MỤC LỤC Phần A: BỘ NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI 2 I. ĐẶC ĐIỂM BỘ NST NGƯỜI 2 II. LẬP KARYOTYPE BỘ NST NGƯỜI 3 Phần B: BỘ GEN NGƯỜI 6 I. ĐẶC ĐIỂM BỘ GEN CỦA NGƯỜI 6 II. PHÂN PHỐI CỦA EXON VÀ INTRON TRONG BỘ GEN NGƯỜI 8 Phần C. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HỌC NGƯỜI 11 I. PHƯƠNG PHÁP DI TRUYỀN TẾ BÀO 11 II. PHƯƠNG PHÁP LẬP GIA HỆ VÀ PHÂN TÍCH GIA HỆ 18 III. PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT CON SINH ĐÔI 20 IV. PHƯƠNG PHÁP DI TRUYỀN PHÂN TỬ 21 V. PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT NẾP VÂN DA 22 VI. PHƯƠNG PHÁP DI TRUYỀN QUẦN THỂ 23 VII. THĂM KHÁM LÂM SÀNG DI TRUYỀN BỆNH 24 VIII. PHƯƠNG PHÁP DI TRUYỀN HÓA SINH 24 Page 1 Phần A: BỘ NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI I. ĐẶC ĐIỂM BỘ NST NGƯỜI Ở người bình thường, mỗi tế bào lưỡng bội (2n) (diploid) mang 46 nhiễm sắc thể (NST) chia thành 23 cặp, trong đó có 22 cặp NST thường (autosome) và 1 cặp NST giới tính (sex chromosome). Tinh trùng và trứng được hình thành qua quá trình giảm phân (meiosis) mang bộ NST đơn bội (n) với 23 NST. ● Kích thước Trong bộ NST người: - NST có kích thước nhỏ nhất là NST số 21 và 22 (L= 1µm) - NST có kích thước lớn nhất là NST số 1 (L= 8µm) ● Số lượng - Trong TB sinh dưỡng có 2n= 46 NST= 23 cặp (22 cặp NST thường, 1 cặp NST giới tính). Ở nam cặp nhiễm sắc thể giới tính là XY, ở nữ là XX. - Số lượng NST phân biệt ở các tế bào: + Bộ đơn bội (n) đặc trưng cho các giao tử (tinh trùng, trứng) Page 2 + Bộ lưỡng bội (2n) đặc trưng cho TB sinh dưỡng, TB sinh dục sơ khai. Trong TB lưỡng bội NST tồn tại thành cặp NST tương đồng. II. LẬP KARYOTYPE BỘ NST NGƯỜI Karyotype đuợc lập để mô tả đặc điểm bộ NST của một cá thể dựa trên bộ NST của tế bào ở kỳ giữa (metaphase) hoặc kỳ giữa sớm (pro-metaphase) của nguyên phân. 1. Phân loại NST người Những tiêu chuẩn để xác định và phân loại từng NST người: - Kích thước (chiều dài) của NST. Chiều dài của NST giảm dần từ cặp số 1 đến cặp 22. Cặp số 23 là cặp NST giứoi tính. - Chỉ số tâm Chiều dài nhánh ngắn Tổng số chiều dài của NST p + q p Page 3 Chỉ số tâm = = p: chiều dài nhánh ngắn; q: chiêu dài nhánh dài - Chiều dài tương đối của NST: là tỉ lệ giữa chiều dài của một NST nào đó so với chiều dài tổng cộng của bộ NST đơn bội có chứa NST X, tính theo phần nghìn trên cùng một tế bào. + Nhóm tâm giữa (metacentric): Chiều dài của nhánh ngắn bằng nhánh dài (p = q) + Nhóm tâm lệch (submetacentric): Chiều dài nhánh ngắn ngắn hơn nhánh dài (p ˂ q) + Nhóm tâm đầu (acrocentric): Chiều dài của nhánh ngắn rất ngắn như không có - Sự phân bố của các band sáng tối (trong kỹ thuật nhuộm băng) - Màu sắc huỳnh quang bắt màu trên NST ( trong kỹ thuật nhuộm màu huỳnh quang) 2. Karyotype (kiểu nhân) 2.1. Giai đoạn thích hợp để lập karyotype Kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền kỳ giữa (pro- metaphase) của nguyên phân là giai đoạn NST cho hình ảnh rõ nét