Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong thực phẩm chức năng và khảo sát các thông số tối ưu của quá trình xử lý mẫu, sắc ký lớp mỏng cũng như tính chọn lọc và giới hạn phát hiện của phương pháp. Mời các bạn cùng tham khảo đề tài qua bài viết này.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Nghiên cứu Y học ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỚP MỎNG ĐỊNH TÍNH GINSENOSIDE Rg1 và Rb1 TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Qch Thanh Tâm*, Phan Bích Hà*, Tân Hồng** TĨM TẮT Đặt vấn đề: Nhân sâm có tên khoa học Panax ginseng C.A.Mey, là một trong những dược liệu q đã được con người sử dụng từ rất lâu. Ginsenoside là nhóm hợp chất đặc trưng có trong nhân sâm. Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều sản phẩm được nhà sản xuất cơng bố là thực phẩm chức năng có chứa ginsenoside. Để bảo vệ lợi ích người tiêu dùng, cơng tác xét nghiệm ginsenoside nhằm xác nhận chất lượng và hiệu quả sử dụng của thực phẩm chức năng là rất cần thiết. Mục tiêu: Định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát các thơng số tối ưu của q trình xử lý mẫu, sắc ký lớp mỏng cũng như tính chọn lọc và giới hạn phát hiện của phương pháp. Kết quả: Chúng tơi đã hồn thành quy trình định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với giới hạn phát hiện cho mẫu lỏng và mẫu rắn lần lượt là 2 g/ml và 100 g/g. Ứng dụng quy trình phân tích trên, định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong 25 mẫu thực phẩm chức năng trên thị trường, tất cả các mẫu đều cho kết quả dương tính. Kết luận: Sắc ký lớp mỏng là phương pháp đơn giản, khơng đòi hỏi thiết bị đắt tiền, thích hợp cho định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong thực phẩm chức năng. Từ khóa: Ginsenoside, thực phẩm chức năng, sắc ký lớp mỏng. ABSTRACT GINSENOSIDES Rg1 AND Rb1 QUALITATIVE ANALYSIS IN FUNCTIONAL FOODS BY THIN LAYER CHROMATOGRAPHY Quach Thanh Tam, Phan Bich Ha, Tan Hoang * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 6‐ 2014: 653 ‐ 656 Background: Ginseng, Panax ginseng CAMey, one of the precious medicinal herbs, has been used as a traditional medicine in Asia for thousands of years. Ginsenosides is the specific group of compounds found in ginseng. Nowadays, there are lots of functional food with ginsenosides announced by manufacturers. Therefore, testing of ginsenosides in functional foods to confirm the quality and efficiency are also essential for health of consumers. Objectives: Application of thin layer chromatography (TLC) to ginsenosides Rg1 and Rb1 qualitative analysis in functional foods. Methods: Surveying the optimal parameters of the process sample preparation, thin layer chromatography as well as the selectivity and detection limits of the method. Result: We completed the process of ginsenosides Rg1 and Rb1 qualitative analysis in functional foods by thin layer chromatography method with detection limits for liquid samples and solid samples with 2 g/ml and 100 g/g, respectively. Using this process, ginsenosides Rg1 and Rb1 qualitative analysis in 25 samples Viện Y tế cơng cộng TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Ths. Qch Thanh Tâm * Chun Đề Y Tế Cơng Cộng Đại học Khoa học tự nhiên TP. Hồ Chí Minh ĐT: 0908371989 Email: quachthanhtam1987@yahoo.com ** 653 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 of functional food on the market, all the samples were positive. Conclusion: Thin layer chromatography is simple method, requires no expensive equipment, is suitable to ginsenosides Rg1 and Rb1 qualitative analysis in functional foods. Keywords: Ginsenosides, TLC, Functional food. ĐẶT VẤN ĐỀ (Phenomenex 8B‐S001‐HCL). Nhân sâm có tên khoa học Panax ginseng C.A.Mey, là một trong những dược liệu quý đã được