Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh Bài 3: S D NG KÍNH HI N VI QUANG H C QUAN SÁT T BÀO VI SINH V T I GI I THI U CÁC LO I KÍNH HI N VI Kính hi n vi n n đen Nguyên t c: Ánh sáng thư ng chi u t dư i lên, qua rìa c a t quang n n đen, chi u h t vào xung quanh tiêu b n, nh ng tia sáng b tiêu b n làm khúc x r i đưa vào v t kính Tiêu b n đư c soi sáng r c n n đen, gi ng phịng t i có m t tia sáng m nh chi u vào, giúp th y rõ t ng h t b i khơng khí b tia sáng chi u vào Ch c năng: quan sát hình thái đ c tính c a m t s vi khu n mà kính hi n vi thư ng khó quan sát Kính hi n vi đ i pha Nguyên t c: ánh sáng thư ng b đ i pha biên đ dao đ ng b i c u trúc đ c bi t c a t quang kính, v t kính th kính Ch c năng: dùng quan sát rõ nét c u trúc nh tiên mao, l p màng Kính hi n vi huỳnh quang Nguyên t c: chùm tia t ngo i chi u vào tiêu b n nhu m màu b ng ch t huỳnh quang Trong t bào, c u trúc khác s phát quang v i màu s c khác Ch c năng: quan sát phân bi t đư c c u trúc khác t bào vi sinh v t Kính hi n vi n t Nguyên t c: chùm tia n t bư c sóng r t ng n, su t phân li r t l n nên đ phân gi i cao, giúp phân bi t m r t g n 15 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh Ch c năng: dùng quan sát virus, c u trúc phân t c a t bào Kính hi n vi quang h c II KÍNH HI N VI QUANG H C Nguyên t c: dùng ánh sáng có bư c sóng t 500nm – 560 nm chùm ánh sáng thư ng đ t o su t phân ly l n giúp phân bi t m cách kho ng 0.2 µm tr lên H th ng phóng to c a kính hi n vi quang h c g m hai b ph n: V t kính (quay v phía v t quan sát) th kính (quay v phía m t nhìn) M i b ph n m t h th ng th u kính h i t ph c t p, m u v t c n quan sát AB đư c đ t trư c v t kính m t kho ng cách l n tiêu c c a v t kính m t chút đ o ngư c A’B’ c a v t s thu đư c nh th t bên v t kính, n m kho ng tiêu c c a th kính Th kính ho t đ ng m t kính lúp Qua th kính, ngư i ta s th y nh o A’’B’’ đư c phóng to lên c a nh th t A’B’ Hình 11 Nguyên t c quang h c c a kính hi n vi Ch c năng: quan sát t bào vi sinh v t, ký sinh trùng, t bào đ ng v t,t h c v t C u t o: g m ph n 16 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh - H th ng h c: giá kính g m chân kính, thân kính, tr đ xoay th kính, g n xoay v t kính, bàn kính, trư t di chuy n tiêu b n, c di chuy n trư t, k p gi tiêu b n, c di chuy n t quang kính, c u ch nh sơ thô c p, c u ch nh th c p (vi c p) - H th ng quang h c g m: th kính, v t kính, t quang kính, ch n sáng, ngu n chi u sáng (đèn n chi u sáng và/ ho c kính chi u sáng Ngồi ra, kính dùng ngu n chi u sáng đèn n có thêm b ph n cung c p n phích c m, dây n, c u chì, m ch n (trong chân kính) nút u ch nh cư ng đ chi u sáng Thị kính (x 10, x 15) Trụ đỡ xoay thị kính Ổ gắn xoay vật kính Vật kính Bàn kính c điều chỉnh màng Thân kính Thanh kẹp giữ tiêu c sơ cấp (thô)  chắn sáng Tụ quang kính Gương chiếu sáng c thứ cấp (vi cấp) Chân kính hiển vi Hình 12: Các b ph n KHV quang h c – dùng gương 17 