Đang tải... (xem toàn văn)
Xây dựng quy trình định lượng tổng hàm lượng flavonolignan tính theo silybin trong dược liệu hạt cúc gai silybum marianum (L.) gaertn và chế phẩm từ hạt cúc gai bằng phương pháp quang phổ UV-Vis, thẩm định các quy trình đã xây dựng và áp dụng các quy trình này để xác định tổng hàm lượng flavonolignan trong dược liệu (hạt cúc gai) và một số chế phẩm từ hạt cúc gai trên thị trường.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học ÁC ĐỊNH TỔNG HÀM LƢỢNG FLAVONOLIGNAN T NH THEO SILY IN TRONG DƢỢC LIỆU HẠT C C GAI VÀ CHẾ PHẨM TỪ C C GAI SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN) ẰNG PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-VIS Thái Nguyễn hánh ằng*, Ng Thị Thanh Diệp*, a ồng nh* TĨM TẮT Mở đầu: Cây Cúc gai, tên khoa học Silybum marianum (L.) aertn sử dụng làm thuốc chữa bệnh gan mật v| số bệnh ung thư từ l}u Tuy t{c dụng Cúc gai v| c{c chế phẩm từ Cúc gai chứng minh v| sử dụng phổ biến giới Việt nam dược liệu hạt Cúc gai v| c{c chế phẩm từ Cúc gai chưa có DĐVN IV, đó, việc x}y dựng quy trình định lượng hoạt chất l| c{c flavonolignan cho ph p đ{nh gi{ chất lượng dược liệu hạt Cúc gai v| chế phẩm l| cần thiết Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin dược liệu hạt cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn v| chế phẩm từ hạt Cúc gai phương ph{p quang phổ UV-Vis Thẩm định c{c quy trình x}y dựng v| {p dụng c{c quy trình n|y để x{c định tổng h|m lượng flavonolignan dược liệu (hạt Cúc gai) v| số chế phẩm từ hạt Cúc gai thị trường Đối tượng phương pháp: Đối tượng nghiên cứu l| c{c flavonolignan (với chất đối chiếu l| flavonolignan silybin) có dược liệu v| chế phẩm từ Cúc gai Tiến h|nh khảo sát thơng số cho quy trình định lượng Từ đó, x}y dựng thẩm định quy trình định lượng tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin hạt cúc gai nguồn gốc từ Croatia v| c{c chế phẩm thị trường mã hóa LI, SA, SI phương ph{p quang phổ UV-Vis v| {p dụng quy trình n|y để x{c định tổng h|m lượng flavonolignan hạt Cúc gai v| c{c chế phẩm LI, SA, SI Kết quả: Xây dựng thẩm định quy trình định lượng tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin hạt Cúc gai v| số chế phẩm từ hạt Cúc gai phương ph{p quang phổ UV-Vis với thông số: m{y quang phổ Shimadzu Probe 2550; dung môi chiết ethanol 96%; phương ph{p chiết: đun hồi lưu 90 – 95 oC lần, lần 30 phút; bước sóng định lượng 288 nm Kết thẩm định cho thấy quy trình có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, độ x{c v| độ cao Áp dụng quy trình x}y dựng để x{c định tổng h|m lượng flavonolignan hạt Cúc gai v| số chế phẩm từ hạt Cúc gai thị trường Kết cho thấy tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin hạt Cúc gai l| khoảng 3,8% tính theo dược liệu khô kiệt; chế phẩm LI – 196 mg; chế phẩm SA – 243 mg; chế phẩm SI – 50 mg Kết luận Quy trình định lượng đơn giản có độ v| độ lặp lại cao cho ph p x{c định tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin dược liệu hạt Cúc gai v| chế phẩm từ hạt Cúc gai Sử dụng quy trình cho ph p đ{nh gi{ nhanh chất lượng dược liệu v| chế phẩm từ hạt Cúc gai Từ khóa: Cúc gai, milk thistle seed, silybin, quang phổ UV-Vis *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Ngô Thị Thanh Diệp ĐT: 01226671588 Chuyên Đề Dƣợc Email: thanhdiep73@yahoo.com 241 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 ABSTRACT DETERMINATION OF TOTAL FLAVONOLIGNAN CALCULATED AS SILYBIN IN MILK THISTLE SEEDS (SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN.) AND THEIR PRODUCTS BY UV-VIS SPECTROPHOTOMETRY Thai Nguyen Khanh Hang, Ngo Thi Thanh Diep, La Hoang Anh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018:241 - 249 Introduction: Milk thistle (Silybum marianum (L.) Gaertn.) has been used to prevent liver and treat liver diseases, cancer for a long time Althought the milk thistle seeds and their product shave been proven and widely used in the world as well as in Vietnam but there is no monograph of Silybum marianum seeds and products in the 4th edition Vietnamese Pharmacopoeia and the quality of this valuable medicinal herb and its products has not been controlled yet Therefore, this study was conducted to develop a method for quantitative determination of active ingredients - the flavonolignans, in milk thistle seeds and their products is extremely necessary Objectives: In this study, quantitative determination of total flavonolignan calculated as silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products by UV-Vis spectrophotometry was established The method was validated and applied to determine the total content of flavonolignan in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products Materials and methods: The study subjects were flavonolignans (with silybin as a reference) in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and several corresponding products Parameters for the quantitative procedure were determined After that, the quantitative determination of flavonolignan calculated as silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn (originating in Croatia) and their productson the market by UV-Vis spectrophtometry was developed and validated The procedure was applied to determine the total content of flavonolignan in Silybum marianum (L.) Gaertn seeds and LI, SA and SI products Results: The quantitative determination of flavonolignan content calculated as silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products by UV-Vis spectrophotometry was developed and validated with parameters: Shimadzu Probe Spectrometer 2550; 96% ethanol for extraction (reflux at 90 - 95 °C times with 30 minutes per time); absorbance of quantitative solutions was measured at wavelength 288 nm The results illustrated that the procedure had selectivity, wide linearity, high correlation