1 CHƯƠNG III: CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT SÂU TỪ Bacillus thuringiensis 2 I. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA THUỐC TRỪ SÂU BT 1901 Bacillus thuringiensis được tiến sỹ Ishiwatari phát hiện. 1911 Berliner phát hiện trong các silo hạt ở Thuringe. 1915 Berliner quan sát thấy sự tạo thành tinh thể trong giai đoạn tạo bào tử. 1920 Được sử dụng lần đầu tiên làm thuốc trừ sâu. 1950 Chế phẩm chứa bào tử được thương mại hóa lần đầu tiên. 1957 Thuốc Thuricide được sản xuất từ chủng Bt var.kurstaki. Những năm 1970 Phát hiện chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao. Công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh. Có 13 chủng Bt đã được xác định. Tất cả đều chỉ diệt được côn trùng bộ cánh vẩy (Lepidoptera). 1977 Phát hiện ra Bt var.israelensis diệt ấu trùng ruồi, muỗi. 1983 Phát hiện ra Bt var.tenebrionis diệt bộ cánh cứng. 1985 Gen cry Bt được chuyển vào cây trồng để diệt sâu. 3 II. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA Bacillus thuringiensis  Trực khuẩn, kích thước 1-1,2 x 3-5 µm  Phủ tiêm mao, di chuyển được  Gram +  Sinh bào tử, kích thước 1,6 – 2 µm  Hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc  Tế bào đứng riêng hoặc xếp chuỗi  Nhiệt độ sinh trưởng 15º-45ºC  Phổ biến trong tự nhiên, cư trú trong đất, trên bề mặt cây và trên xác sâu  Tạo ra tinh thể protein trong giai đoạn tạo bào tử, kích thước 0,6 – 2 µm 4 Bào tử: hình trứng dài, kích thước 1,6 x 2 µm Tinh thể: kích thước 0,6 x 2 µm. Bản chất là protein 5 III. PHÂN LOẠI Bacillus thuringiensis Giới: Procaryotae Ngành: Firmicutes Họ: Bacillacaeae Chi: Bacillus Loài: thuringiensis Loài phụ… Bacillus thuringiensis thuộc: Khoá phân loại của Bergey (1984) 6 III. Phân loại Bacillus thuringiensis (tiếp) 1. Theo typ huyết thanh kháng tiêm mao Nguyên lí Kháng nguyên tiêm mao H kết hợp với kháng thể sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết → tạo cặn lắng trắng dưới đáy ống nghiệm. Quan sát dưới kính hiển vi thấy tế bào không di chuyển được 7 III. Phân loại Bacillus thuringiensis (tiếp) 1. Theo typ huyết thanh kháng tiêm mao (tiếp) Chuẩn bị kháng nguyên tiêm mao H Tiêm vào thỏ → thu huyết thanh miễn dịch (xác định hiệu giá) Thử phản ứng ngưng kết 8  Chuẩn bị dịch kháng tiêm mao H  Nuôi cấy VK B. thuringiensis trên môi trường bán lỏng NA: cao thịt 5g, agar 2g, nước cất 1000ml, điều chỉnh tới pH = 7,2. Thời gian nuôi 16 – 18 giờ.  Chuyển sang môi trường NB: nuôi ở chế độ lắc cho tới khi OD 650 = 0,8 – 1,0.  Bổ sung 0,5 ml formaldehyt Thu nhận dịch kháng nguyên tiêm mao H  Thu nhận huyết thanh miễn dịch  Tiêm dịch kháng nguyên tiêm mao H:  Mũi đầu tiên dưới da.  Các mũi tiếp theo tiêm ven, mỗi tuần 2 lần, liều lượng mỗi lần tăng dần (1ml, 2ml, 3ml), thời gian tiêm 3 tuần  Kiểm tra sự hình thành kháng thể:  Sau 8 ngày của lần tiêm cuối: lấy 2ml máu từ ven tai thỏ để xác định hiệu giá.  Nếu HG lớn hơn hoặc bằng 25 000 là đạt yêu cầu.  Nếu HG nhỏ hơn 25 000 thì tiếp tục tiêm thêm 2 – 3 lần nữa để nhận hiệu giá cao hơn.  Dùng 02 con thỏ cho một kháng nguyên để tránh rủi ro.  Huyết thanh được tách trong đièu kiện vô trùng và bảo quản ở 4 o C hoặc đông khô. 9  Xác định hiệu giá  Cho 1,8ml NaCl 1,15M và 200µl dịch huyết thanh miễn dịch tiêm mao vào ống nghiệm 5ml.  Pha loãng với các nồng độ giảm dần theo hệ số 2: 1:10; 1:20; 1:40; …… ; 1:2560.  Chuyển 100µl dịch ở mỗi nồng độ pha loãng này vào ống nghiệm có chứa 900µl dịch vi khuẩn B. thuringiensis, như vậy độ pha loãng lúc này là 1:100; 1:200; 1:400; … ; 1:25600. Mẫu đối chứng được thay thế 100µl dịch huyết thanh bằng 100µl dịch NaCl 1,15M.  Ủ các ống nghiệm ở 37 o C trong 2 giờ và quan sát sự ngưng kết. Hiệu giá thu được là nồng độ pha loãng cao nhất xảy ra hiện tương ngưng kết 10 Nhược điểm của phân loại theo type huyết thanh Mối liên hệ giữa type huyết thanh với phổ diệt côn trùng không nhất quán:  Có các loài cùng type huyết thanh có độc tính với côn trùng như nhau: loài phụ Kustaki và loài phụ alesti đều biểu hiện độc với côn trùng bộ cánh vẩy.  Có các loài có type huyết thanh giống nhau nhưng độc tính với côn trùng khác nhau: loài phụ morisoni (type huyết thanh H8ab) có độc tính với côn trùng bộ hai cánh và loài phụ sandiego (type huyết thanh H8ab) có độc tính với côn trùng bộ cánh cứng. Không thể thông qua type huyết thanh của một loài phụ để xác định hoạt tính diệt sâu của chúng [...]... tan của tinh thể • Ngoài ra chứa: hydratcacbon 5,6%; các nguyên tố C, N, H, O, S và 19 nguyên tố Ca, Mg, Si, Fe… • Hình dạng: đa dạng 2 Vips (Vegetative insecticidal proteins) 33 Cấu trúc của tinh thể protein Bao gồm 3 vùng: 1 Vùng 1: 1 chuỗi xoắn α kỵ nước bao quanh là 6 chuỗi xoắn α lưỡng tính khác Chứa 290 axít amin và chứa đầu N Chịu trách nhiệm tạo lỗ rò trên ruột sâu 2 Vùng 2: từ a.a 291 đến... al., 1995 40 huazhongensis HUA Dai Jingyuan et al., 1996 41 soocheon SOO Lee H.H et al., 1995 15 Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H H antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả 42 jinghongiensis JIN Li Rong Sen et al 43 guiyangiensis GUI Li Rong Sen et al 44 higo HIG Ohba et al., 1995 45 roskildiensis ROS Hinrinschen et al.(không công bố) 46 chanpaisis CHA Chanpaisaeng (không... sumiyoshiensis SUM Ohba và Aizawa 1989 3a, 3d, 3e fukuokaensis FUK Ohba và Aizawa 1989 4a, 4b sotto SOT Ishiwata 1905, Heimpel và Angus 1958 4a, 4c kenyae KEN Bonnefoi và De Barjac 1963 5a, 5b galleriae GAL Shvetsova 1959, De Barjac và Bonnefoi 1962 11 Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H H antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả 5a, 5c canadensis CAN De Barjac và Bonnefoi 1972 6... Li Rong Sen 57 pirenaica PIR Caballero et al (không công bố) 58 argentinensis ARG Campos-Dias et al.(không công bố) 59 iberica IBE Caballero et al (không công bố) 60 pingluonsis PIN Li Rong Sen 61 sylvestriensis SYL Damgaard (không công bố) 62 zhaodongensis ZHA Li Rong Sen 63 bolivia BOL Ferré-Manzanero et al.(không công bố) 17 Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H H antigen Serovar... Ohba et al., 1981 18a, 18b kumamatoensis KUM Ohba et al., 1981 18a, 18c yosso YOS Lee H.H et al., 1995 19 tochigiensis TOC Ohba et al., 1981 20a, 20b yunnanensis YUN Wan-Yu et al., 1979 20a, 20c pondicheriensis PON Rajagopalan et al (không công bố) 13 Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H H antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả 21 colmeri COL De Lucca et al., 1984 22 shandongiensis . dịch kháng nguyên tiêm mao H:  Mũi đầu tiên dưới da.  Các mũi tiếp theo tiêm ven, mỗi tuần 2 lần, liều lượng mỗi lần tăng dần (1ml, 2ml, 3ml), thời gian. tra sự hình thành kháng thể:  Sau 8 ngày của lần tiêm cuối: lấy 2ml máu từ ven tai thỏ để xác định hiệu giá.  Nếu HG lớn hơn hoặc bằng 25 000 là đạt yêu