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh (Thò kính) (Ống kính) (Thân kính) (Vật kính) (Nút chỉnh tinh) (Nút chỉnh thô) (Nút chỉnh (Bàn kính) (Màng chắn sáng) (Nguồn sáng) (Bàn kính ) (Nút chỉnh ánh sáng nguồn) (Nút chỉnh thô) Hình 13: Các b ph n KHV quang h c- dùng đèn Nguyên t c ho t đ ng V t kính h th ng quang h c ph c t p g m m t s th u kính, tr c ti p phóng đ i m u v t Các th u kính s p x p theo th t , th u kính nh ngồi hư ng vào tiêu b n có đ phóng đ i l n nh t Đ phóng đ i c a kính ph thu c tiêu c , t c bán kính cong c a th u kính Th u kính cong, tiêu c ng n kh phóng đ i l n Có lo i v t kính: V t kính khơ đ phóng đ i nh x8, x10, x15, x40, x45 V t kính d u có đ phóng đ i l n x90, x100 Th kính có c u t o ph c t p, g m th u kính, m t hư ng v m t ngư i xem, m t hư ng v v t kính Th kính phóng đ i m t l n n a nh v t kính thu vào, làm nh to lên, xem rõ 18 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh Đ phóng đ i c a kính = đ phóng đ i c a v t kính x đ phóng đ i c a th kính Ví d : Đ phóng đ i c a v t kính: x100 Đ phóng đ i c a th kính: x10 Đ phóng đ i c a kính: 100 x 10 = 1.000 l n Năng su t phân ly c a kính quan tr ng đ phóng đ i, tiêu chu n đ ch n kính hi n vi Năng su t phân ly ( đ phân gi i ) c a kính hi n vi đ i lư ng cho bi t kh phân bi t hai m c a v t quan sát n m sát N u kho ng cách gi a m n m sát mà v n có th phân bi t đư c su t phân ly c a kính cao Khoảng cách phụ thuộc chiều dài sóng ánh sáng sử dụng số lượng tia sáng vào vật kính, biểu công thức: λ : Đ dài bư c sóng phát t m u v t n : Ch s chi t quang c a môi trư ng gi a m u v t v t kính α : N a góc m c a v t kính 2nsinα : Tr s m c a v t kính Qua đó, ta th y mu n có đ phân ly cao ph i dùng ánh sáng có bư c sóng th t ng n, ho c dùng v t kính có tr s m l n N u dùng v t kính có tr s m 0,65 soi v i ánh sáng tr ng (có bư c sóng trung bình λ= 0,55 µm) kho ng cách nh nh t có th nhìn th y rõ đư c là: 19 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh V i nh ng chi ti t có kho ng cách dư i 0,85 µm ngư i ta khơng phân bi t đư c Trong n u dùng th kính có đ phóng đ i l n khơng ích mà ph i thay v t kính khác có tr s m l n N u thay v t kính chìm (v t kính d u – x100) kho ng cách nh nh t gi a chi ti t c a v t soi có th th y đư c là: Vì λ xác đ nh b i ngu n ánh sáng th y, mu n gi m d đ tăng kh phân tích c a kính ch có cách tăng nsinα Trong s góc α b gi i h n b i nhi u sai l ch khó u ch nh, l i ch s chi t quang n Nhưng n không đư c cao ch s chi t quang c a th u kính v t kính, nên ngư i ta ch nâng n gi a v t kính m u v t b ng m t ch t d u g i d u bách hương (d u cede) đ đ t ch s chi t quang t i đa mong mu n b ng ch s chi t quang c a th u kính nkhông khí = 1,000 nthủy tinh = 1,515 ndaàu soi = 1,520 Chi t su t ánh sáng c a khơng khí nh th y tinh, nên tia sáng qua tiêu b n th y tinh s b khúc x m t ph n Ph n phía ngồi c a tia sáng b khúc x nên không vào đư c v t kính V t kính có đ phóng đ i l n đư ng kính c a th u kính nh , lư ng tia sáng vào đư c v t kính r t ít, nên khơng 20 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh th y rõ nh Đ h n ch c m ta dùng d u soi có chi t su t ánh sáng g n b ng th y tinh, th y tinh d u soi đư c xem m t môi trư ng đ ng nh t Ánh sáng qua không b khúc x , nên t p trung đ y đ vào v t kính, giúp xem rõ nh Năng su t phân ly c a kính cao góc nghiêng l n bư c sóng nh Tăng góc nghiêng b ng cách ch t o v t kính cho v t quan sát ( tiêu b n ) đư c đ t g n v t kính Hình 14: Đư ng c a tia sáng Hình 15: Nguyên lý ho t đ ng c a v t kính d u Dư i b ng thơng s c a v t kính th kính: Ký hi u ghi Đ v t kính Kho ng cách t c a m đ i Đư ng kính vi trư ng VK đ n tiêu b n phóng Đ quan sát b ng th (A) (mm) VK kính x10 (mm) V t kính khô x 0,20 0,20 8,91 1,75 21 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh 10 x 0,25 10 0,25 6,80 40 x 0,65 40 0,65 0,60 0,35 90 x 1,25 90 1,25 0,15 0,15 100 x 1,25 100 1,25 0,12 V t kính d u Kính t quang h th ng th u kính dùng t p trung ánh sáng vào tiêu b n, tăng cư ng đ chi u sáng, r t quan tr ng dùng v t kính d u V i v t kính khơ ta dùng t quang có đ m (A): 0,20 – 0,65 V i v t kính d u thư ng dùng t quang có đ m t : 1,20 – 1,30 Trong t quang có màng ch n sáng, tia sáng m nh màu c a v t quan sát m nh t, nên khép b t ch n sáng l i Ngư c l i, c n m h t ch n sáng ra, dùng v t kính d u Đi u ch nh t quang c n lưu ý: - Khi ngu n sáng xa dùng gương ph ng, t quang ch t p trung đư c tia sáng song song - Đi m gi a c a t quang ph i trùng v i tr c quang h c c a kính - Đ m c a t quang ph i tương ng đ m c a v t kính V y ta dùng màng ch n sáng u ch nh cho đ m c a t quang nh đi, lo i b t ánh sáng khu ch tán làm nh rõ ( m i tương quan gi a v t kính ch n u ch nh ánh sáng) - Ngu n sáng quy t đ nh hình nh c a tiêu b n, đ phóng đ i cao thi ngu n sáng ph i m nh Đ u n 22 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh cư ng đ chi u sáng có th dùng đèn chi u sáng r i ho c l p vào đ kính k t h p v i màng ch n sáng Hình 16: M i tương quan gi a đ phóng đ i c a v t kính v i kho ng cách t v t kính đ n tiêu b n Cách s d ng Trư c s d ng ph i ki m tra t t c b ph n c a kính, dùng khăn m m đ lau b ph n c a kính (Chú ý: ch lau bên ngồi, khơng tháo r i b ph n c a kính), đ kính ng n v a v i t m ng i, sau ti n hành tu n t bư c ti p theo đ soi tiêu b n Bư c 1: L y ánh sáng Đ i v i kính hi n vi ph i dùng gương đ l y ánh sáng t bên ngồi làm sau: Ch n phía sáng nh t đ làm ngu n sáng, quay gương v phía ngu n sáng ch n (n u ánh sáng m nh dùng m t ph ng, n u ánh sáng y u dùng m t lõm c a gương), m que ch n 23 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh sáng n u h th ng ch n sáng b đóng M t nhìn qua l mâm kính, tay u n gương cho th y m t h p t quang có chùm sáng m nh đ t yêu c u Xoay v t kính nh nh t (v t kính 10) v tr c kính (khi nghe ti ng c ch nh v trí) M t nhìn vào th kính, th y vi trư ng sáng tròn đ u đư c N u vi trư ng chưa sáng tròn đ u m t nhìn vào th