coefficient, high accuracy and precision The validated method was applied to determine the total content of flavonolignan in Silybum marianum (L.) Gaertn seeds and their products on the market The results also showed that the total content of flavonolignan, calculated as silybin in Silybum marianum (L.) Gaertn seeds and LI, SA, SI products were about 3.8% of the dried material; 196 mg; 243 mg; 50 mg, respectively Conclusion: The rapid and simple UV-Vis method, which had high-precision and high-accuracy, was suitable for testing the quality of seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products Keywords: Silybum marianum (L.) Gaertn, Milk Thistle seed, UV-Vis spectrophotometry rộng rãi Hoa Kỳ v| ch}u u nhƣ nhiều ĐẶT VẤN ĐỀ nơi giới để chữ cải thiện chức củ Cây Cúc gai (còn gọi kế sữa, kế thánh, kế gan(1,6) Những năm gần đ}y, nhiều nghiên cứu đức mẹ , tên kho học Silybum marianum (L.) cho thấy Cúc gai có hoạt tính sinh học Gaertn lồi thuộc họ Cúc (Asteraceae) trội hứa hẹn nhiều tiềm điều trị Cúc gai đƣợc sử dụng làm thuốc bảo vệ gan nhƣ ổn định màng tế b|o g n, ngăn cản xâm mật từ 2000 năm trƣớc Nhiều loại thuốc nhập chất độc v|o bên g n; tăng thực phẩm chức từ Cúc gai đƣợc sử dụng 242 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 tổng hợp protein tế bào gan kích thích hoạt động RNA polymerase, góp phần giải độc cho g n; thúc đẩy phục hồi tế b|o g n bị hủy hoại kích thích phát triển tế bào gan thay tế b|o g n bị hủy hoại; ức chế biến đổi tế bào gan thành tổ chức xơ, giảm hình thành lắng đọng sợi collagen dẫn đến xơ g n; chống peroxyd hó lipid, tăng khả oxy hó cid béo gan, làm ổn định tế bào gây viêm, ức chế phản ứng viêm, giảm nồng độ enzym gan, làm cải thiện triệu chứng bệnh g n nhƣ gan nhiễm mỡ, viêm gan Hiện nhà khoa học v| đ ng tiến hành nghiên cứu quy mô thuốc quý này, không dừng lại tác dụng với bệnh gan mật mà có khả chống ung thƣ v| điều trị cho bệnh nhân HIV(3,4,5) Trong vòng 50 năm qu , c{c nh| kho học th|nh c ng việc x{c định hoạt chất có c}y Cúc g i, đ{ng ý nhóm hợp chất đƣợc chiết xuất từ hạt Cúc g i có tên l| silym rin gồm c{c fl vonolign n chiếm khoảng 70-80% c{c hoạt chất hạt Cúc g i Th|nh phần chủ yếu củ silym rin l| silybin, ngo|i r có silichristin, silidianin(1,5,6) Ở Việt Nam, Cúc gai đƣợc di thực từ kỷ 20, đƣợc trồng số nơi với quy m nhỏ nhƣ S p , H| nội, T m Đảo, Đ| Lạt Tuy t{c dụng củ Cúc g i v| c{c chế phẩm từ cúc g i đƣợc chứng minh v| sử dụng phổ biến nhƣng dƣợc liệu v| c{c chế phẩm từ Cúc g i chƣ có DĐVN IV Do đó, việc x}y dựng quy trình định lƣợng hoạt chất l| nhóm c{c fl vonolign n cho phép đ{nh gi{ chất lƣợng củ dƣợc liệu v| chế phẩm từ cúc g i l| v cần thiết Đề t|i đƣợc thực với c{c mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định lƣợng tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin dƣợc liệu hạt Cúc g i Silybum marianum (L.) Gaertn v| chế phẩm từ hạt Cúc g i phƣơng ph{p qu ng phổ UV-Vis Chuyên Đề Dƣợc - Nghiên cứu Y học Thẩm định quy trình x}y dựng v| {p dụng để x{c định tổng h|m lƣợng fl vonolign n dƣợc liệu hạt Cúc g i v| số chế phẩm từ hạt cúc g i thị trƣờng NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU - PHƢƠNG PHÁP Nguyên liệu Hạt cúc g i có nguồn gốc từ Cro ti đƣợc cung cấp c ng ty Starwest Botanicals, th{ng năm 2017 C{c chế phẩm l| thực phẩm chức silym rin có nguồn gốc từ cúc g i đƣợc thu mu thị trƣờng Tp HCM v|o th{ng 5/2017 đƣợc mã hó lần lƣợt l| LI, SA v| SI bảng ảng : C{c chế phẩm thực phẩm chức sử dụng nghiên cứu STT Tên chế phẩm m h a Hàm lượng sil marin nh n viên LI 140 mg SA 140 mg SI 70 mg Dạng bào chế Viên nang cứng Viên nén bao phim Viên nang cứng Chất chuẩn Silybin h|m lƣợng 91,57% C25H22O10), số lô QT198051115 Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh cung cấp Hóa chất, dung mơi Ethanol (EtOH) 96%, methanol (MeOH), ethyl acetat (EtOAc), cloroform, ether ethylic, n-hex n đạt tinh khiết loại PA Trung Quốc sản xuất, số hó chất v| thuốc thử th ng thƣờng kh{c phòng thí nghiệm Trang thiết bị M{y qu ng phổ UV-Vis Shimadzu Probe 2550, bể siêu âm Branson 8510 (USA), cân phân tích Kern ABS 220-4, c}n x{c định độ ẩm Sartorius MA 45, bể cách thủy Memmert, mỏng Silica gel F254 Merck 243 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Phƣơng pháp nghiên cứu Định tính sily in dược liệu hạt cúc gai chế phẩm ằng phương pháp M Khảo s{t hệ dung m i: CHCl3 – MeOH – H2O (5:1:1); n-hexan – EtOAc (7:3); CHCl3 – EtOAc (3:1); CHCl3 – CH3CN (6:4); CHCl3 – MeOH (9:1); CHCl3 – EtOAc – HCOOH 5:4:1 Chọn hệ dung m i cho hiệu t{ch c{c vết sắc ký đồ củ mẫu thử tốt v| gi{ trị Rf củ vết silybin sắc ký đồ củ mẫu chuẩn khoảng 0,3 đến 0,8 Xây dựng quy trình định lượng: Xây dựng quy trình định lượng tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin dược liệu: Khảo s{t c{c th ng số: dung m i chiết, phƣơng ph{p chiết, thời gi n chiết, bƣớc sóng định lƣợng Chuẩn bị c{c dung dịch chuẩn silybin C}n x{c khoảng 20 mg silybin chuẩn, hò t n eth nol 96%, đun nóng cho t n ho|n to|n S u để nguội, chuyển v|o bình định mức 100 ml, thêm eth nol 96% đến vạch, thu đƣợc dung dịch chuẩn A có nồng độ silybin khoảng 200 µg/ml Hút x{c ml dung dịch chuẩn A v|o bình định mức 25 ml, thêm eth nol 96% đến vạch, lắc đều, thu đƣợc dung dịch chuẩn C có nồng độ silybin khoảng µg/ml Từ dung dịch chuẩn A ph c{c dung dịch chuẩn có nồng độ lần lƣợt l| 5, 8, 10, 20, 32 µg/ml để khảo s{t khoảng tuyến tính thẩm định quy trình định lƣợng Chuẩn bị dung dịch mẫu thử (dung dịch thử T): C}n x{c khoảng 1,00 g hạt cúc g i nghiền nhỏ đến kích thƣớc mm cho v|o bình nón nút m|i loại 100 ml, chiết xuất dung m i v| phƣơng ph{p đƣợc lự chọn s u khảo s{t Dịch chiết đƣợc chuyển to|n v|o bình định mức 100 ml v| thêm dung m i dùng để chiết xuất đến vạch, thu đƣợc dung dịch Hút x{c ml dung dịch cho v|o bình định mức 25 ml v| thêm eth nol 96% đến vạch, thu đƣợc dung dịch thử T 244 Lắc mẫu, để yên 20 phút Đo độ hấp thu mẫu chuẩn thử bƣớc sóng λmax Ghi nhận độ hấp thụ A mẫu chuẩn thử, từ tính r tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin mẫu thử hạt cúc g i Quy trình định lƣợng sau xây dựng đƣợc thẩm định tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ x{c v| độ theo ICH(2) Quy trình định lượng tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin chế phẩm Chuẩn bị c{c dung dịch chuẩn: Tiến h|nh giống nhƣ quy trình định lƣợng củ dƣợc liệu hạt cúc g i Chuẩn bị dung dịch mẫu thử: Đầu tiên, x{c định h|m lƣợng dƣợc chất trung bình đơn vị chế phẩm, s u c}n lƣợng dƣợc chất đƣợc lấy từ lƣợng dƣợc chất đƣợc l|m đồng từ 20 đơn vị, chiết xuất dung m i đƣợc lự chọn ph lỗng dung m i đến nồng độ thích hợp để thu đƣợc dung dịch thử T có nồng độ fl vonolign n nằm khoảng tuyến tính, gần với nồng độ mẫu chuẩn C Đo độ hấp thu dung dịch T dung dịch chuẩn silybin C bƣớc sóng định lƣợng λmax Từ lƣợng mẫu thử c}n, độ hấp thu At củ dung dịch mẫu thử T v| Ac nhƣ nồng độ củ dung dịch mẫu chuẩn silybin dung dịch chuẩn C , dự v|o độ ph loãng củ c{c dung dịch mẫu thử để tính r tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin c{c chế phẩm C{c quy trình định lƣợng chế phẩm đƣợc thẩm định tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ x{c v| độ theo ICH(2) KẾT QUẢ Định tính silybin hạt cúc g i v| chế phẩm phƣơng ph{p SKLM: Với hệ dung m i đƣợc khảo s{t hệ dung m i CHCl3 – CH3CN 6:4 cho c{c vết fl vonolign n t{ch tốt nhất, có gi{ trị Rf củ vết tƣơng ứng với vết silybin đối chiếu khoảng 0,5 đƣợc lự chọn l|m hệ dung m i cho SKLM Kết Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 cho thấy sắc ký đồ củ c{c mẫu dƣợc liệu v| chế phẩm có vết có m|u sắc v| gi{ trị Rf với vết củ silybin đối chiếu ây dựng quy trình định lƣợng tổng h m lƣợng flavonolignan t nh theo sily in dƣợc liệu hạt c c gai Khảo sát dung môi chiết Chuẩn bị dung dịch T phƣơng pháp chiết đun hồi lƣu, với c{c dung m i kh{c nh u Quét phổ UV - Vis củ dung dịch thử thu đƣợc vùng 400-200 nm v| đo độ hấp thu bƣớc sóng λmax Kết thu đƣợc cho thấy độ hấp thu A dịch chiết EtOH 50% l| c o Tuy nhiên dịch chiết EtOH 96% có m|u v|ng suốt, độ hấp thu chút so với dịch chiết EtOH 50% v| phổ UV-Vis có đỉnh hấp thu rõ ràng, dịch chiết c{c dung m i EtOH 30%, EtOH 50% v| EtOH 70% bị đục phổ UV-Vis hình cƣ , kh ng có đỉnh rõ r|ng Vì vậy, chọn EtOH 96% làm dung mơi chiết xuất cho quy trình định lƣợng Khảo sát phương pháp chiết: Chuẩn bị dung dịch thử T phƣơng ph{p siêu }m v| đun hồi lƣu với dung m i chiết đƣợc chọn l| EtOH 96% Quét phổ UV - Vis củ dung dịch thử T thu đƣợc vùng 200400 nm v| đo độ hấp thu bƣớc sóng λmax Ghi nhận độ hấp thu A Kết cho thấy phƣơng ph{p đun hồi lƣu cho độ hấp thu c o phƣơng ph{p siêu }m nên chọn phƣơng ph{p chiết đun hồi lƣu cho quy trình định lƣợng hảo sát thời gian chiết: Với dung m i l| EtOH 96% v| phƣơng