con người sử dụng từ rất lâu. Ginsenoside là nhóm hợp chất đặc trưng có trong nhân sâm. Ginsenoside Rg1 và Rb1 là hai trong các hợp chất ginsenoside(1,2). ‐ Hóa chất, chất chuẩn Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều sản phẩm được nhà sản xuất cơng bố là thực phẩm chức năng có chứa ginsenoside. Để bảo vệ lợi ích người tiêu dùng, cơng tác xét nghiệm ginsenoside nhằm xác nhận chất lượng và hiệu quả sử sụng của thực phẩm chức năng là rất cần thiết. Trên cơ sở các tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành thực hiện triển khai quy trình định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Mục tiêu nghiên cứu 1. Ly trích ginsenoside Rg1 và Rb1 trong mẫu thực phẩm chức năng. 2. Định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ‐ Mẫu thử Mẫu lỏng: các sản phẩm dạng lỏng mà nhà sản xuất công bố là thực phẩm chức năng có chứa ginsenoside. Mẫu rắn: các sản phẩm dạng rắn mà nhà sản xuất cơng bố là thực phẩm chức năng có chứa ginsenoside. ‐ Dụng cụ Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck 1055540001) Ống vi quản, bình khai triển, bình lóng 50 ml, erlen cổ nhám 100 ml, chén sứ 50 ml. Bộ chiết pha rắn SPE, cột SPE C18 500mg/6ml Chuẩn ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 được cung cấp bởi Viện Kiểm Nghiệm Thuốc. Methanol (Merck 1060092500), Chloroform (Merck 1024422500), n‐butanol (Merck 1019902500), Ethyl acetate (Merck 1008642500), Ethanol (Merck 1009862500), H2SO4 95‐97% (Merck 1018332500). n‐Butanol bão hòa nước, acid sulfuric 10% trong ethanol, methanol 30%, methanol 50%. ‐ Xử lý mẫu(1,4) Dùng dung mơi để ly trích ginsenoside Rg1 và Rb1 trong mẫu rắn và mẫu lỏng. Làm sạch dịch chiết bằng kỹ thuật chiết pha rắn. ‐ Tiến hành định tính (1,4) Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để định tính ginsenoside Rg1 và Rb1. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, khơng đòi hỏi thiết bị đắt tiền, thích hợp để định tính hợp chất. ‐ Xác định các thơng số của phương pháp(3) Khảo sát tính chọn lọc: Tiến hành phân tích mẫu trắng, lặp lại 06 lần, mẫu trắng phải khơng được cho tín hiệu phân tích. Phân tích mẫu thử, lặp lại 06 lần, phải cho tín hiệu chất cần phân tích. Khảo sát giới hạn phát hiện: Phân tích mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ nhỏ khác nhau. Mỗi nồng độ phân tích lặp lại 10 lần, xác định tỷ lệ % dương tính. Giới hạn phát hiện là nồng độ nhỏ nhất cho kết quả dương tính 100%. KẾT QUẢ Xử lý mẫu Mẫu rắn Lấy 1 g mẫu, thêm 10 ml methanol, siêu âm 654 Chun Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Nghiên cứu Y học 30 phút; gạn lấy dịch chiết methanol, bốc hơi đến khơ, hòa tan cặn trong 5 ml nước cất được dung dịch chiết. Mẫu lỏng Cho 50 ml mẫu, 20 ml chloroform vào bình lóng, lắc 1 phút, loại bỏ dịch chloroform, sau đó thêm 20 ml n‐butanol bão hòa nước, lắc 1 phút; gạn lấy dịch chiết butanol, bốc hơi đến khơ, hòa tan cặn trong 5 ml nước cất được dung dịch chiết. Cho dung dịch chiết qua cột SPE 500mg/6ml Hoạt hóa cột C18 lần lượt với 5 ml methanol, 5 ml methanol 50%, 5 ml nước cất. Cho 5 ml dung dịch chiết qua cột C18. Rửa loại lần lượt với 20 ml nước cất, 10 ml methanol 30%. Rửa giải bằng 20 ml methanol, bốc hơi đến khơ, hòa tan cặn trong 0,5 ml methanol được dung dịch thử. ‐ Sắc ký lớp mỏng Dung dịch khai triển: pha hỗn hợp dung môi, n‐butanol – ethyl acetate – nước theo tỷ lệ thể tích 4 : 1 : 5, lấy lớp trên. Dung dịch chuẩn Rg1: Hòa tan chuẩn ginsenoside Rg1 trong Hình 1: Sắc ký lớp mỏng dung dịch chuẩn: Rb1 (Rf = 0,13) và Rg1 (Rf = 0,66) ‐ Tính chọn lọc 100% mẫu trắng khảo sát cho kết quả âm tính. 100% mẫu thử khảo sát cho kết quả dương tính. methanol để được dung dịch chuẩn Rg1 có nồng ‐ Giới hạn phát hiện: độ khoảng 1 mg/ml Giới hạn phát hiện của phương pháp cho mẫu lỏng