nhất giúp đánh giá số lượng và cấu trúc của các NST một cách dễ dàng 2.2. Loại tế bào được sử dụng Về mặt lý thuyết karyotype có thể được lập từ bất cứ loại tế bào nào có thể nguyên phân tuy nhiên trong thực tế karyotype được lập từ việc nuôi cấy 4 loại tế bào chính: - Các tế bào lympho. Page 4 - Các nguyên bào sợi thu được từ sinh thiết da. - Các tế bào nước ối thu được qua việc chọc dò nước ối vào tuần lễ thứ 13 - 14 của thai kỳ. - Các tế bào của lớp nhung mao màng đệm (chorionic villi) được lấy từ bánh nhau vào tuần lễ thứ 7-8 của thai kỳ Việc lựa chọn loại tế bào phụ thuộc vào yêu cầu chẩn đoán. Đa số trường hợp việc lập karyotype được thực hiện thông qua việc nuôi cấy tế bào lympho của máu ngoại vi. 2.3. Cách lập karyotype (hình 3) ● Các quy định quốc tế về xếp bộ nhiễm sắc thể người Tại hội nghị tổ chức ở Denver (1960), ở London (1963) và ở Chicago (1966), các nhà di truyền tế bào học đã thống nhất với nhau: 22 cặp NST thường được (46 NST) được xếp thành 7 nhóm, ký hiệu là A, B, C, D, E, F và G. Mỗi nhóm gồm các NST có kích thước gần giống nhau và dễ nhầm lẫn với nhau khi phân loại. Các NST thường được sắp xếp theo kích thước từ lớn tới nhỏ dần và được đánh số từ 1 đến 22 và cặp NST giới tính được ký hiệu là XX (người nữ) và XY (người nam) được xếp riêng ở góc dưới phải của karyotype hoặc NST X được xếp theo nhóm C và NST Y được xếp theo nhóm G. Nhóm A có 3 cặp NST có kích thước lớn nhất, gọi tên từ số 1 ñến số 3. Cặp số 1: tâm giữa, cặp số 2: tâm lệch, cặp số 3: tâm giữa. Nhóm B có 2 cặp NST số 4 và số 5. Các NST trong nhóm này có kích thước lớn và không phân biệt được về chiều dài. Chúng ñều có tâm lệch. Nhóm C có 7 cặp NST, bao gồm từ số 6 ñến số 12 là các NST có chiều dài trung bình. NST X cũng được xếp vào nhóm này. Tất cả các NST thuộc nhóm C ñều tâm lệch, khó phân biệt giữa chúng với nhau. Nhóm D có 3 cặp NST số 13, 14 và 15. Tất cả các NST thuộc nhóm này có kích thước trung bình và đều là NST tâm đầu, có vệ tinh gắn vào nhánh ngắn. Khó phân biệt giữa chúng với nhau. Nhóm E có 3 cặp NST số 16, 17 và 18, các NST này tương đối ngắn. NST số 16 có tâm giữa, còn cặp số 17 và 18 có tâm lệch. Nhóm F có 2 cặp NST số 19 và số 20. Cả hai NST này có kích thước ngắn và đều có tâm Page 5 giữa. Nhóm G có 2 cặp NST số 21 và số 22. Các NST có kích thước ngắn, đều có tâm đầu và có vệ tinh. NST Y cũng được xếp vào nhóm này. Hai chromatid của NST Y xếp song song hơn so với NST của nhóm G. NST Y không có vệ tinh. Phần B: BỘ GEN NGƯỜI I. ĐẶC ĐIỂM BỘ GEN CỦA NGƯỜI ● Khoa học đã ước tính được tổng số DNA bộ NST đơn bội của người khoảng 3 tỷ đôi base (3164,7 triệu cặp base, năm 2001). ADN của người cũng như ADN của các Eukaryota khác bao Page 6 gồm những trình tự mã hóa (các exon) xen kẽ với những trình tự không mã hóa (intron). ● Kích thước của các gen nói chung rất biến thiên, trung bình gồm 27000 base, nhưng dao động lớn, có gen có thể lớn hơn 2 triệu đôi base (2,4 Mb