ph{p chiết đun hồi lƣu khảo s{t, tiến h|nh chiết xuất c{c khoảng thời gi n kh{c nh u l| 20, 30 v| 45 phút Kết thu đƣợc cho thấy thời gi n chiết mẫu dƣợc liệu l| 30 phút x lần l| tối ƣu chiết kiệt đƣợc c{c hoạt chất, thời gi n chiết kh ng qu{ d|i Chuyên Đề Dƣợc Nghiên cứu Y học hảo sát ước sóng định lượng: Tiến h|nh quét phổ hấp thu UV-Vis củ c{c dung dịch thử T với c{c điều kiện chiết xuất lự chọn v| dung dịch chuẩn C củ silybin khoảng 200-400 nm Kết cho thấy phổ củ dung dịch thử v| chuẩn có đỉnh hấp thu cực đại λmax = 288 nm hình Do chọn bƣớc sóng định lƣợng l| 288 nm u u ị ị uẩ C ình : Phổ hấp thu UV-Vis dung dịch mẫu thử v| dung dịch silybin chuẩn Nhƣ quy trình định lƣợng tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin dƣợc liệu hạt cúc g i qu kết nghiên cứu nhƣ s u: Chuẩn ị dung dịch mẫu thử chuẩn Dung dịch chuẩn silybin C C}n x{c khoảng 20 mg silibin chuẩn, chuyển v|o bình định mức dung tích 100 ml, thêm khoảng 40 ml eth nol 96%, đun c{ch thủy 70 - 80 0C t n ho|n to|n S u để nguội, thêm eth nol 96% đến vạch, thu đƣợc dung dịch chuẩn A Hút x{c ml dung dịch A v|o bình định mức 25 ml, thêm eth nol 96% đến vạch, lắc đều, thu đƣợc dung dịch chuẩn C Dung dịch thử T C}n x{c khoảng 1,00 g dƣợc liệu nghiền nhỏ đến kích thƣớc 1mm cho v|o bình nón nút m|i loại 100 ml, thêm 30 ml eth nol 96%, đun hồi lƣu 90-95 oC 30 phút Để nguội s u lọc qu giấy lọc v|o bình định mức thể tích 100 ml Lặp lại qu{ trình chiết xuất lần nữ , gộp dịch lọc bình 245 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 định mức 100 ml v| thêm eth nol 96% đến vạch, thu đƣợc dung dịch Hút x{c ml dung dịch cho v|o bình định mức 25 ml v| thêm eth nol 96% đến vạch, thu đƣợc dung dịch T Đo mẫu Lắc đều, để yên 20 phút Đo độ hấp thu củ dung dịch mẫu thử T v| mẫu chuẩn C bƣớc sóng λmax = 288 nm Ghi nhận độ hấp thu A mẫu chuẩn thử Cơng thức tính tổng hàm lượng flavonolignan tính theo sily in g hạt Cúc gai: X= Trong đó: X – H|m lƣợng tổng flavonolignan theo silybin 100 g Cúc gai, % At – Độ hấp thu củ dung dịch mẫu thử dung dịch T Ac – Độ hấp thu củ dung dịch mẫu chuẩn silybin (dung dich C) mt – Khối lƣợng mẫu thử, g mc – Khối lƣợng chuẩn silybin, g W – Mất khối lƣợng l|m kh củ dƣợc liệu, % Kết thẩm định quy trình định lƣợng tổng h m lƣợng flavonolignan t nh theo sily in hạt C c gai Phổ UV-Vis mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn có đỉnh hấp thu cực đại bƣớc sóng 288 nm giống nhƣ mẫu chuẩn silybin Khi thêm dung dịch chuẩn silybin vào mẫu thử, độ hấp thu mẫu thử thêm chuẩn tăng lên rõ rệt đỉnh hấp thu so với lúc chƣ thêm chuẩn silybin Mẫu trắng kh ng có đỉnh hấp thu độ hấp thu xấp xỉ vùng 200 – 400 nm Nhƣ vậy, quy trình định lƣợng có tính đặc hiệu Có tƣơng qu n tuyến tính giữ độ hấp thu A nồng độ dung dịch mẫu chuẩn theo phƣơng trình ŷ = 0,0511x; R2 = 0,9999 khoảng nồng độ silybin từ – 32 µg/ml 246 Độ lặp lại đƣợc khảo s{t mẫu thử hạt Cúc g i cho thấy quy trình có độ lặp lại tốt với RSD% l| 3,1% H|m lƣợng tổng fl vonolign n tính theo silybin hạt Cúc g i tính theo gi{ trị trung bình củ lần định lƣợng l| 3,8% Độ đƣợc thẩm định phƣơng ph{p thêm chuẩn silybin cho thấy quy trình có độ c o với khoảng tỷ lệ phục hồi l| 102,2% với RSD l| 2,7% Quy trình định lƣợng tổng flavonolignan t nh theo sily in mẫu chế phẩm đơn giản phƣơng pháp xử l mẫu thử mẫu t phức tạp d chiết xuất hoạt chất Chuẩn ị dung dịch mẫu chuẩn C Tiến h|nh nhƣ quy trình định lƣợng dƣợc liệu hạt cúc g i Chuẩn bị dung dịch mẫu thử Lấy 20 đơn vị chế phẩm để tính khối lƣợng trung bình củ dƣợc chất chế phẩm Đối với viên nang cứng LI v| SI: C}n khối lƣợng 1viên nang, ghi nhận kết Tách vỏ n ng, đổ dƣợc chất r , l u vỏ nang đem c}n lại vỏ nang, ghi nhận kết Hiệu giữ h i lần c}n l| khối lƣợng dƣợc chất viên n ng Tiến hành cho 20 viên tính khối lƣợng trung bình củ dƣợc chất viên Đối với viên nén bao phim SA: Bóc lớp m|ng b o phim bên ngo|i viên nén đem c}n, ghi nhận kết Tiến h|nh lần lƣợt cho 20 viên tính khối lƣợng trung bình củ viên nh}n Trộn dƣợc chất từ 20 đơn vị chế phẩm, c}n lƣợng tƣơng ứng khối lƣợng trung bình củ đơn vị chế phẩm SI c}n lƣợng bột viên tƣơng ứng với lần khối lƣợng trung bình củ dƣợc chất viên , chuyển vào bình định mức 100 ml Thêm khoảng 50 ml EtOH 96%, siêu âm 30 phút Thêm EtOH 96%, điền đến vạch Trộn đều, lọc qua giấy lọc, bỏ khoảng 10 ml dịch lọc đầu, thu đƣợc dịch lọc D1 Hút xác ml dịch lọc D1 cho v|o bình định mức 100 ml, thêm EtOH 96% đến vạch, thu đƣợc dung dịch D2 Hút xác ml dung dịch D2 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 cho v|o bình định mức 25 ml, thêm EtOH 96 % đến vạch thu đƣợc dung dịch thử T - Đo độ hấp thu dung dịch T dung dịch chuẩn silybin C bƣớc sóng 288 nm - Cơng thức tính tổng h|m lƣợng fl volign n tính theo silybin chế phẩm: Х= =10× Trong X – Lƣợng flavonolignan theo sylibin viên chế phẩm, mg At – Độ hấp thu củ dung dịch mẫu thử dung dịch T Ac – Độ hấp thu củ dung dịch mẫu chuẩn silybin (dung dich C) mt – Khối lƣợng mẫu thử, g mc – Khối lƣợng chuẩn silybin, g – Khối lƣợng trung bình viên, mg Dt – Độ pha loãng mẫu thử Dc – Độ pha loãng mẫu chuẩn Kết thẩm định độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại v| độ cho chế phẩm LI, SA v| SI cho thấy quy trình có độ đặc hiệu c o, độ lặp lại tốt RSD% củ độ lặp lại c{c chế phẩm LI, SA, SI lần lƣợt l| 1,9%; 1,2%; 1,8% , độ c o khoảng tỷ lệ phục hồi c{c chế phẩm LI, SA, SI lần lƣợt l| 98,4%; 99,6%; 99,5% với RSD% tƣơng ứng: 1,7%; 2,0%; 1,9%) Kết định lƣợng tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin c{c mẫu chế phẩm đƣợc tính trung bình cộng củ lần thực nghiệm Tổng h|m lƣợng củ fl vonolign n tính theo silybin c{c chế phẩm LI, SA v| SI tính cho đơn vị viên chế phẩm thu đƣợc lần lƣợt l|: 196,5 mg; 243,0 mg; 50,4 mg BÀN LUẬN Chọn dung m i chiết mâu thư: Kết thu đươc cho thấy độ hấp thu A dịch chiết Chuyên Đề Dƣợc Nghiên cứu