và mẫu rắn lần lượt là 2 g/ml và 100 g/g. Với giới hạn phát hiện này, phương pháp trên đủ độ nhạy để định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong nhiều loại thực phẩm chức năng khác nhau. Rb1: Hòa tan chuẩn ginsenoside Rb1 trong methanol để được dung dịch chuẩn Rb1 có nồng độ khoảng 1 mg/ml. Tiến hành sắc ký lớp mỏng Chấm riêng biệt lên bản mỏng: 2 l dung dịch chuẩn Rb1, 2 l dung dịch chuẩn Rg1, 2 l dung dịch thử. Sau khi khai triển, lấy bản mỏng ra, để khơ ngồi khơng khí, phun dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol. Sấy bản mỏng ở 105oC trong vài phút, quan sát dưới ánh sáng thường. Chuyên Đề Y Tế Công Cộng - Khảo sát mẫu thị trường: Mẫu được mua ở siêu thị, hiệu thuốc. Sản phẩm được nhà sản xuất cơng bố là thực phẩm chức năng có chứa nhân sâm rất đa dạng và phong phú. Trong đó, mẫu dạng lỏng nhiều hơn mẫu dạng rắn. Chúng tơi thu thập 17 mẫu lỏng, 8 mẫu rắn. Tiến hành phân tích theo quy trình, kết quả thể hiện ở bảng 1. 655 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Bảng 1: Kết quả định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong thực phẩm chức năng MẪU CHS TT 125 mg CHS TT 250 mg CHS TT 62.5 mg HSL HS KRG NCGNS NHS NHS NST NST NUGHS FGPM KRG KRG KRG THS VN V VN W WSD YSSNCS GQS GC RGC RGJ KẾT QUẢ Ginsenoside Rg1 Ginsenoside Rb1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + năng với giới hạn phát hiện cho mẫu lỏng và mẫu rắn lần lượt là 2 g/ml và 100 g/g. Với kết quả trên, phương pháp này cho phép định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong thực phẩm chức năng trên thị trường. Ứng dụng quy trình phân tích trên, định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong 25 mẫu thực phẩm chức năng trên thị trường, tất cả các mẫu đều cho kết quả dương tính. KIẾN NGHỊ Khảo sát định tính thêm các chuẩn ginsenoside khác như Re, Rf. Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để định lượng ginsenoside. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2009). Dược điển Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. Tr. 51‐129. Kim IW, Hong HD, Choi SY, Hwang DH, Her Y, Kim SK (2011). Characterizing a full spectrum of Physico‐chemical properties of ginsenosides Rb1 and Rg1 to be proposed as standard reference materials. J. Ginseng Res. 35. 487 – 496. Trần Cao Sơn (2010). Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội. Tr. 16‐21. Trần Quang Trung,. Trịnh Văn Lẩu (2011). Nghiên cứu chiết xuất saponin tồn phần và định tính ginsenoside Rb1. Re. Rg1 trong sâm Ngọc Linh và sâm Ngọc Linh sinh khối bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao. Tạp chí y – dược học qn sự. 6. 11‐ 18. Ghi chú: ”+”: Dương tính Nhận xét: 100% sản phẩm có chỉ tiêu định tính phù hợp với cơng bố của nhà sản xuất. KẾT LUẬN Chúng tơi đã triển khai quy trình định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong thực phẩm chức Ngày nhận bài báo: 15/5/2014 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/6/2014 Ngày bài báo được đăng: 14/11/2014 656 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng ... thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Mục tiêu nghiên cứu 1. Ly trích ginsenoside Rg1 và Rb1 trong mẫu thực phẩm chức năng. 2. Định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 bằng ... mẫu rắn lần lượt là 2 g/ml và 100 g/g. Với kết quả trên, phương pháp này cho phép định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong thực phẩm chức năng trên thị trường. Ứng dụng quy trình phân tích trên, định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong 25 mẫu thực phẩm ... mẫu lỏng và mẫu rắn lần lượt là 2 g/ml và 100 g/g. Với giới hạn phát hiện này, phương pháp trên đủ độ nhạy để định tính ginsenoside Rg1 và Rb1 trong nhiều loại thực phẩm chức năng khác nhau. Rb1: