố tế bào bình thường, nhiễm khuẩn nội bào hay nhiễm virus Sau mảnh kháng ngun trình diện bề mặt tế bào phức hợp phân tử phù hợp mô loại I Nếu tế bào Lympho T CD8+ độc tế bào nhận chúng, tế bào Llympho T bắt đầu tiết loại độc tố khác gây ly giải chết theo chương trình (apoptosis) tế bào bị nhiễm Để giữ tế bào độc tế bào khỏi giết nhầm tế bào vốn sản xuất protein nó, tế bào lympho T tự đáp ứng loại khỏi trình miễn dịch qua chế dung nạp trung ương (cũng biết q trình chọn lọc âm tính xảy tuyến ức) Chỉ Lympho bào T độc tế bào khơng phản ứng với peptide (peptide trình diện tuyến ức qua phân tử MHC loại I) phép vào máu Có ngoại lệ khơng thuộc ngoại sinh lẫn nội sinh gọi trình diện chéo 1.2.1.4 Kháng nguyên khối u Kháng nguyên khối u kháng nguyên trình diện phân tử MHC I bề mặt tế bào khối u Đôi kháng nguyên trình diện tế bào khối u khơng có tế bào thường Trong trường hợp này, chúng Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 gọi kháng nguyên đặc hiệu khối u thường kết đột biến đặc hiệu cho khối u Phổ biến hơn, kháng nguyên trình diện tế bào khối u lẫn tế bào thường, chúng gọi kháng nguyên liên hệ khối u Nếu lympho bào T độc bào nhận kháng nguyên này, chúng tiêu diệt tế bào khối u trước tế bào khối u tăng sinh di Kháng nguyên khối u có bề mặt khối u dạng thụ thể bị đột biến Trong trường hợp chúng bị nhận diện tế bào B 1.2.1.5 Các loại kháng nguyên -Miễn dịch nguyên: kháng nguyên loại kích thích đáp ứng miễn dịch đưa vào thể Miễn dịch luôn đại phân tử (protein, polysaccharide) Khả kích thích đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào tính lạ vật chủ, kích thước phân tử, thành phần hố học tính khơng đồng (vd: phân tử protein chứa nhiều loại amino axit khác nhau) -Dung nạp nguyên: kháng ngun loại kích thích tình trạng khơng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu hình dạng phân tử Khi thay đổi hình dạng, trở thành miễn dịch nguyên -Dị ứng nguyên: chất gây phản ứng dị ứng Chúng xâm nhập vào thể qua nhiều đường như: ăn, hít, tiêm tiếp xúc với da Tế bào trình diện với kháng nguyên chúng qua phân tử phù hợp mơ Các tế bào miễn dịch khác hoạt hố tuỳ thuộc vào kháng ngun trình diện loại phân tử phù hợp mô 1.2.2 Kháng nguyên Cyfra 21-1 Trên giới có nhiều thị sinh học liên quan đến ung thư phổi, nhà khoa học quan tâm đến thị mới, có độ nhạy cao với ung thư phổi Cyfra 21-1 nằm nhóm thị Cytokeratin, cấu trúc khung tế bào Viện Đại học Mở Hà Nội 10 Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 Tuy nhiên, dựa vào kết ELISA biết kháng nguyên Cyfra 21-1 có tồn mẫu hay khơng, so sánh mẫu có nồng độ kháng ngun Cyfra 21-1 nhiều Chính vậy, để xác định cách xác nồng độ kháng nguyên Cyfra mẫu, sử dụng phương pháp Real-time PCR 3.4 Kết Real-time PCR 3.4.1 Đường chuẩn nồng độ Để tiến hành phân tích định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 mẫu phân tích, cần xây dựng đường chuẩn nồng độ Probe No115 hãng Roche sử dụng để thực Real-time PCR Cụ thể, sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn mã hóa scFv kháng thể đặc hiệu Cyfra 21-1 probe No115 (Trình tự mồi Probe No155 thiết kế dựa phần mềm thiết kế Primer Probe) Trình tự probe No 115: gacccaga trình tự mồi là: CyfprobF:5'-ggcggtagtgcacttgaga-3' Viện Đại học Mở Hà Nội 33 Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 CyfprobR:5'-aagggtgacaggtgaggaga-3’ Đoạn mồi sử dụng để khuếch đại DNA mã hóa cho scFv đặc hiệu kháng nguyên Cyfra 21-1được gắn vector pHEN2 Mẫu đối chứng âm tính khơng chứa DNA khn thành phần phản ứng Hình 14: Sơ đồ mồi, Probe đoạn DNA khuếch đại phản ứng định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 Hình 15: Đường chuẩn nồng độ Cyfra 21-1 Theo lý thuyết, chu kỳ ngưỡng phản ứng xác định chủ yếu lượng khuôn mẫu diện lúc phản ứng khuếch đại bắt đầu Chính vậy, Viện Đại học Mở Hà Nội 34 Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 lượng ban đầu mẫu lớn sau vài chu kỳ, sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ để phát tín hiệu huỳnh quang cao tín hiệu ban đầu Như vậy, phản ứng xảy sớm hay có chu kỳ ngưỡng thấp Ngược lại, lượng mẫu ban đầu thấp, phải cần nhiều chu kỳ để phát tín hiệu huỳnh quang cao tín hiệu Do đó, phản ứng trễ hay có chu kỳ ngưỡng cao Kết cho thấy tương quan tín hiệu huỳnh quang nhận Real-time PCR với lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 sử dụng Kết cho thấy, nồng độ kháng nguyên mẫu số ( 2.106) cao nên có tín hiệu huỳnh quang sớm với Cp= 19,36 Các nồng độ giảm dần mẫu có tín hiệu huỳnh quang muộn mấu số (2.103) với Cp= 31,46; mấu đối chứng khơng có tín hiệu huỳnh quang Điều rằng, số lượng khn DNA lớn lượng sản phẩm gắn với chất phát quang nhiều, tín hiệu huỳnh quang đạt ngưỡng sớm Đường cong đặc trưng cho khuếch đại DNA với nồng độ kháng nguyên Cyfra 21-1 pha loãng theo dãy pha lỗng 10 lần thể hình 15 Dãy pha loãng tạo đường đồ thị khuếch đại với khoảng cách Qua kết chu kỳ ngưỡng Cp với nồng độ khác biết trước, dựng đường hồi quy tuyến tính tín hiệu nhận logarit nồng độ kháng nguyên Cyfra 21-1 ban đầu Với kết thu được, chúng tơi khảng định primer, probe thiết kế tốt điều kiện tối ưu hóa cho phản ứng phù hợp Mối liên hệ nồng độ Cyfra 21-1 cố định giếng thử giá trị Cp thí nghiệm xây dựng đường chuẩn thể bảng Viện Đại học Mở Hà Nội 35 Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Mẫu Nồng độ Kết Tỉ lệ tương kháng OD quan PCR nguyên (ng/ nồng độ ml) 19,36 23,31 27,71 31,46 _ Nồng độ DNA theo Real-time 10-4 10-5 10-6 10-7 H2O Cp Lớp KSCNSH 06_01 ELISA DNA KN 2.106 2.105 2.104 2.103 _ 0,815 0,766 0,731 0,628 _ 0,21.10-3 0,18.10-3 0,21.10-3 0,20.10-3 _ 9,56.109 1,09.109 9,61.107 1,00.107 _ Bảng 3: Mối tương quan nồng độ Cyfra 21-1 với giá trị Cp kết ELISA Bảng phân tích cho thấy tương quan chặt chẽ lượng DNA xác định theo Real-time PCR với nồng độ kháng nguyên cố định giếng khay thử Từ bảng ta thấy, nồng độ kháng nguyên tỷ lệ thuận với DNA Điều phù hợp với nhận định đưa ban đầu Theo tính tốn nồng độ tương quan trung bình nồng độ kháng nguyên/nồng độ DNA 0,20.10-3 với độ lệch chuẩn 1,41.10-5 Ở đây, sử dụng mẫu đối chứng H2O vì: H2O nước khử tinh khiết nên thành phần khơng có DNA Chính vậy, đem đo ELISA không cho giá trị OD khơng có bắt cặp giưa kháng ngun DNA đích Và q trình chạy Real-time PCR khơng cho tín hiệu huỳnh quang 3.4.2 Kết định lượng Cyfra 21-1 mẫu huyết bệnh viện Lao_Phổi trung ương cung cấp Viện Đại học Mở Hà Nội 36 Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 Dựa vào đường chuẩn xây dựng phân tích so sánh với kết ELISA mẫu kháng nguyên Cyfra 21-1 biết trước nồng độ, tiến hành định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 mẫu huyết bệnh viện Lao_Phổi trung ương cung cấp Mẫu huyết cần phân tích, xác định hàm lượng Cyfra 21-1 pha loãng 100 lần PBS 1X cố định khay thử Kết thể hình 16 bảng Hình 16: Kết định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 mẫu huyết bệnh viện Lao_ Phổi TW cung cấp Mẫu HT1 Viện Đại học Mở Hà Nội Giá trị Cp Nồng độ DNA 29,72 1,11.10 37 Nồng độ Cyfra 21-1 (ng/ml) 83ng/ml Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng HT2 HT3 HT4 HT5 H2O Lớp KSCNSH 06_01 1,24.105 1,28.105 3,07.104 _ _ 29,61 29,58 30,97 _ _ 92,9ng/ml 95,9ng/ml 22.9ng/ml _ _ Bảng 4: Kết định lượng Cyfra 21-1 mẫu phân tích Nghiên cứu P.P.Mumbarkkar cộng số nghiên cứu nhà khoa học khác cho thấy, cá thể khỏe mạnh, nồng độ Cyfra 21-1 lưu thông thấp (thấp 3,3ng/ml) Trong đó, với bệnh nhân xác định ung thư phổi giai đoạn khác có nồng độ Cyfra 21-1 cao gấp nhiều lần Ngoài ra, nghiên cứu Bram Wieskopf cộng (1995) hay nghiên cứu Shi-Jian Ding cộng (2004) chứng minh có liên quan chặt chẽ hàm lượng Cyfra 21-1 với thời gian phát triển di khối u Các mẫu huyết bệnh viện Lao_ Phổi trung ương cung cấp có mẫu HT1, HT2, HT3 chẩn đoán bị ung thư phổi, mẫu HT4 chẩn đoán tràn dịch màng phổi Kết cho thấy mẫu có tín hiệu vượt ngưỡng chu kỳ tương đối thấp Trong đó, mẫu HT3 có tín hiệu vượt ngưỡng sớm nhất, Cp = 29,58 với nồng độ Cyfra 21-1 tương ứng là: 95,9ng/ml Tương tự vậy, mẫu HT1 có tín hiệu Cp = 29,72 với nồng độ Cyfra 21-1 tương ứng là: 83ng/ml; mẫu HT2 có tín hiệu Cp =29,61 với nồng độ Cyfra 21-1 tương ứng là: 92,9ng/ml; mẫu HT4 có tín hiệu Cp = 30,97 với nồng độ Cyfra 21-1 tương ứng là: 22,9ng/ml; mẫu HT5 mẫu đối chứng khơng thấy có tín hiệu huỳnh quang So sánh kết lâm sàng kết Real-time PCR chúng tơi nhận thấy có tương đồng rõ rệt Các mẫu HT1,HT2,HT3 sau chạy Real-time PCR cho giá trị nồng độ Cyfra 21-1 cao mẫu Viện Đại học Mở Hà Nội 38 Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 chẩn đoán mắc bệnh ung thư phổi Từ đây, bước đầu chúng tơi khẳng định việc định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 kỹ thuật Real-time PCR để chẩn đoán ung thư phổi cho kết hồn tồn xác Tuy nhiên, mẫu huyết cho giá trị nồng độ Cyfra 21-1 cao nhiều so với nồng độ Cyfra 21-1 cho phép lưu thông máu theo nghiên cứu P.P.Mumbarkkar (3,3ng/ml) Chính vậy, kết có ý nghĩa khẳng định xác phương pháp Riêng với mẫu HT4 có nồng độ Cyfra 21-1 thấp mẫu trên, lại cao ngưỡng theo nghiên cứu P.P.Mumbarkar (3,3ng/ml) Theo chẩn đoán lâm sàng, mẫu HT4 chẩn đoán tràn dịch màng phổi Nhưng theo kết chạy Real-time PCR mẫu HT4 có nồng độ Cyfra 21-1 = 22,9ng/ml cao ngưỡng theo nghiên cứu (3,3ng/ml) nhiều lần Do đó, bước đầu khẳng định mẫu HT4 có biểu bệnh ung thư phổi Tuy nhiên, để chẩn đốn cách xác cần phải tiến hành số xét nghiệm cần thiết khác để có kết xác Tràn dịch màng phổi biểu bệnh lý tổn thương phổi Khi bị tràn dịch màng phổi nghĩ tới ung thư màng phổi nguyên nhân thông thường khác vi khuẩn gây tổn thương phổi Do vậy, đưa đề xuất cần phải theo dõi thường xuyên hàm lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 bệnh nhân có hàm lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 lưu thông máu cao bất thường, chẩn đốn tổn thương phổi mà chẩn đốn hình ảnh chưa phát khối u Có thể tổn thương ban đầu phổi dẫn đến nguy ung thư phổi cao so với người có phổi khỏe mạnh Từ kết thu trên, nhận thấy việc ứng dụng phương pháp định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 kỹ thuật Real-time PCR cho kết với độ xác cao, thời gian chẩn đoán ngắn Đặc biệt hơn, chúng Viện Đại học Mở Hà Nội 39 Khoa CNSH Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01 ta chẩn đốn trường hợp có biểu bệnh ung thư phổi giai đoạn sớm, để từ đưa phác đồ điều trị hợp lý 3.4.3 Kết định lượng Cyfra 21-1 mẫu huyết bệnh viện Bạch Mai cung cấp Ngoài mẫu huyết bệnh viện Lao_Phổi trung ương cung cấp, chúng tơi cịn tiến hành chạy Real-time PCR với mẫu huyết kháng nguyên bệnh viện Bạch Mai cung cấp Các mẫu kháng nguyên huyết cần phân tích pha lỗng 100 lần trước chạy Real-time PCR Kết xác định hàm lượng Cyfra 21-1 mẫu huyết kháng nguyên trình bày bảng hình 17: Viện Đại học Mở Hà Nội 40 Khoa CNSH Hình 17: Kết định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 mẫu huyết bệnh viện Bạch Mai cung cấp Đinh Thị Thu Hằng Mẫu HT1 HT2 HT3 HT4 HT5 HT6 HT7 Nơi cung cấp BV Lao_Phổi nt nt nt BV Bạch Mai nt nt Viện Đại học Mở Hà Nội Lớp KSCNSH 06_01 Giá trị Cp Nồng độ Nồng độ Cyfra 29,72 29,61 29,58 30,97 36,07 >40,00 >40,00 kháng thể 1.11.105 1.24.105 1,28.105 3,07.104 3,58.105 > 1,31.104 > 1,31.104 21-1 (ng/ml) 83 92,9 95,9 22,9 7,2 40,00 36,06 36,83 36,22 _ 1,37.105 7,37.105 1,08.105 7,03.105 3,23.105 > 1,31.104 4,36.105 > 1,31.104 3,63.105 1,96.105 3,19.105 _ 2,7 15,0 2,2 14,1 6,5