gen của Dystrophin). ● Hiên nay bộ gen người khảng 30.000 đến 35000 gen, năm 2001. (20.000 đến 25.000 gen, công bố mới nhất) ● Gần như toàn bộ trình tự base giống nhau một cách chính xác ở tất cả mọi người ● Gần 50% các gen chưa biết chức năng. ► Một số điều ngoài dự kiến + Ít hơn 2% (1,1 – 1,4%) gen mã hóa cho protein. + 5% đến 8% trình tự được phiên mã ra RNA + Các trình tự lặp lại không mã hóa cho protein chiếm ít nhất khoảng 50% Tùy mức độ có mặt của chúng trong nhân mà các trình tự ADN được chia làm ba loại: - ADN có trình tự duy nhất: là các gen mã hóa cho các protein, chiếm khoảng 10% bộ gen. Thuật ngữ gen đã có gần một thế kỷ (Johansen, 1909) nhưng khái niệm về gen, thực thể nó như thế nào thì thật là bí ẩn, sự khám phá về nó vẫn còn tiếp tục. Các gen này sẽ được dịch ra protein bằng ARN polymerase II và gen được gọi là gen nhóm II. Các gen này chỉ mã hóa ra một loại protein. Gen ở sinh vật bậc cao bị gián đoạn bởi những vùng không mã hóa. Thường thì gen bắt đầu từ phía 5’ bằng một vùng chứa các yếu tố điều chỉnh, kế đó là vùng khởi động, cả hai vùng này gộp lại thành vùng điều chỉnh. Tiếp theo là các vùng mã hóa. Các vùng mã hóa gọi là exon bị gián cách bởi các vùng không mã hóa gọi là intron. Exon đầu tiên có thêm một vùng gọi là vùng khởi đầu dịch mã, exon cuối có thêm về phía sau một vùng kết thúc dịch mã. Hai vùng này cũng thuộc về exon. Số lượng exon trong các gen khác nhau không giống nhau. Gen cấu trúc ở người (đoạn ADN) gồm các đoạn exon xen kẽ intron. Toàn bộ các đoạn intron và exon này sẽ phiên mã thành phân tử mARN tiền thân. Phân tử mARN tiền thân này sẽ cắt loại các đoạn mRAN phiên mã từ intron và nối các đoạn mARN phiên mã từ exon để tạo thành phân tử mARN thuần thục. Số lượng các intron trong một gen cũng giống như số lượng exon của nó, không giống nhau ở các gen. Không có mối tương quan trực tiếp giữa kích thước của protein với chiều dài của gen mã hóa Page 7 ra nó, mặc dù người ta thấy các chuỗi peptid lớn tương ứng với những gen lớn. - ADN có trình tự lặp lại nhiều lần (ADN vệ tinh): chiếm khoảng 10 - 15% DNA của bộ gen, đó là các trình tự không mã hóa. Phần lớn các ADN vệ tinh khu trú tại vùng tâm của NST, tương ứng với băng C tức là phần dị nhiễm sắc cấu trúc. Các chuỗi Nu này không phân tán trong NST mà khu trú tập trung, chức năng chưa rõ. ● ADN lặp lại nhiều lần được chia thành hai loại: + Loại thứ nhất có chuỗi nucleotid ngắn (5 - 10 đôi base) xếp nối đuôi nhau, số lượng bản sao có thể tới hàng trăm triệu. Các chuỗi này tăng methyl hóa ở tế bào soma và giảm methyl hóa ở tế bào tạo giao tử, tại NST Y. + Loại thứ hai có chuỗi Nu dài hơn, từ 100 đến 200 đôi base, cũng xếp nối đuôi nhau. Ngoài hai loại có tính khu trú ở trên, còn có một loại nữa có tính phân tán gọi là vệ tinh nhỏ (minisatellite) không nằm trong vùng dị nhiễm sắc cấu trúc, loại này rất có ích cho việc lập bản đồ gen. - ADN có trình tự lặp lại trung bình: chiếm khoảng 