Y học dung m i EtOH 50% l| c o Tuy nhiên dịch chiết EtOH 96% có m|u v|ng suốt, độ hấp thu chút so vơi dịch chiết băng EtOH 50% phổ UV-Vis có đỉnh hấp thu rõ ràng, dịch chiết c{c dung m i EtOH 30%, EtOH 50% v| EtOH 70% bị đục phổ UV-Vis hình cư , kh ng có đỉnh rõ r|ng Vì vậy, EtOH 96% đươc chọn làm dung mơi chiết xuất cho quy trình định lượng Quy trình định lương tổng fl vonolign n tính theo silybin c{c mâu chê phâm đơn giản phương ph{p xư lý mẫu thư mâu phưc tạp hơn, dễ chiêt xuất hoạt chât Phương ph{p định lương kh{ đơn giản có độ x{c v| độ c o, nhiên l| phương ph{p qu ng phổ nên độ chọn lọc kh ng c o, tiến h|nh định lương băng phương ph{p qu ng phổ UV-Vis n|y phải k m vơi định tính băng phương ph{p SKLM để đảm bảo lương hoạt chất mâu thư đươc đo quang 288 nm chủ yếu l| silybin v| c{c fl vonolign n kh{c có mẫu KẾT LUẬN Đã x}y dựng đƣợc quy trình x{c định tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin hạt cúc g i v| chế phẩm Kết thẩm định quy trình cho thấy c{c quy trình có độ đặc hiệu c o, khoảng tuyến tính rộng, độ lặp lại tốt v| độ c o Áp dụng c{c quy trình đƣợc thẩm định để x{c định đƣợc tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin hạt cúc g i l| 3,8% tính dƣợc liệu kh kiệt ; c{c chế phẩm LI, SA, SI lần lƣợt l| 196,5 mg; 243,0 mg v| 50,4 mg viên chế phẩm Kết thu đƣợc c{c mẫu chế phẩm có kh{c biệt lớn so với h|m lƣợng silym rin ghi nhãn tƣơng ứng l| 140 mg; 140 mg; v| 70 mg Điều n|y cho thấy cần thiết đƣ tiêu định lƣợng tổng h|m lƣợng fl vonolign n v|o tiêu chuẩn củ c{c thực phẩm chức từ hạt Cúc g i để góp phần 247 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 kiểm so{t đƣợc chất lƣợng củ c{c thực phẩm chức n|y TÀI LIỆU THAM KHẢO Ajit KK (2011), Milk thistle (Silybum marianum): A review, pp 37 ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, Q2 (R1), pp - 13 Jane MM, Mary C, Kathi JK (2000), Milk thistle (Silybum marianum), pp - 11 248 Ramawat KG, Merillon JM (2008), Bioactive Molecules and Medicinal Plants, pp 131 - 137 Venketeshwer R (2012), Phytochemicals – A Global Perspective of Their Role in Nutrition and Health, pp 213-216, pp 261-264 Võ Văn Chi 2012 , Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất y học, Hà Nội, tr 670-671 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 Chuyên Đề Dƣợc ... thu A mẫu chuẩn thử Cơng thức tính tổng hàm lượng flavonolignan tính theo sily in g hạt Cúc gai: X= Trong đó: X – H|m lƣợng tổng flavonolignan theo silybin 100 g Cúc gai, % At – Độ hấp thu củ dung... vonolign n tính theo silybin c{c mẫu chế phẩm đƣợc tính trung bình cộng củ lần thực nghiệm Tổng h|m lƣợng củ fl vonolign n tính theo silybin c{c chế phẩm LI, SA v| SI tính cho đơn vị viên chế phẩm. .. trị Rf củ vết silybin sắc ký đồ củ mẫu chuẩn khoảng 0,3 đến 0,8 Xây dựng quy trình định lượng: Xây dựng quy trình định lượng tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin dược liệu: Khảo s{t