Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết có nội dung giới thiệu về: Rễ nhàu (radix morindae citrifoliae) là một cây thuốc cổ truyền được dùng cho bệnh nhân ung thư đau lưng, cao huyết áp, đau lưng và antrquinon trong rễ cây này chủ yếu là damnacanthal và nor-damnacanthal.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Nghiên cứu Y học ĐIỀU CHẾ CHẤT ĐỐI CHIẾU DAMNACANTHAL VÀ NORDAMNACANTHAL TỪ RỄ NHÀU (RADIX MORINDAE CITRIFOLIAE) PHỤC VỤ CÔNG TÁC NGHIÊN CỨU VÀ KIỂM NGHIỆM Dương Hồng Tố Quyên*, Nguyễn Minh Đức** TĨM TẮT Đặt vấn đề - Mục đích nghiên cứu: Rễ Nhàu (Radix Morindae citrifoliae) thuốc cổ truyền dùng cho bệnh nhân ung thư đau lưng, cao huyết áp, đau lưng Antrquinon rễ chủ yếu damnacanthal nor-damnacanthal Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Dùng sắc ký cột chân không sắc ký cột cổ điển, phân lập chất nor - damnacanthal damnacanthal từ cao chiết rễ Nhàu Dùng HPLC xác định độ tinh khiết phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học chất phân lập Kết quả: Thu nor - damnancanthal tinh khiết 99,59% (HPLC) damnacanthal 99,79% (HPLC) dùng làm chất chuẩn đối chiếu Kết luận: Kết đề tài sở để điều chế chất đối chiếu nor-damnacanthal damnacanthal với qui mô lớn, phục vụ cho công tác nghiên cứu kiểm nghiệm Từ khóa: Điều chế, sắc ký lỏng hiệu cao, damnacanthal, nor-damnacanthal ABTRACT PREPARATION OF DAMNACANTHAL AND NOR – DAMNACANTHAL REFERENCE STANDARD FROM ROOTS OF MORINDA CITRIFOLIA L., (RUBIACEAE) Duong Hong To Quyen, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No – 2012 : 230 – 234 Background - Objectives: Radix Morindae citrifoliae is a medicinal plant traditionally used to treat cancer, hypertension., and back pain The most medicinally valuable antraquinones in the roots this plant is damnacanthal and nor-damnacanthal Methods: In this study, we prepatated damnacanthal and nor – damnacanthal from the root of Morinda citrifolia By the regular methods as vacuum liquid chromatography (VLC) and colum chromatography (CC), we obtained damnacanthal and nor-damnacanthal of high purity which can be used as references standar Chemical structure and purity of damnacanthal and nor- damnacanthal were determined by conventional methods (analytical HPLC and NMR) Results: Nor – damnacanthal 99 59% (HPLC) and damnacanthal 99 79% (HPLC) , which can be used as reference standards, were obtained Conclusion: Damnacanthal and nor–damnacanthal can be produced from the roots of Morinda citrifolia by VLC and CC Key words: Preparation, analytical HPLC, damnacanthal, nor-damnacanthal Bệnh viện Y học cổ truyền Tp HCM ** Khoa Y học cổ truyền - Đại học Y Dược Tp HCM Tác giả liên lạc: DS Dương Hồng Tố Quyên ĐT: 0934452889 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Email: toquyen300679@yahoo.com.vn 229 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Nhàu Núi (Morinda citrifolia L., Rubiaceae) trồng mọc hoang nhiều nước ta(3) Rễ Nhàu dùng chữa cao huyết áp, nhức mỏi, đau lưng lợi tiểu nhẹ (3) Thành phần hóa học rễ Nhàu xác định chủ yếu chứa nhóm antraquinon: Damnacanthal, nor-damnacanthal, alizarin, alizarin-1-methyl ether, rubiadin -1-methyl ether, morindon(2,6) Một số nghiên cứu gần cho thấy damnacanthal