25 - 40% DNA của bộ gen của người, chúng cũng có cấu trúc gồm các đoạn chuỗi Nu lặp lại nhưng đoạn chuỗi dài hơn, từ 100 đến 1000 đôi base, kém đồng nhất hơn nhiều so với loại lặp lại nhiều lần. Loại ADN này phân tán trong toàn bộ gen, phần lớn chúng không thấy hoạt động phiên mã. Chúng không mã hóa nhưng cũng có thể có chức năng phiên mã: chúng là gen của các rARN, tARN và một số gen khác nữa. Ngoài ba loại trình tự kể trên, trong bộ gen người còn có các gen nhẩy (transposon), đó là những đoạn ADN có khả năng tích hợp vào bất cứ đâu của bộ gen. Như vậy, dựng bản đồ gen bao gồm xác định vị trí của các gen mã hóa protein (coding genes) đồng thời xác định vị trí của các đoạn ADN không mã hóa, có tính đa hình. Hình 4.2 giới thiệu số lượng các gen mã hóa đã được phát hiện theo thời gian. Với các tiêu chuẩn lập bản đồ gen của người, người ta lập ra hai loại bản đồ: bản đồ di truyền và bản đồ hình thể. Bản đồ di truyền dựa vào kết quả phân tích tổ hợp lại bằng phương pháp thống kê gián tiếp. Bản đồ hình thể dựa vào đo đạc trực tiếp trên chiều dài của ADN. II. PHÂN PHỐI CỦA EXON VÀ INTRON TRONG BỘ GEN NGƯỜI Bộ gen của con người khoảng 26.564 gen trong hệ gen (xây dựng năm 2003) có chứa 233.785 exon và 207.344 intron. Tính trung bình, có 8,8 exon và 7,8 intron mỗi gen. Khoảng Page 8 80% của exon trên mỗi nhiễm sắc thể là dài < 200 bp. <0,01% của intron chiều dài <20 bp và <10% của intron là dài hơn 11.000 bp. Bắt đầu với 26.564 gen, lọc ra 233.785 exon và 207.344 intron từ hệ gen của con người . Kích thước nhiễm sắc thể (kích thước bộ gen) là 3017700646 basepair (bp). Sự phân bố của các gen trên nhiễm sắc thể khác nhau dựa trên CDS tính năng được hiển thị trong Bảng 1. Nhiễm sắc thể nhỏ nhất là Y với 98 gen được chú thích. Nhiễm sắc thể lớn nhất là nhiễm sắc thể số 1 với 2514 gen. Số lượng gen trên mỗi nhiễm sắc thể là nhẹ tương quan với kích thước nhiễm sắc thể ( r = 0.73). Tương quan yếu này có thể đề nghị một mối quan hệ hạn chế quan hệ nhân quả giữa số lượng gen và kích thước nhiễm sắc thể. Nó cũng cho thấy rằng các yếu tố khác ngoài số lượng gen cũng ảnh hưởng đến kích thước nhiễm sắc thể. Gen dài nhất được chú thích là DMD (dystrophin Dp140bc isoform) 2217347 bp (79 exon) được tìm thấy trên nhiễm sắc thể X [Nishio et al . 1994. Bảng 1: Exon - intron phân phối cho hệ gen của con người Chr # Tổng # gen Tổng # exon Tổng # intro n Max # exon / gen Kích thước nhiễ m sắc thể (xác định) Trun g bình # exon / gen Trun g bình chiều dài (bp) Std dev. Tổng chiều dài (bp) Ngắn nhất (bp) Dài nhất (bp) exon intron exon intron exon intron exon intron gen exon intron gen 1 2514 22345 19831 107 22682 8929 8,89 167,0 1 4736, 52 229,3 7 14268 ,19 37318 70 93929 919 2 1 78 8449 47615 8 98096 1 2 1354 12506 11152 148 23834 9289 9,24 163,9 8 5883, 23 226,8 8 17012 ,24 20508 55 65609 873 2 1 90 7572 48341 2 18975 44 3 1394 13517 12123 118 19507 3306 9,70 164,0 6 6375, 63 224,2 1 21019 ,22 