kính, tay u n gương cho đ n đư c vi trư ng sáng tròn đ u Đ i v i kính hi n vi dùng ánh sáng đèn c m dây đèn vào c m, b t công t c, u n núm ch nh ánh sáng đ kính đ có đư c ánh sáng thích h p Xoay v t kính nh nh t (v t kính 10x) v tr c kính Bư c 2: Đ t tiêu b n vào mâm kính Trư c đ t tiêu b n vào mâm kính, ph i ch n m t ph i, m t trái c a tiêu b n M t ph i c a tiêu b n thư ng có dán lamen, dán nhãn (n u có lamen nhãn) ho c làm gi m b t đ lóa c a gương đ nghiêng soi ánh sáng (n u khơng có lamen, khơng có nhãn) Đ m t ph i c a tiêu b n lên trên, tay ph i m k p tiêu b n, tay trái c m phía đ u nhãn tiêu b n, đ t tiêu b n vào mâm kính tay ph i th k p gi tiêu b n Tiêu b n đư c gi ch t vào xe đ y, mâm kính Dùng c xe đ y đ u ch nh cho m u v t n m vào tr c kính (gi a l mâm kính) Chú ý: Có th dùng m sáng c a h p t quang đ làm m chu n u ch nh m u v t v m tr c kính, n u m u v t nh Bư c 3: Quan sát Nguyên t c b t bu c quan sát ph i quan sát đư c kính có đ phóng đ i nh , r i m i chuy n sang quan sát v t v t kính có đ phóng đ i l n k 24 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh Xem tiêu b n v t kính X10: - H t quang kính xu ng dư i (t c tăng kho ng cách t quang v i tiêu b n, th trư ng m đi) - Xoay v t kính x10 vào kh p c a đ v t kính (hư ng v t kính vào t quang) - M t nhìn vào bàn đ t tiêu b n (khơng nhìn vào th kính), hai tay xoay c u ch nh sơ c p đưa d n v t kính hư ng đ n tiêu b n(không đư c ch m vào tiêu b n) - Đ t m t hư ng vào th kính, hai tay xoay ch m c u ch nh sơ c p hư ng xa tiêu b n đ n m t th y rõ d n tiêu b n m u v t d ng l i - Hai tay n m c vi c p u ch nh cho nh rõ nh t - M t v n hư ng vào th kính, u ch nh m t l n n a kho ng cách c a t quang kính v i tiêu b n màng ch n sáng cho nh rõ nh t Xem tiêu b n v t kính X40: - Nâng t quang kính lên v a ph i (th trư ng sáng hơn) - Xoay v t kính X40 vào kh p c a đ v t kính ( hư ng v t kính vào t quang) - Đ t m t hư ng vào th kính, có th nhìn th y hình thái c a m u v t (đôi không rõ l m) Hai tay n m c vi c p u ch nh cho nh rõ nh t - M t v n hư ng vào th kính, u ch nh m t l n n a kho ng cách c a t quang kính v i tiêu b n màng ch n sáng cho nh rõ nh t 25 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh Xem tiêu b n v t kính X90, X100: - Nâng t quang kính lên sát tiêu b n, m cư ng đ sáng t i đa(th trư ng sáng nh t) - Xoay v t kính x100 vào kh p c a tr đ v t kính (hư ng v t kính vào t quang) - Nh m t gi t d u soi vào gi a tiêu b n - M t nhìn vào bàn đ t tiêu b n (khơng nhìn vào th kính), hai tay xoay c u ch nh sơ c p đưa d n v t kính hư ng đ n tiêu b n v a ch m vào tiêu b n d ng l i - Đ t m t hư ng vào th kính, hai tay xoay ch m c u ch nh sơ c p hư ng xa tiêu b n đ n m t th y rõ d n tiêu b n m u v t d ng l i Lưu ý: Khi di chuy n v t kính q xa, đ u v t kính khơng cịn nhúng vào gi t d u soi th trư ng t i h n - Hai tay n m c vi c p u ch nh cho nh rõ nh t - M t v n hư ng vào th kính, u ch nh m t l n n a kho ng cách c a t quang kính v i tiêu b n ch nh màng ch n sáng cho nh rõ nh t B o qu n - Sau s d ng xong, xoay t t c v t kính trư c, m k p tiêu b n, l y tiêu b n tr v ch cũ, h mâm kính, h h p t quang Dùng hai tay bê kính c t vào t ch ng m (t b o qu n KHV) - Ph i gi gìn kính ln ln s ch s , khơng đ b i b n hóa ch t dính vào Ln ln gi kính nơi khơ ráo, mát m đ b ph n quang h c không b m c - Khi lau kính, s d ng kính, khơng đư c tháo r i b ph n c a kính Khơng đư c dùng tay xoa m t th u kính, mà nên 26 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh dùng m t bút lông nh s ch đ ch i b i m t kính ho c dùng m m, s ch đ lau - N u s d ng v t kính x 100 ph i dùng dung d ch phù h p th m vào gi y chuyên d ng đ lau s ch d u cede đ u v t kính x 100 - Tránh m i s va ch m m nh vào kính, khơng đánh đ , đánh rơi kính N u di chuy n kính kh i phịng thí nghi m, nh t thi t ph i đưa kính vào h p c a có chèn lót c n th n - N u phát hi n có hư h ng đó, nh t thi t không đư c t ý tháo s a ch a mà ph i báo v i cán b hư ng d n bi t đ x lý III/ TH C HÀNH S d ng kính hi n vi quang h c quan sát vi n m t bào n m m c n m men: Quan sát tiêu b n: a/ N m m c (X10 X40): + Aspergillus + Penicillinum + Fusarium + Mucor + Rhizopus b/ N m men (X40 X100): + Saccharomyces + Candida Xem chi ti t hình dáng, màu s c c a n m m c: khu n ty, cu ng bào t , th b ng, th bình, túi bào t , bào t , T bào n m men: Xem v t kính x40 quan sát hình d ng t bào: t bào đ ng riêng l hay k t dính t o s i gi - s i th t Xem t ng th hình dáng c a n m m c, v hình 27 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh Penicillium Aspergillus Fusarium 28 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh Mucor Saccharomyces Rhizopus Candida Hình 17: Hình v hình ch p kính hi n vi n m m c Quan sát t bào vi khu n (x90 x100): + C u Gram+ : Staphylococcus spp, Streptococcus spp + Tr c Gram+ có bào t : Bacillus spp, Clostridium spp + Tr c Gram+ không bào t : Lactobacillus spp + Tr c Gram - : E Coli + Ph y khu n: Vibrio spp SStaphylococcus spp Streptococcus spp 29 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh Clostridium spp Lactobacillus spp Bacillus subtilis A B E.coli: A- KHV x100; B-KHV n t 30 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh Vibrio spp Hình 18: hình ch p kính hi n vi vi khu n IV/ BÁO CÁO K T QU V hình thích quan c a vi sinh v t quan sát 31 ... evaluation only Th c t p vi sinh s - Trư ng Đ i h c M Tp HCM Nguy n Văn Minh Ch c năng: dùng quan sát virus, c u trúc phân t c a t bào Kính hi n vi quang h c II KÍNH HI N VI QUANG H C Nguyên t c:... kính Ổ gắn xoay vật kính Vật kính Bàn kính c điều chỉnh màng Thân kính Thanh kẹp giữ tiêu c sơ cấp (thô)  chắn sáng Tụ quang kính Gương chiếu sáng c thứ cấp (vi cấp) Chân kính hiển vi Hình 12:... chuy n t quang kính, c u ch nh sơ thô c p, c u ch nh th c p (vi c p) - H th ng quang h c g m: th kính, v t kính, t quang kính, ch n sáng, ngu n chi u sáng (đèn n chi u sáng và/ ho c kính chi