nor-damnacanthal chiết xuất từ than rễ nhàu có tác dụng kháng khối u in vitro mơ hình thử nghiệm dòng tế bào L1210 tế bào B-16 (2) Ngồi ra, damnacanthal có tác dụng ức chế nhiều loại tế bào tiền ung thư (7) Các chế phẩm từ Nhàu sử dụng ngày nhiều thị trường Các phương pháp dùng kiểm nghiệm cho chế phẩm quang phổ, sắc ký lớp mỏng, đặc biệt sắc ký lỏng hiệu cao trở thành phương pháp kiểm nghiệm tin cậy, hiệu Tuy nhiên, để áp dụng phương pháp cần phải có chất đối chiếu Nhưng nước ta thiếu chất chuẩn cần thiết, đa số chất chất chuẩn phải mua từ nước ngồi đắt tiền, nhiều khơng có sẵn mg chất chuẩn damnacanthal giá 1.200 USD Do đó, đề tài thực nhằm mục đích điều chế damnacanthal nor- damnacanthal từ rễ Nhàu làm chất đối chiếu phục vụ cho kiểm nghiệm tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm nguyên liệu từ Nhàu NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Rễ nhàu (Radix Morindae citrifoliae) công ty TNHH ADC cung cấp Rễ nhàu đem rửa sạch, thái phiến phơi khô tán thành bột thơ Hóa chất trang thiết bị Hóa chất - Dung mơi Methanol, ethanol, aceton, cloroform, toluen , ethyl acetate (Trung Quốc), methanot, nước cất (Merck, Đức) Chất đối chiếu damnacanthal 230 nor-damnacanthal 99,9% Ban nghiên cứu khoa, khoa Dược trường Đại Học Y Dược Tp HCM cung cấp Trang thiết bị Cân phân tích Sartorius độ nhạy 0,1 mg (Nhật bản), bếp cách thủy Menmmert WB.14 (Đức), máy cô quay Buchi R300 (Thụy sĩ), máy siêu âm Sanorex RK510 H (Pháp), cột sắc ký thủy tinh (Việt nam), máy sắc ký lỏng hiệu cao Waters 2695 (Mỹ), máy đo phổ hông ngoại FTIR -820 PC, máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV 500 (500MHz), máy soi UV bước song 254 nm 365 nm Vilber Lourinat (Pháp), Bảng mỏng TCL Silica gel 60 F254 Silica gel cỡ hạt 0,040-0,063 mm, (Merck, Đức) Phương pháp nghiên cứu Chiết xuất Chiết bột thô rễ nhàu cách đun hồi lưu với ethanol 960 Dịch chiết loại dung mơi áp suất giảm Cao lỏng thu hòa với nước tỷ lệ 1:1 chiết phân bố lỏng - lỏng với ethyl acetat (EtOAc thu dịch chiết, tiến hành loại dung môi thu cao ethyl acetat Phân lập tinh chế Sắc ký cột chân không Cột dùng sắc ký cột chân không (VLC) cột thuỷ tinh kích thước × 30 cm, khối lượng mẫu 10 g cao ethyl acetat, pha động hệ toluen – ethyl acetat với tỷ lệ ethyl acetat tăng từ – 10 %, khai triển với tốc độ 20 ml/ phút, thể tích phân đoạn 50 ml, pha tĩnh silica gel cỡ hạt 40 – 63 µm (250g), thể tích hứng ban đầu 150 ml sau giảm dần Các phân đoạn hứng kiểm tra sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi benzen - cloroform (1:1) phát UV bước sóng 365nm 254nm Sắc ký cột cổ điển (CC) Cột dùng cột thủy tinh (4,5 × 50 cm), pha tĩnh silica gel cỡ hạt 40-63 µm (100 g), nạp mẫu ướt cách hòa tan mẫu ml toluen, mẫu nạp phân đoạn VLC (4 g) Pha động ban đầu triển khai với 250 ml EtOAc; Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 sau triển khai hệ dung mơi toluen Thể tích hứng lần 30 ml, tốc độ ml/phút Kiểm tra phân đoạn sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi benzen-cloroform (1:1), phát soi UV 254 nm thuốc thử KOH 10% methanol.Gom phân đoạn giống cô thu hồi dung môi áp suất giảm.Tiếp tục tiến hành sắc ký cột cổ điển tương tự với phân đoạn (4 + 5) VLC (5,3 g) Pha động ban đầu triển khai pha động hệ toluen – ethyl acetat với tỷ lệ ethyl acetat tăng từ -10% Kiểm tra độ tinh khiết: Định lượng sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)(1) Xác định cấu trúc: Dùng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)(4) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bảng 1: Kết phân đoạn VCL từ cao EtOAc rễ nhàu Khối Phân Toluen:ethy lượng Thành phần đoạn l acetat (g) 98 : 0,32 C1 + C2 C1 + C2 + 97 : 0,38 C3 C3 + C4 + 95 : 1,4 tạp C3 + C4 + 94 : 0,7 tạp C3 + C4 + 90 : 10 1,1 C5 Ghi Chủ yếu C3 Chủ yếu C3 Chủ yếu C4 Chủ yếu C4 Nghiên cứu Y học Bảng 2: Kết phân đoạn sắc ký cột từ phân đoạn Phân đoạn 3.1 3.2 3.3 3.4 Toluen Khối Thành phần Ghi (ml) lượng (g) 500 1,3 C3 300 0,87 C3 + tạp Chủ yếu C3 300 1,7 C3 + C4 + tạp Chủ yếu C3 200 0,4 C4 + tạp Chủ yếu C4 Kiểm tra phân đoạn sắc ký lớp mỏng Gom phân đoạn giống cô thu hồi dung môi áp suất giảm Phân đoạn 3.1 kết tinh lại toluen nóng thu tinh thể hình kim ngắn màu vàng nghệ (N1) có khối lượng 1, g Phân đoạn 3.4 kết tinh lại toluen nóng thu 0, 25 g tinh thể hình kim dài màu vàng tạm gọi chất N2.Tiến hành tương tự với 3, g chất từ phân đoạn (4+5) thu phân đoạn kết sau:Phân đoạn 4.1 4.4 đem cô thu hồi dung môi kết tinh lại toluen nóng Phân đoạn 4.1 thu 0,4 g tinh thể chất N1 Phân đoạn 4.4 thu 1,2 g tinh thể chất N2 Kiểm tra độ tinh khiết chất N1 HPLC Điều kiện sắc ký: cột Prontosil C8 (100 x 4,6 m kích thước hạt m, pha động MeOH-H2O (80:20), nhiệt độ cột 250C, tốc độ dòng 0,80 ml/ phút, phát UV 248 nm Cân xác 1mg chất N1 hòa tan hồn tồn vào ml pha động, lọc qua màng lọc 0,45 m, thể tích bơm 10 µl Kiểm tra phân đoạn sắc ký lớp mỏng Từ phân đoạn 2, thu chất N1 màu vàng nghệ, kết tinh lại toluen nóng thu khối lượng 250 mg, phân đoạn có khối lượng 1,4 g, phân đoạn (4 + 5) khối lượng 1, g Tiến hành tương tự trên, dùng cột VLC phân tách 20 g cao EtOAc rễ nhàu Kết thu chất N1 có khối lượng 400 mg, phân đoạn có khối lượng 2,6 g, (4 + 5) khối lượng 3, g Kết phân đoạn từ sắc ký cột cổ điển Dùng sắc ký cột cổ điển tiếp tục phân lập đơn chất từ phân đoạn (4+5) Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Hình 1: Sắc ký đồ HPLC chất N1 Bảng 3: Kết định lượng chất N1 HPLC Lần thử nghiệm Diện tích Hàm lượng Các thơng số thống đỉnh (%) kê Trung bình 99,59% 4167311 99.59 SD = 0.033 4166903 99.58 231 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Nghiên cứu Y học 4163909 4167311 4167706 4167311 99.60 99.59 99.55 99.59 RSD = 0,02% Chất N1 có độ tinh khiết 99,59% dựa vào độ tinh khiết sắc ký Kiểm tra cấu trúc chất N1 NMR Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3), 13C-NMR (125 MHz, CDCl3 DEPT (125 MHz, CDCl3) cho cho tín hiệu đặc trưng: 15 tín hiệu carbon có carbon bậc 4, tất cộng hưởng vùng trường thấp, có carbon carbonuyl đặc trưng nhóm quinon(C 186,7, 181,3 ppm), nhóm nhân thơm (C 169,1, 168,1 ppm) Trong nhóm carbon bậc 3, có carbon có dịch chuyển carbon proton trùng thành nhóm (C 134,7, H 7,84 ppm, 2H,m C 127,7, H 8,30 ppm, 2H, m) đặc trưng cấu trúc vòng thơm đối xứng Bảng 4: Dữ liệu phổ 13C-NMR chất N1 (125 MHz, CDCl3 so với 13C-NMR nor-damnacanthal chuẩn theo tài liệu (5) Vị trí =C(1)-O>C(2)= =C(3)-O=C(4)H=C(5)H=C(6)H=C(7)H=C(8)H>C(9)=O >C(10)=O >C(11)= >C(12)= >C(13)= >C(14)= -C(15)HO -OH(C(1)) -OH(C(3)) C chuẩn C N1 168,1 168,1 112,1 112,1 169,1 169,1 109,4 109,4 127,8 127,7 127,0 127,0 134,8 134,7 134,7 134,7 186,7 186,8 181,3 181,3 133,3 133,3 133,2 133,2 109,0 109,1 139,5 139,4 193,9 193,8 H chuẩn H củaN1 7,33(s) 8,30(m) 8,30(m) 7,84(m) 7,84(m) 7,26(s) 8.30(m) 8.30(m) 7,82(m) 7,82(m) Hình 2: Sắc ký đồ HPLC chất N2 Bảng : Kết định lượng chất N2 HPLC Lần thử nghiệm Diện tích Hàm lượng Các thông số đỉnh (%) thống kê 3762954 99,74 3771021 99,95 Trung bình 99,79% 3767205 99,85 SD = 0,083 RSD = 0,07% 3762954 99,74 3762879 99,69 3762938 99,74 Chất N2 tinh khiết 99,79% dựa vào độ tinh khiết sắc ký Kiểm tra cấu trúc chất N2 NMR Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3), 13C-NMR (125 MHz, CDCl3 DEPT (125 MHz, CDCl3) cho cho tín hiệu đặc trưng giống với phổ NMR chất damnacanthal chuẩn Bảng 6: Dữ liệu phổ 13C-NMR chất N2 (125 MHz, CDCl3 so với 13C-NMR damnacanthal chuẩn theo tài liệu (5) 12,67(s) 14,05(s) 10,5(s) 12,65(s) 14,2(s) 10,48(s) Cấu trúc chất N1 nor – damnacanthal (C15H8O5 Kiểm tra độ tinh khiết chất N2 HPLC 232 Điều kiện sắc ký tương tự chất N1 dùng cột Supelcosil LC 18 (250 x 4,6 mm), kích thước hạt m, pha động MeOHH2O (60:40) Vị trí H chuẩn =C(1)-O>C(2)= =C(3)-O=C(4)H=C(5)H=C(6)H=C(7)H=C(8)H>C(9)=O >C(10)=O >C(11)= 166,7 118,5 166,6 113,1 127,4 127,1 134,8 134,0 187,5 180,2 133,6 C chuẩn chuẩn H chuẩn H N2 N2 166,7 118,1 166.6 117,4 7,66(s) 7,68(s) 127,4 8,20(m) 8,3(m) 127,1 8,20(m) 8,3(m) 134,9 7,75(m) 7,8(m) 134,8 7,75(m) 7,8(m) 181,9 180,2 133,6 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Vị trí H chuẩn >C(12)= >C(13)= >C(14)= -C(15)HO -OMe(16) =C(1)-O- 133,0 113,0 145,0 195,5 64,7 166,7 C chuẩn H chuẩn H chuẩn N2 N2 132,5 113,1 141,7 195,5 12,26(s) 12,27(s) 64,7 4,13(s) 4,13(s) 166.7 chế chất đối chiếu với qui mô lớn phục vụ công tác nghiên cứu kiểm nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Cấu trúc chất N2 damnacanthal (C16H10O5 KẾT LUẬN Kết nghiên cứu xác định phương pháp ổn định qui trình chiết xuất, phân lập, tinh khiết hóa chất damnacanthal nordamnacanthal từ rễ nhàu Xác định độ tinh khiết HPLC kiểm tra cấu trúc phổ NMR Kết thu nor-damnacanthal với độ tinh khiết 99, 5% (HPLC), damnacanthal tinh khiết 99, 7% (HPLC) đạt tiêu chuẩn làm chất đối chiếu Kết nghiên cứu sở điều Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Nghiên cứu Y học Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu cao số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu hợp chất tự nhiên, NXB Y Học, tr.150 – 155 Trần Thị Bửu Hồn (2002), Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Nhàu, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học, ĐHYD Tp.Hồ Chí Minh Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr.306 -307 Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng phân tích hữu cơ, NXB Đại học quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh, tr 87-95 Do Quoc Viet, Pham Gia Dien, Mai Ngoc Tam, Phan Thi Phi Phi, Nguyen Hai Nam, you yong jea AndByung- Zun Ahn (1999), Cytotoxicity of some antraquinones from the stem of Morinda citrifolia Growing in Viet Nam, Hoa Hoc, 3(37), pp 9497 Leitsner E (1975), Planta Medica, 214-224 [in