22177 00 77291 760 2 1 150 6654 49781 6 99099 9 4 926 8299 7373 85 18723 9983 8,96 174,7 8 7168, 94 266,6 4 19497 ,08 14505 41 52856 617 2 53 132 6255 49470 8 14678 42 5 1186 9946 8760 90 17769 6509 8,39 189,5 0 7277, 28 332,8 6 21277 ,20 18847 77 63748 970 2 1 150 6574 37036 0 93040 1 Page 9 6 1306 11406 10100 145 16921 2327 8,73 173,6 2 5961, 61 253,5 6 18967 ,75 19803 97 60212 251 2 31 159 7152 46989 2 13775 70 7 2508 23045 20537 82 31021 0944 9,19 167,8 7 6703, 87 271,8 8 20177 ,41 38687 69 13767 7396 2 1 14 11923 45813 9 16415 67 8 908 7823 6915 86 14329 7300 8,62 171,1 6 7354, 15 258,4 3 21384 ,09 13390 52 50853 964 2 54 84 7308 45326 8 20558 33 9 1033 8941 7908 72 11779 0386 8,66 170,6 6 5351, 68 253,1 9 14121 ,26 15259 26 42321 074 2 33 105 6598 27630 6 86566 1 10 1017 10273 9256 69 13201 6990 10,10 153,7 9 6412, 91 219,9 7 20271 ,48 15798 98 59357 955 2 52 105 7812 48257 5 17271 84 11 1567 12459 10892 87 13090 8954 7,95 177,6 6 4341, 42 237,0 3 15362 ,46 22135 26 47286 795 3 1 87 6183 43754 3 14633 02 12 1299 12399 11100 89 12982 6379 9,55 158,0 7 4570, 21 192,2 3 12979 ,23 19599 45 50729 293 2 30 81 6324 32854 5 12486 78 13 426 3784 3358 83 95749 578 8,88 183,4 7 7351, 75 396,7 9 19082 ,4 69426 8 24687 182 2 37 279 11555 31764 6 11757 62 14 854 6837 6106 114 87191 216 8,01 176,2 4 5653, 70 276,6 6 19076 ,38 12049 82 33826 109 2 51 51 11304 47907 9 12107 40 15 843 8106 7263 104 81992 482 9,62 169,7 9 4660, 70 271,3 8 11542 ,05 13763 21 33850 721 2 1 168 9527 20717 8 62036 2 16 1093 9986 8893 62 79932 432 9,14 166,9 6 3661, 25 242,6 0 13092 ,99 16673 40 32559 472 2 1 75 8607 46604 9 11679 38 17 1459 13179 11720 74 79376 966 9,03 165,0 8 3193, 16 215,8 9 9875, 72 21756 98 37423 835 2 30 63 4786 28376 2 71266 8 18 367 3333 2966 75 74658 403 9,08 174,9 7905, 40 256,5 3 19377 ,24 58305 4 23447 419 3 67 225 4721 41117 5 11898 66 19 1609 12169 10560 106 55878 340 7,56 187,3 1 2032, 87 279,9 2 4741, 54 22794 36 21467 122 2 1 81 5059 17079 6 29890 9 20 775 6492 5717 80 59424 990 8,38 160,3 4 4403, 10 215,2 9 13613 ,39 10409 52 25172 558 3 54 135 3738 30371 3 11088 55 21 309 2539 2230 47 33924 367 8,22 168,5 9 5086, 89 306,5 1 16098 ,67 42805 6 11343 761 3 74 102 5916 32356 3 83362 7 22 671 5173 4502 54 34352 072 7,71 171,1 4 3924, 83 281,8 5 12999 ,39 88535 6 17669 584 3 42 38 6762 44725 2 49296 9 X 1048 8568 7520 79 15211 8949 8,18 185,3 3 7627, 85 299,6 6 23527 ,35 15879 26 57361 443 2 54 129 6102 49351 2 22173 47 Y 98 660 562 44 24649 555 6,73 173,7 4 5288, 54 255,0 5 19676 ,46 11467 0 29721 62 3 67 228 2493 40034 9 68111 9 Page 10 . CỦA EXON VÀ INTRON TRONG BỘ GEN NGƯỜI 8 Phần C. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HỌC NGƯỜI 11 I. PHƯƠNG PHÁP DI TRUYỀN TẾ BÀO 11 II. PHƯƠNG PHÁP. biết về di truyền học, sinh học và sự tiến hóa của con người. Page 12 Phần C. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HỌC NGƯỜI I. PHƯƠNG PHÁP DI TRUYỀN