ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (MPN) Định nghĩa Coliform cổ điển Coliforms: Lên men lactose sinh acid và gas - Escherichia coli - Klebsiella - Enterobacter - Citrobacter Sinh acid và gas do lên men lactose ở 37°C: 95% là coliform Sinh acid và gas ở 44°C : 90 % là E.coli Định nghĩa Coliform mới - Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae, lên men lactose sinh acid và gas (24-48h/36±2°C) - Fecal coliform : có khả năng phát triển và lên men lactose ở 44,5±2°C; bao gồm E.coli, Klebsiella, Enterobacter và Citrobacter (E.coli thủy phân tryptophan tạo thành Indol) Coliforms được coi là VSV chỉ điểm vệ sinh Enzyme based methods • Escherichia coli • Klebsiella • Enterobacter • Citrobacter • Escheri chia coli • Klebsiel la •Enterobacter • Citrobacter • Yersinia Acid production from lactose • Escher ichia coli • Klebsiella Old defnition duction from lactose Nhóm coliform bao gồm cả VSV sống tự do và trong đường ruột động vật Fecal coliform chỉ phát triển ở đường ruột động vật máu nóng •E. coli chỉ phát triển ở đường ruột động vật. Coliforms – Nơi cư trú và phát triển Khái niệm chung - Trực khuẩn Gram âm - Không sinh bào tử - Kỵ khí không bắt buộc - Lên men Lactose Vai trò - Chỉ điểm sự nhiễm phân - Đánh giá tình trạng vệ sinh nước và vệ sinh môi trường Nguyên lý phương pháp - Định lượng vi sinh vật lên men lactose có sinh khí khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh chọn lọc ở 30°C và phù hợp trong phép thử khẳng định Phạm vi áp dụng: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Tài liệu trích dẫn: TCVN 4882 : 2001 Dụng cụ - Thiết bị - Máy đồng nhất mẫu - Tủ sấy 180 – 200°C - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 30 ±1°C - Đĩa petri đường kính 90 – 100mm - Pipet có vạch đã vô trùng loại xả hết 1 và 10 ml - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1°C - Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm - pH met, chính xác tới 0,1 đơn vị pH ở 25°C - Ống Durham Môi trường - Dung dịch pepton – muối - Canh thang Tryptose Lauryl sulfat ( Môi trường tăng sinh chọn lọc) - Canh thang mật lactose lục sáng (Lactose Bile Brilliant Green Broth – môi trường thử khẳng định) Các bước tiến hành  Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu: - Sản phẩm dạng đặc: Cân 10g mẫu thử đã đồng nhất cho vào 90 ml dung dịch pepton – muối để được đậm độ pha loãng ban đầu (10 -1 ). Từ đó pha loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử nhưng phải ước lượng rằng các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính. - Sản phẩm dạng lỏng: Hút 10ml sản phẩm ban đầu cho vào bình đã có sẵn 90ml nước pepton – muối để được đậm độ pha loãng ban đầu. Từ đó pha loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử nhưng phải ước lượng rằng các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính.  Cấy mẫu và ủ ấm: - Canh thang tăng sinh nồng độ kép: Dùng pipet vô trùng hút 10 ml mẫu ban đầu (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 10ml đậm độ 10 -1 (sản phẩm dạng khác) cho vào một ống canh thang tăng sinh chọn lọc. Mỗi mẫu cấy 3 ống. Trộn đều mẫu với môi trường, mỗi ống dùng một pipet riêng. Ủ ấm ở 30°C / 24h ± 2h - Canh thang tăng sinh nồng độ đơn: Dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu ban đầu (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 1ml đậm độ pha loãng 10 -1 (sản phẩm dạng khác) cho vào một ống canh thang tăng sinh chọn lọc. Mỗi đậm độ cấy 3 ống. Tiến hành tương tự với các đậm độ pha loãng tiếp theo(nếu có). Trộn đều mẫu với môi trường, mỗi ống dùng một pipet riêng. Ủ ấm ở 30°C / 24h ± 2h. Nếu sau 24h mà thấy môi trường không đục hoặc không sinh khí thì để tiếp 24h ± 2h nữa và quan sát lại.  Phép thử khẳng định: Từ mỗi ống canh thang tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn hoặc nồng độ kép đã nuôi cấy có hiện tượng đục và sinh khí cấy chuyển sang một ống môi trường thử khẳng định, mỗi ống cấy một ăng( một vòng que cấy). Ủ ấm ở 30°C / 24h ± 2h. Quan sát lần 1 mà không đục hoặc không sinh khí thì để thêm 24h ± 2h nữa và quan sát lại Biểu thị kết quả - Lựa chọn các độ pha loãng Trường hợp 1: có ít nhất một độ pha loãng cho ba ống dương tính VD: 3 3 2 1 0 Trường hợp 2: Không có độ pha loãng nào cho ba ống dương tính VD: 2 2 1 1 0 Các trường hợp đặc biệt VD: 3 3 0 0 0 2 2 0 1 0 - Xác định chỉ số MPN - Tính số có xác suất lớn nhất Nhân chỉ số MPN với số đảo của độ pha loãng thấp nhất được chọn. Với nồng độ kép:chia chỉ số MPN cho 10. . ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (MPN) Định nghĩa Coliform cổ điển Coliforms: Lên men lactose sinh acid và gas - Escherichia. 1 0 - Xác định chỉ số MPN - Tính số có xác suất lớn nhất Nhân chỉ số MPN với số đảo của độ pha loãng thấp nhất được chọn. Với nồng độ kép:chia chỉ số MPN