C.A., (83), pp 17545 Hiramatsu T (1993), Introduction of normal phenotypes in RAS tranformed cells by Damnacanthal from Morinda citrifolia, Cancer Letter (73), pp.161-166 233 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Nghiên cứu Y học THE HERBAL – DRUG INTERACTION BETWEEN GINSENG (Panax ginseng) AND METFORMIN ON THE HYPOGLYCEMIC EFFECT IN ALLOXAN - INDUCED DIABETIC MICE 180 Hua Hoang Oanh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No – 2012 : 180 – 185 180 STUDY ON THE ANDROGENIC EFFECT OF THE ALCOHOL EXTRACT OF EURYCOMA LONGIFOLIA JACK ‘S ROOTS ON MICE 186 Tran My Tien, Nguyen Thanh Hong Van, Tran Cong Luan, Nguyen Thi Thu Huong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 Supplement of No – 2012: 186 – 191 186 STUDY ON THE ANDROGENIC EFFECT OF MORINDA OFFICINALIS HOW 192 Tran My Tien, Nguyen Mai Thanh Tam, Tran Cong Luan, Nguyen Thi Thu Huong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 Supplement of No – 2012 : 192– 198 192 PRELIMINARY STUDY ON BIOACTIVITIES OF BLEPHARIS MADERSPATENSIS (L.) ROTH 199 Van Đuc Thinh, Le Thi Hong Quy, Tran Cong Luan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No – 2012 : 199 – 206 199 STANDARDIZATION OF BO DUONG HOAN NGU THANG EXTRACT AND CAPSULE 207 Truong Huu Nhan, Tran Thi Bach Tuyet, Phan Quan Chi Hieu, Nguyen Phuong Dung, Bui My Linh, Pham Thi My Nhung, Tran Phuc Vinh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No – 2012 : 207 –212 207 STUDY OF BOTANY CHARACTERISTICS AND CHEMICAL COMPOSITION OF BLUMEA BALSAMIFERA (L.) DC ASTERACEAE 213 Tran Thi Thuy Quynh, Nguyen Thai Linh, Nguyen Thi Nghi Trung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 Supplement of No – 2012 : 213 – 216 213 COMPARISON OF ANATOMICAL CHARATERISTICS AND CHEMICAL CONSTITUENTS OF THE RHIZOME SAMPLES OF HOMALOMENA SP COLLECTED AT CON DAO AND THE RHIZOME OF HOMALOMENA OCCULTA (LOUR.) SCHOTT 217 Dinh Thi Hai Huong, Tran Thi Thanh Tu, Duong Thi Mong Ngoc, Phan Phuoc Hien, Tran Cong Luan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No – 2012 : 217 – 223 217 STUDY ON THE STANDARDIZATION OF BO KHI HOAT HUYET CAPSULES 224 Lam Bich Thao, Duong Thi Mong Ngoc, Nguyen Phuong Dung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No – 2012 : 224 – 229 224 PREPARATION OF DAMNACANTHAL AND NOR – DAMNACANTHAL REFERENCE STANDARD FROM ROOTS OF MORINDA CITRIFOLIA L., (RUBIACEAE) 229 Duong Hong To Quyen, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No – 2012 : 230 – 234 229 125Đề Y Học Cổ Truyền Chuyên ... đích điều chế damnacanthal nor- damnacanthal từ rễ Nhàu làm chất đối chiếu phục vụ cho kiểm nghiệm tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm nguyên liệu từ Nhàu NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên... 4,13(s) 4,13(s) 166.7 chế chất đối chiếu với qui mô lớn phục vụ công tác nghiên cứu kiểm nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Cấu trúc chất N2 damnacanthal (C16H10O5 KẾT LUẬN Kết nghiên cứu xác định phương... đạt tiêu chuẩn làm chất đối chiếu Kết nghiên cứu sở điều Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Nghiên cứu Y học Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu cao số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm,